Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Bu video, parafin gömülü doku örneklerinden DNA'nın nasıl izole edileceğini gösterecektir. Bu gösterimde kullanılan örnek, üç milimetre çapında ve altı milimetre uzunluğunda bir doku örneğidir. Bu gösterimde tek bir örnek kullanılmış olsa da, çapı beş milimetreden ve uzunluğu 10 milimetreden büyük olan daha büyük örnekler veya burada kullanılan boyutta iki ila üç örnek tek bir reaksiyonda işlenebilir.

Bununla birlikte, parafinin tamamen uzaklaştırılmasını ve doku sindirimini sağlamak için protokolde ayarlamalar yapılması gerekebileceğini belirtmek önemlidir. Dokuya herhangi bir işlem uygulanmadan önce, dokuyu koruyan mumsu parafin çözülmelidir. Ksilen ve fenol toksik olduğu için bu işlem ksilen kullanılarak gerçekleştirilir. Bu kimyasallarla yapılan tüm çalışmalar bir çeker ocak altında yürütülmelidir; numunenizi içeren tüpe 800 µL ksilen ekleyin.

Ardından numuneyi, hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin. Numuneyi çöktürmek için 14.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından tüpteki ksileni uzaklaştırıp parafini çözün. Parafin tamamen çözünene kadar bu adımları iki veya üç kez tekrarlayın.

Doku ıslak ve yumuşak görünmelidir. DNA'nın nihai verimini artırmak için tüm parafinin uzaklaştırılması önemlidir. Bu nedenle, daha büyük doku örnekleri için daha fazla yıkama işlemi gereklidir.

Parafin örnekten uzaklaştırıldıktan sonra, doku sindiriminin gerçekleşebilmesi için dokunun yeniden hidrate edilmesi gerekir. Bu işlem, bir etanol rehidrasyon serisi kullanılarak gerçekleştirilir. İlk olarak, örneğe 800 µL %100 etanol ekleyin, vortekslenmesini sağlayın ve örneği 14.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın. Bu adımları önce 800 µL %70 etanol, ardından %50 etanol kullanarak tekrarlayın. Dokunun daha az katı olması ve çöktürme için daha fazla kuvvet gerektirmesi nedeniyle son santrifüj işlemi beş dakika sürmelidir.

Şimdi, DNA'yı hücrelerden serbest bırakmak için dokunun sindirilmesi gerekir. Bu işlem; SDS gibi protein denatüre edici maddeler ve doku yıkımından sorumlu olan enzim proteinaz K'den oluşan bir çözelti olan lizis tamponu kullanılarak gerçekleştirilir.

Numuneye 200 ila 500 µL lizis tamponu ekleyin. Boyuta bağlı olarak, 400 µL kullanmak için uygun bir hacimdir. Lizis tamponunun bileşenleri ve 56 °C'lik inkübasyon sıcaklığı, protein aktivitesini maksimize etmeye hizmet eder.

ACE K bir protein olduğu için, ACE K dokuyu yalnızca belirli bir süreye kadar yıkabilir; reaksiyonun devam etmesi için periyodik olarak daha fazla enzim eklenmelidir. Dokular tamamen çözünene kadar sabah ve akşam numuneye 10 mg/mL konsantrasyonda 20 µL ACE K proteini eklenir.

Artık hiç katı doku görülmediğinde, DNA'nın hücresel kalıntı tamponundan ekstrakte edilmesi gerekir. Örneği sulu ve organik fazlara ayırmak için doygun fenol kullanılır. Sulu faz DNA'yı içerir.

Tamponla doyurulmuş fenol kullanmak önemlidir; çünkü normal fenolün asitliği yalnızca DNA'nızı bozmakla kalmaz, aynı zamanda sulu ve organik fazların katmanlaşmasını da tersine çevirir. Tamponla doyurulmuş fenolün iki faz şeklinde saklandığını, fenolün alt katmanda olduğunu unutmayın.

Numuneye eşit hacimde tamponla doyurulmuş fenol ekleyin ve tüpü birkaç kez altüst edin. Ardından, faz ayrışmasını sağlamak için numuneyi santrifüje yerleştirin ve 14,000 RPM hızında beş dakika boyunca döndürün.

DNA ve RNA üstteki sulu fazda bulunurken; proteinler, lipitler ve polisakkaritler ara fazda ve alttaki organik fazda bulunur. Ara fazı bozmadan sulu tabakayı dikkatlice alın ve yeni bir tüpe aktarın. Genellikle ilk santrifüjden sonra ara faz gevşektir ve geri çekilir.

Küçük hacimlerde su kullanılarak ekstraksiyonlar yapılması gerekir. Geri ekstraksiyon protokolü, bu videoya eşlik eden metinde bulunabilir. Arayüz netleşene kadar bu adımları tekrarlayın; bu genellikle üç ila beş tekrardan sonra, DNA örneğine eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol eklenerek gerçekleştirilir.

Bu işlem, tek başına fenol ile aynı amaca hizmet eder ancak DNA verimini maksimize etmek için fazlar arası sınırı netleştirir. Fazlar arası sınır berrak ve net olana kadar bu prosedürü bir veya iki kez tekrarlayın. Örneğiniz proteinlerden arındırıldığına göre, artık kontamine olan RNA'nın uzaklaştırılması gerekir.

Bu işlem RNA'lar aracılığıyla gerçekleştirilir. Örneğe 100 µg/mL final konsantrasyonunda bir RNA degradasyon RNA A eklenir ve örnek 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edilir. RNA degrade edildikten sonra, RNAA enzimi uzaklaştırılmalıdır.

DNA temizleme prosedürü daha önce yapıldığı gibi tekrarlanır. Önce doygun tamponlu fenol kullanıp ardından fenol kloroform izoamil alkole geçildiğinde, mevcut tek kontaminasyon RNA A enzimi ve degrade olmuş RNA olduğu için daha az temizleme adımı gerekecektir. Örnek artık sadece DNA içerdiğine göre, DNA çözeltiden çöktürülmelidir; hacmin onda biri kadar sodyum asetat ve bir hacim izopropanol ekleyin.

Alternatif olarak, iki buçuk hacim etanol eklenebilir ancak bu durumda daha büyük bir tüp gerekecektir. Numuneyi -20 °C'de 30 dakika ile bir saat arasında veya gece geç saatlere kadar çalışıyorsanız gece boyunca inkübe edin. Artık DNA ile çalıştığınız için, örneğin degrade olmaması amacıyla buz üzerinde kaldığından emin olun.

Çöktürülmüş DNA'yı peletlemek için örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,000 RPM'de santrifüjleyin. Sekanslama gibi sonraki deneyleri etkileyebilecek fazla tuzları uzaklaştırmak için, peleti yerinden oynatmamaya dikkat ederek süpernatantı alın. Örneğin, 1 mL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve örneği nazikçe resüspande ederek süspansiyon haline getirin.

Numuneyi bir kez daha 4 °C'de, 14.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve kalan etanolün beş dakikaya kadar havada kurumasını bekleyin. Numunenin aşırı kurutulmaması önemlidir.

Son olarak, DNA saflaştırılır ve seçtiğiniz tampon çözeltide yeniden süspande edilmeye hazır hale gelir. Burada otoklavlanmış distile su kullanıyoruz. Evet.

DNA örneklerini daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Ekstraksiyon tamamlandıktan sonra, DNA'nızın kalitesini ve miktarını değerlendirmelisiniz. Bu işlem, NanoDrop 3000 kullanılarak spektrometri ile gerçekleştirilir; ölçüm tipini nükleik asit olarak ayarlayın, hesaplama için DNA 50'yi seçin ve cihazı 1.5 µL su ile kalibre edin.

Kaideyi temizleyin ve 1,5 µL dilüent (bu durumda distile su) kullanarak boş ölçüm yapın. Kaideyi temizleyin, 1,5 µL örnek yükleyin ve ölçüm düğmesine basın. Evet. Harika.

Bu noktada 260/280 oranının 1.8 olması idealdir. DNA'nız; dizi (array), karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, metillenmiş DNA immünopresipitasyonu ve sekanslama dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, sonraki uygulamalarda kullanılmaya hazırdır.

Hemen ihtiyaç duyulmaması durumunda, bu protokollerin bağlantıları burada gösterilmiştir. Numunelerinizi daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.