Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Bu prosedürün genel amacı, doğal bir hain enfeksiyon modeli oluşturmak ve sürdürmektir. İlk olarak farelere oral gavaj yoluyla tra curus mirrors yumurtaları ile enfeksiyon uygulanır. 21 gün sonra, enfekte hayvanlar ötanize edilir ve kan, mezenterik lenf düğümleri, fekal pelletler, kolonlar ve sekum hasat edilir.

Bu örnekler kullanılarak, tetikleyicilere karşı oluşan bağışıklık yanıtı analiz edilebilir. TRA'ya özgü antikorların tespit edilmesi için serum örnekleri ELISA ile analiz edilebilir.

Hücresel bağışıklık yanıtlarını analiz etmek için lenf düğümü hücrelerinin in vitro restimülasyonu gerçekleştirilebilir. Protein içeriğinin değerlendirilmesi için Western blot fecal pelletleri kullanılabilir ve kolonun QPCR analizi ile gen ekspresyon analizi yapılabilir. Son olarak, sekum ucu histoloji için kullanılırken, sekumun geri kalanı enfekte farelerdeki solucan yükünün belirlenmesi için kullanılabilir.

Sonuç olarak, bir farenin T. suis yumurtaları enfeksiyonuna karşı dirençli mi yoksa duyarlı mı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir ve parazite karşı geliştirilen bağışıklık yanıtı karakterize edilebilir. Bu yöntem, T yardımcı hücre aktivasyonunu hangi faktörlerin kontrol ettiği ve TH2 hücre diferansiyasyonuna hangi proteinlerin gerektiği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. T. suis yumurtaları, immün yetmezlik olan farelerde veya AKR gibi genetik olarak duyarlı suşlarda çoğaltılabilir ve enfeksiyondan 35 gün sonra ötanazi edilen farelerden yumurtalar hasat edilebilir.

Hayvanın ventral yüzeyi açığa çıkarın ve steril pens ve makas kullanarak farenin karnını etanol ile durulayın. Karın derisini kavrayın ve küçük bir insizyon yapın. Karın içeriğini açığa çıkarın, sekum ve proksimal kolonu tanımlayın ve ardından bunları çıkarın.

Organları, penisilin ve streptomisin ilaveli DMEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ardından, forseps kullanarak lumenini ve solucanları açığa çıkaracak şekilde sekum ve proksimal kolonu boylamasına kesin. Açılan organları PBS içeren bir behere yerleştirin ve dışkıları temizlemek için nazikçe çalkalayın.

Sekum yıkandıktan sonra, taze bir Petri kabına aktarın ve solkanatlı kavisli pensler kullanarak solucanları nazikçe çekip çıkarın. Her fareden elde edilen tüm solucanları, beş mililitre antibiyotik destekli DMEM içeren altılı kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Altılı kuyucuklu plakayı nemli bir kağıt havlu ile birlikte bir Tupperware kabının içine yerleştirin ve solucanların yumurtlamasına izin vermek için 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.

Bu inkübasyonun ardından, solucanları orijinal kuyucuktan çıkarmak için pens kullanın ve onları DMEM içeren iki yeni kuyucuğa paylaştırın. Solucanların bu şekilde paylaştırılması, pipet kullanılarak yumurta geri kazanımını maksimize edecektir. Orijinal kuyucukta kalan, salgılanmış antijen ve yumurtaları içeren ortamı toplayın ve 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın.

Tüpü 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, dört saatlik antijen içeren süpernatantı çıkarıp saklayın ve pellet içeren tüpü steril su ile yıkayın. Solucanların bulunduğu altı kuyucuklu plakayı tekrar 37 °C'ye yerleştirin ve ertesi sabaha kadar inkübe edin.

Solucanlar atıldıktan sonra, kuyucukların içeriğini daha önce gösterildiği gibi toplayın ve yumurtaları izole etmek için süpernatantı santrifüjleyin. Gece boyu bekletilen antijeni içeren süpernatantı saklayın ve yumurtaları su içinde yeniden süspande edin. Daha önce yapıldığı gibi, bu yumurtaları dört saatlik inkübasyondan elde edilen yumurtalarla birleştirin.

Kalan solucanları temizlemek için yumurtaları 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Ardından yumurtaları 75 santimetrekarelik bir erlene aktarın. Erleni, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve yumurtaları oda sıcaklığında altı hafta boyunca saklayın.

Bu, yumurtaların altı hafta sonra olgunlaşmasını ve embriyo geliştirmesini sağlayacaktır. Yumurtaları yıkayın, suyu boşaltın ve canlı yumurtaları sayın. Burada gösterilmektedir.

Canlı embriyolu yumurta ve canlı olmayan yumurta örneği olarak, Reese'ler Exeter konsantrasyonunu 50 per 50 microliters şeklinde bükerler. Bu noktada, yumurtalar farelere enfekte edilmeden önce dört degrees Celsius'ta saklanabilir. Yumurta içeren çözeltiyi iyice yeniden gönderdiğinizden emin olun.

İstenilen miktardaki inokülümü 14 mililitrelik kilit kapaklı bir tüpe aktarın ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Hayvan boyutuna uygun, bir mililitrelik şırıngaya takılmış uygun boyuttaki bir besleme iğnesiyle 200 mikrolitre yumurta çekin. Fareyi ensesinden kavrayın ve yumurtaları oral gavage yoluyla uygulayın.

Enfekte fareyi kafesine geri koyun ve enfeksiyonun 21 gün boyunca ilerlemesine izin verin. 21 gün sonra, enfekte farelerin kanını kalp ponksiyonu ile toplamak için heparinize edilmemiş bir şırınga kullanın. Karbondioksit ile ötanazi sonrası kan örnekleri dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir.

Serum izolasyonu ve ELISA ile tra'ya özgü IgG ve IgE'lerin analizi için. Farening abdominal kavitesini daha önce açıklandığı şekilde açığa çıkarın. Ardından, sekumu makas veya başka bir pens yardımıyla çekip çıkarmak için pens kullanın.

Mezenterik lenf düğümlerini açığa çıkarmak için ince bağırsağı sağa doğru itin. Bağırsakları kesmemeye dikkat ederek lenf düğümlerini nazikçe çıkarın ve iki mililitre besiyeri içeren 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne yerleştirin. Parazite karşı hücresel bağışıklık yanıtını analiz etmek için lenf düğümü hücreleri, daha sonra solucan kültürlerinden elde edilen dört saatlik antijen S süpernatantı ile in vitro ortamda beslenebilir.

Lenf nodları toplandıktan sonra, daha önce açıklandığı gibi forseps kullanarak sekum ve kolonu çıkarın, distal kolondaki dışkı peletlerini serbest bırakıp iki mililitrelik oksijen tüpüne yerleştirin; peletler -20 °C'de saklanabilir ve makas kullanılarak protein içeriği açısından western blot ile analiz edilebilir. Proksimal kolonun yaklaşık bir santimetresini kesin ve RNA içeren bir tüpe yerleştirin. Daha sonra 4 °C'de saklayın.

Sekum ucunu bir forsepsle tutarak uçtan yaklaşık beş milimetrelik bir parçayı kesin. Numuneyi PBS ile yıkamak için üç mililitrelik bir şırınga ve 22 gauge iğne kullanın. Ardından numuneyi %4 paraldehit içeren beş mililitrelik bir flk ve snap kapaklı tüpe aktarın.

Paraldehit ile fikse edilmiş sekum örneği dört °C'de saklanabilir ve histolojik analiz için kullanılabilir. Solucanları öldürmek için sekumun geri kalanını bir Petri kabına yerleştirin ve -20 °C'de dondurun. Solucanları daha kolay sayabilmek için sekumu çözdürün ve makas kullanarak yaklaşık 5 mL su içeren bir Petri kabına yerleştirin.

Lümeni açığa çıkarmak için sekumu kesin ve dışkıyı bir kaba toplamak için sallayın. Temiz sekumu su içeren taze bir Petri kabına yerleştirin ve intestinal epitel hücrelerini sıyırmak için kavisli düz uçlu pensler kullanın. Sekumu su içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve dokuyu küçük parçalara ayırın.

Dışkıyı, bağırsak epitel hücrelerini ve sekum dokusunu bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyiniz ve solucanları sayarak, saydıkça bunları çıkarıp taze bir kaba yerleştiriniz. Sekumdaki solucanların izolasyon öncesi ve sonrası görünümleri burada gösterildiği gibidir. Tragus aynaları enfeksiyonu takiben, black six fareleri parazitleri kontrol altında tutabilirken, KR farelerinde parazit yükü artış göstermektedir.

Benzer şekilde duyarlı A KR farelerinde, serum ELISA ile belirlendiği üzere, black six farelerine göre belirgin şekilde daha yüksek TRA spesifik IgG iki a titreleri gelişir. Bu deneyde, Western blot analizi, enfeksiyon sonrası black six farelerinin dışkısında goblet hücresi spesifik protein realm beta miktarının arttığını, ancak a KR farelerinde böyle bir artış olmadığını ortaya koymuştur. Distal sekumun histolojik analizi, dirençli TRA'lar MOUs enfekte black six farelerinde goblet hücresi hiperplazisi ve mukus üretimini gösterirken, duyarlı a KR farelerinde bu durum görülmemektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, trismus yumurtalarının nasıl çoğaltılacağı, deneysel farelerin nasıl enfekte edileceği ve duyarlı veya dirençli farelerdeki enfeksiyon analizleri için bağırsak dokularının, mezonun, enterik lenf düğümlerinin ve kanın nasıl hasat edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.