Name: Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin Trichuris muris enfeksiyon modeliyle Th2 bağışıklık ve inflamasyon mekanizmalarını farelerde incelemeyi. Bu yöntem bağırsak parazitlerine karşı koruyucu immün yanıtları anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MSH-95.368, MOP-89.773 ve MOP-106.623 - CZ) ve Kanada Yenilik Vakfı tarafından desteklenmiştir. SCM, Gastroenteroloji doktora sonrası burs CIHR / Kanada Derneği alıcı. CZ CIHR Yeni Araştırmacı.

1. Trichuris muris yumurta Çoğaltım <ol><li> (Ya da genetik olarak yatkın fareler Trichuris muris yumurta yeni toplu üretmek için, 20-30 bağışık yetmezliği olan farelere enfekte () örneğin NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) veya 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - /) örn. ağızdan sonda ile yaklaşık 300 Trichuris muris yumurta ile 6-8 hafta eski AKR / J). </li><li> CO 2 boğulma 32-35 gün sonra fareler kurban. </li><li> Fare ventral tarafında ortaya çıkarmak ve% 70 etanol ile karın ıslak. </li><li> Forseps kullanarak karın cilt kavramak ve makas kullanarak küçük bir kesi yapmak. Karın içeriğini ortaya çıkarmak için cildi kesin. </li><li> Çekum ve proksimal kalın bağırsak belirleyin ve bunları kaldırın. </li><li> Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta (DMEM) 500 U / ml penisilin ve 500 mg / ml streptomisin (P / S) içeren bir 10 cm petri çekum ve proksimal kalın bağırsak yerleştirin. Lümen ve solucanlar ortaya çıkarmak için açık çekum kesin. Fosfat beher forseps yer çekum tamponlu salin (PBS) ve dışkı çıkarmak için hafifçe sallayın. </li><li> Petri çekum dönün ve hafifçe solucanlar çekin ve 6 plaka DMEM + P / S 5 ml içeren bir iyi bir yer onları yumuşak kavisli bir forseps (Roboz RS-5047) </li><li> Tüm fareler için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 37 nem ve inkübe korumak için nemli bir kağıt havlu ° C, 4 saat için bir Tupperware kap içinde 6 plaka koyun. </li><li> 4 saat yumuşak kavisli bir forseps kullanarak solucanları kaldırmak ve 5ml DMEM içeren 6 plaka 2 yeni kuyu bölebilirsiniz sonra + P / S 15 ml şahin tüp orijinal yeri iyi ve içeriğini Hasat. 4 saat antijen (tipik protein verimi 20 fareler başına 10-20 mg PBS diyaliz, sonra hücre restimulation için kullanılabilir) ve tekrar süspansiyon olarak 3000 rpm ve kaldır ve yedek süpernatant tüp Spin yumurta içeren pelet otoklavlanmış musluk suyu. </li><li> 6 plaka ° C gecede 37 geri koyun. Çıkarın ve solucanlar atmayın. Bir şahin tüp ve 3000 rpm'de 5 dakika boyunca spin kuyuların içeriğini Hasat. Süpernatant ve rezerv gecede antijen (PBS diyaliz, tipik bir protein verimi 20 fareler başına 10-20 mg sonra Trichuris Ag spesifik antikor izotip ELISA'larla için kullanılabilir) ve tekrar süspansiyon yumurta içeren otoklavlanmış musluk suyu pelet olarak çıkarın. </li><li> 4 saat ve gece boyunca yumurta birleştirin ve 75 cm 2 balona transfer daha sonra herhangi bir artık solucanları kaldırmak için 70μm süzgeç vasıtasıyla yumurta filtre . Şişesi, 6 hafta boyunca oda sıcaklığında (RT) folyo ile kaplanmış karanlık bir yerde tutun. </li><li> Otoklavlanmış musluk suyu yumurta yıkayın ve 50 ul 50 yaşayabilir yumurtaların tekrar süspansiyon. Bunu yapmak için, 3000 rpm'de 5 dakika ~ 50ml steril musluk suyu ve tekrar süspansiyon yumurta santrifüj. Bir bardak slayt 50 ul yumurta ve yer çıkarın. 40x büyütme kullanarak 50 ul yaşayabilir embriyolu yumurta sayısını. 50 ul 50 yaşayabilir yumurtaların vermek için yumurta sulandırınız. Kopper ve Mansfield 16 tarafından yapılan çalışmada yaşayabilir yumurtaların görüntüler için bakın lütfen. </li></ol> 2. Trichuris muris yumurta (200 yumurta / fare) ile deneysel fareler Akut enfeksiyon <ol><li> Iyice tekrar süspansiyon yumurta ve farelerin sayısı tedavisi için yeterli hacmi kaldırmak X 2 (örneğin 10 fareler için 200 ul x alabilir 10 fareler x 2 = 4 yumurta ml) ve 14 ml ek bileşenini kap tüp koyun. </li><li> Karıştırmak için 14 ml ek bileşenini kap tüp ters çevirin. 1 ml şırınga uygun bir boyut besleme iğne (18 gauge 1 1 / 2 "iğneler kullanılır 25 gram ağırlığında fare) içine yumurta 200 ul getirin. Fare ve diğer elinizi kullanarak bir el ense ağızdan sonda ile yumurta yönetmek . </li><li> 21 gün bekleyin. </li></ol> 3. Deneysel hasat <ol><li> Gün 21 CO 2 kullanarak fareleri kurban. </li><li> Kalp ponksiyon farelerden alınan kan toplayın, heparinize olmayan şırınga ve 4 mağaza ° C Ertesi gün, -20 ° C'de, serum ve donma izole Serum Trichuris özel IgGs ve IgE tespiti için ELISA yöntemi ile kullanılabilir. </li><li> Fare ventral tarafında ortaya çıkarmak ve% 70 etanol ile karın ıslak. </li><li> Forseps kullanarak karın cilt kavramak ve makas kullanarak küçük bir kesi yapmak. Deri ve karın içeriğini ortaya çıkarmak için temel membran kesin. </li><li> Küçük bağırsak, çekum ve kolon tanımlayın. Forseps ile çekum alın ve karın boşluğundan dışarı doğru çekin. Forseps başka bir çift ile, mezenterik lenf düğümleri (mLNs) teşhir hakkı üzerinde ince bağırsak itin. Medya içeren 2 ml, 15 ml Falcon bağırsak ve yerine kesmek için dikkatli olmak mLNs çıkarın. İsterseniz bu ELISA ve hücre içi f sitokin analizi için 72 saat işlem ve in vitro (1 ml, 1 mcg / ml αCD3/CD28 veya 50μg/ml 4h Trichuris Ag 24 kuyucuğu 4x10 6 / ml) restimulated olabilirdüşük sitometri. </li><li> Çekum ve kolon kesin. </li><li> Forseps kullanarak, 2 ml Axygen tüp distal kolon ve yerden fekal pelet dışarı itmek. Freeze az -20 ° C. Fekal pelet molekülü-β (AHLAK-β) resistin gibi ifade western blot ile analiz edilebilir. </li><li> Çekum (~ 0.5 cm) ucu çıkarın. Dışkı forseps ile çekum ucu tutun kaldırın ve PBS bir petri 3 ml şırınga ve 22-gauge iğne ile yıkayın. Bir 5 ml Falcon ek kap tüp içinde taze% 4 paraformaldehid yerleştirin. 4 ° C saklayınız Bu parafine gömülü kesitli ve histolojik analiz için kızaklar üzerinde monte edilebilir. </li><li> RNA (~ 1 cm) proksimal kolonda bir parça kaldırın. 500 ul RNAlater 2 ml Axygen tüpe örnek koyun. 4 ° C saklayınız Bu örnekleri qPCR mRNA için analiz edilebilir. </li><li> Etiketli petri ve dondurucuda -20 ° C'de çekum geri kalanı yerleştirin. </li></ol> 4. Çekum Trichuris muris solucanlar sayımı <ol><li> Çekum ~ 5 ml su içeren bir petri dondurucu ve yerden çıkarın. </li><li> Makas kullanarak, lümen maruz çekum kesilerek açılır. </li><li> Forseps ile çekum tutun ve şiddetle dışkı çoğunluğu kaldırmak için çekum sallamak. </li><li> Su içeren ve yavaşça IECS altta yatan doku kazıyın yumuşak kavisli bir forseps kullanarak başka bir petri çekum aktarın. </li><li> Su içeren yeni bir petri çekum aktarın ve şiddetle, küçük parçalar halinde doku müthiş, kalan doku forseps ile kazımak. </li><li> Tüm petri kutularının 3 solucanlar saymak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Eğer bir solucan aynı solucan sağlamak için çanak çıkarın bulmak gibi iki kez sayılmaz. Solucanlar hasarlı ise (yani yarı yarıya kırık) doğru bir sayım almak için sadece kalın ya da ince uçları saymak. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Trichuris muris enfeksiyon modeli araştırmacılar parazit yükünü ve sistemik immün yanıtların yanı sıra, histolojik olarak incelemek için distal çekum içinde inflamatuvar yanıtı ölçmek için sağlar. Hasat çekum lümen maruz kaldığında, Trichuris solucanlar bir diseksiyon mikroskobu (Şekil 1A-B) ile numaralandırılan. Trichuris için bağışıklık parametreleri de antikor dayanıklı hayvanlar IgG1 için geçiş izotip (Th2 tip bağışıklık ile ilgili) ve duyarlı hayvanlarda IgG2a (Th1-tipi bağışıklık ile ilişkili) (Şekil 1C) içerir. Goblet hücre-spesifik protein resistin gibi molekülü-β (AHLAK-β) İfade Trichuris klerensi ile ilişkilidir ve Western blot analizi (Şekil 2) tarafından algılanamaz. Çekum distal kısmı goblet hücre yanıtları ve enfeksiyona yanıt olarak intestinal inflamasyon ölçüde (Şekil 3) değerlendirmek için periyodik asit-Schiff (PAS) ile boyandı. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Trichuris muris bağışıklık Kantitasyonu. (A) Dayanıklı (B6) fareler gün 21 sonrası enfeksiyon Trichuris muris sınırdışı. Buna karşılık, duyarlı (AKR / J) farelerde kronik parazit kurulması, Trichuris ile enfekte olma. Her çubuk, ortalama ± SEM grup başına 4-8 hayvanlar temsil eder. (B) Worms diseksiyon mikroskobu kullanılarak sayılır. Üst panel, izolasyon solucanlar gösterir, alt panel IECS ve dışkı varlığı solucanlar gösterir. (C) Trichuris özel IgG2a titreleri boşaltım Trichuris antijen (O / N Ag, 5 mg / ile kaplı plakalar üzerinde seyreltilmiş serum ELISA (1:2 seyreltme 1:20 seyreltme başlayan ve biten 1:2560) tarafından belirlenir ml). Duyarlı AKR / J farelerin dayanıklı B6 farelere göre daha Trichuris-spesifik serum IgG2a özellikle yüksek seviyeleri var. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Trichuris muris Gümrükleme goblet hücre-spesifik protein AHLAK-β 7 ifade ile ilişkilidir. AHLAK-β üretim Trichuris enfekte dayanıklı (B6) fekal pelet saptandı, ancak western blot analizi ile fareler (AKR / J) duyarlı değildir. Her şerit, (N) = Naive (Tm) = 21 gün Trichuris bulaşmış farelerin tek bir hayvan temsilcisidir. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Distal çekum aşağıdaki Trichuris enfeksiyon histolojik incelenmesi. Distal çekum 5-7 mikron bölümlerini PAS ile boyandı. Goblet hücre hiperplazisi ve mukus üretimi dayanıklı (B6) belirgindir, ancak Trichuris enfeksiyon fareler (AKR / J) duyarlı değildir .

<ol><li>Cliffe, L. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trichuris+muris+system%3A+a+paradigm+of+resistance+and+susceptibility+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection.</a> Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).</li>
<li>Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-mediated+regulation+of+chronic+intestinal+helminth+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection.</a> J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).</li>
<li>Bancroft, A. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+and+Th2+cells+and+immunity+to+intestinal+helminths%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths.</a> Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).</li>
<li>Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-13+in+resistance+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection.</a> J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).</li>
<li>Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-18+promotes+the+development+of+chronic+gastrointestinal+helminth+infection+by+downregulating+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13.</a> J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).</li>
<li>Owyang, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+25+regulates+type+2+cytokine-dependent+immunity+and+limits+chronic+inflammation+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract.</a> J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELM%CE%B2%2FFIZZ2+is+a+goblet+cell-specific+immune-effector+molecule+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).</li>
<li>Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+in+intestinal+tissue+that+are+regulated+after+infection+with+an+intestinal+nematode+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite.</a> Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).</li>
<li>Cliffe, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+intestinal+epithelial+cell+turnover%3A+a+new+mechanism+of+parasite+expulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion.</a> Science. 308, 1463-1465 (2005).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+weapons+in+the+war+on+worms%3A+identification+of+putative+mechanisms+of+immune-mediated+expulsion+of+gastrointestinal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes.</a> Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).</li>
<li>Finkelman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+regulation+of+host+defense+against+parasitic+gastrointestinal+nematodes%3A+lessons+from+studies+with+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models.</a> Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).</li>
<li>Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+helminth+infection%3A+immunopathology+and+resistance+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection.</a> Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).</li>
<li>Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intestinal+muscle+contraction+by+interleukin-9+%28IL-9%29+or+IL-9+neutralization%3A+correlation+with+worm+expulsion+in+murine+nematode+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections.</a> Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).</li>
<li>Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat6+dependent+goblet+cell+hyperplasia+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection.</a> Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).</li>
<li>Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+IL-4%2C+IL-13%2C+and+STAT6+in+inflammation-induced+hypercontractility+of+murine+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).</li>
<li>Kopper, J. J., Mansfield, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+improved+methods+for+delivery+of+Trichuris+muris+to+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse.</a> Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).</li>
<li>Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+infection+with+Trichuris+muris+significantly+affects+the+polarization+of+the+CD4+response%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response.</a> Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).</li>
</ol>

British Columbia Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Bu protokol, araştırmacı tarafından gerekli olarak modifiye edilebilir bir standart yüksek doz akut Trichuris muris enfeksiyon. Örneğin, fare kurban edilebilir ve dokuların farklı günlerde hasat. Farelerin tam solucan yükü başarıyla kurduk belirlemek için hangi noktada tüm fareler yaklaşık 200 solucanlar bir yük taşımak, 14. günde kurban edilebilir. Fareler de 32 gün için tespit edilen solucan olgunluğa erişmiş olacak ve ömrünün süresi için ev sahibi ile kalacaktı enfekte olabilir. Buna ek olarak, protokol kron...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Hayvan Besleme İğneler (18 x 1 ½ &quot;) </td><td> Çıtçıt </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> Pürüzsüz eğimli Forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg Prkdc SCID Il2r gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> Jackson Laboratuvarları </td><td> 005557 </td><td> Bunlar kullanılan fareler, ancak, herhangi bir bağışık yetmezliği olan farelere veya zorlanma duyarlı çalışması gerektiğini. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml tüpler </td><td> Axygen </td><td> MCT-200-C </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tüpler </td><td> Şahin </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 kuyucuğu </td><td> Şahin </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimi </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> α-RELMβ antikor </td><td> PeproTech Inc. </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris enfeksiyon: gut tip 2 bağışıklık ve İnflamasyon bir model

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris farelerin doğal bir patojen ve enfekte insanlar ve hayvancılık 1 Trichuris türleri biyolojik ve antijenik olarak benzer . Enfektif yumurta ağızdan sonda ile distal ince bağırsakta ambar tarafından verilen, çizgi çekum ve proksimal kolon ve olgunlaşma üzerine kript solucanlar ortamı içine 1 yumurta serbest intestinal epitel hücrelerinde (IECS) işgal. Bu model faktörleri incelemek için güçlü bir araç olduğunu kontrol CD4 + T helper (Th) hücre aktivasyonu yanı sıra bağırsak epitel değişiklikleri. C57BL / 6 ve BALB / c gibi dayanıklı kendilenmiş suşları, ortaya çıkan immün yanıt, polarize Th2 sitokinlerin (IL-4, IL-5 ve IL-13) ve ilişkili Th1 sitokinlerin iken (IL solucanlar sürülmesi ile karakterizedir -12, IL-18, IFN-γ) kronik enfeksiyonlar, genetik olarak yatkın AKR / J fareler 2-6 teşvik . Th2 sitokinleri hızlı IECS ciro, goblet hücre farklılaşması, işe alma ve epitelyal permeabilite ve düz kas kasılması, solucan sınırdışı 7-15 suçlanmıştır hangi değişiklikler dahil olmak üzere bağırsak mikroçevresinin fizyolojik değişiklikler teşvik eder. Burada detay Trichuris muris yumurta sonraki deneylerde kullanılan propaganda için bir protokol. Ayrıca enfeksiyon sonrası analizi için önerileri ile örnek bir deneysel hasat sağlar. Genel olarak, bu protokol, gastrointestinal sistem gibi IECS immün efektör fonksiyonları Th eğilimine ilişkin soruları yanıtlamak için kullanılabilecek bir Trichuris muris fare enfeksiyon modeli gerçekleştirmek için temel araçları araştırmacılar sağlayacaktır .

Trichuris muris enfeksiyon dayanıklı farelerde koruyucu bir Th2 yanıtı oluşturmak ve duyarlı fareler patolojik bir Th1 yanıtı Th2 dokunulmazlık bağırsak modelidir.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

*Trichuris muris*, farelerin doğal bir patojenidir ve insanları ile çiftlik hayvanlarını enfekte eden *Trichuris* türleri ile biyolojik ve antijenik olarak benzerlik göstermektedir1. ...

Bu prosedürün genel amacı, doğal bir hain enfeksiyon modeli oluşturmak ve sürdürmektir. İlk olarak farelere oral gavaj yoluyla tra curus mirrors yumurtaları ile enfeksiyon uygulanır. 21 gün sonra, enfekte hayvanlar ötanize edilir ve kan, mezenterik lenf düğümleri, fekal pelletler, kolonlar ve sekum hasat edilir.Bu örnekler kullanılarak, tetikleyicilere karşı oluşan bağışıklık yanıtı analiz edilebilir. TRA'ya özgü antikorların tespit edilmesi için serum örnekleri ELISA ile analiz edilebilir.Hücresel bağışıklık yanıtlarını analiz etmek için lenf düğümü hücrelerinin in vitro restimülasyonu gerçekleştirilebilir. Protein içeriğinin değerlendirilmesi için Western blot fecal pelletleri kullanılabilir ve kolonun QPCR analizi ile gen ekspresyon analizi yapılabilir. Son olarak, sekum ucu histoloji için kullanılırken, sekumun geri kalanı enfekte farelerdeki solucan yükünün belirlenmesi için kullanılabilir.Sonuç olarak, bir farenin T. suis yumurtaları enfeksiyonuna karşı dirençli mi yoksa duyarlı mı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir ve parazite karşı geliştirilen bağışıklık yanıtı karakterize edilebilir. Bu yöntem, T yardımcı hücre aktivasyonunu hangi faktörlerin kontrol ettiği ve TH2 hücre diferansiyasyonuna hangi proteinlerin gerektiği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. T. suis yumurtaları, immün yetmezlik olan farelerde veya AKR gibi genetik olarak duyarlı suşlarda çoğaltılabilir ve enfeksiyondan 35 gün sonra ötanazi edilen farelerden yumurtalar hasat edilebilir.Hayvanın ventral yüzeyi açığa çıkarın ve steril pens ve makas kullanarak farenin karnını etanol ile durulayın. Karın derisini kavrayın ve küçük bir insizyon yapın. Karın içeriğini açığa çıkarın, sekum ve proksimal kolonu tanımlayın ve ardından bunları çıkarın.Organları, penisilin ve streptomisin ilaveli DMEM içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Ardından, forseps kullanarak lumenini ve solucanları açığa çıkaracak şekilde sekum ve proksimal kolonu boylamasına kesin. Açılan organları PBS içeren bir behere yerleştirin ve dışkıları temizlemek için nazikçe çalkalayın.Sekum yıkandıktan sonra, taze bir Petri kabına aktarın ve solkanatlı kavisli pensler kullanarak solucanları nazikçe çekip çıkarın. Her fareden elde edilen tüm solucanları, beş mililitre antibiyotik destekli DMEM içeren altılı kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Altılı kuyucuklu plakayı nemli bir kağıt havlu ile birlikte bir Tupperware kabının içine yerleştirin ve solucanların yumurtlamasına izin vermek için 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.Bu inkübasyonun ardından, solucanları orijinal kuyucuktan çıkarmak için pens kullanın ve onları DMEM içeren iki yeni kuyucuğa paylaştırın. Solucanların bu şekilde paylaştırılması, pipet kullanılarak yumurta geri kazanımını maksimize edecektir. Orijinal kuyucukta kalan, salgılanmış antijen ve yumurtaları içeren ortamı toplayın ve 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın.Tüpü 3000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, dört saatlik antijen içeren süpernatantı çıkarıp saklayın ve pellet içeren tüpü steril su ile yıkayın. Solucanların bulunduğu altı kuyucuklu plakayı tekrar 37 °C'ye yerleştirin ve ertesi sabaha kadar inkübe edin.Solucanlar atıldıktan sonra, kuyucukların içeriğini daha önce gösterildiği gibi toplayın ve yumurtaları izole etmek için süpernatantı santrifüjleyin. Gece boyu bekletilen antijeni içeren süpernatantı saklayın ve yumurtaları su içinde yeniden süspande edin. Daha önce yapıldığı gibi, bu yumurtaları dört saatlik inkübasyondan elde edilen yumurtalarla birleştirin.Kalan solucanları temizlemek için yumurtaları 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Ardından yumurtaları 75 santimetrekarelik bir erlene aktarın. Erleni, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve yumurtaları oda sıcaklığında altı hafta boyunca saklayın.Bu, yumurtaların altı hafta sonra olgunlaşmasını ve embriyo geliştirmesini sağlayacaktır. Yumurtaları yıkayın, suyu boşaltın ve canlı yumurtaları sayın. Burada gösterilmektedir.Canlı embriyolu yumurta ve canlı olmayan yumurta örneği olarak, Reese'ler Exeter konsantrasyonunu 50 per 50 microliters şeklinde bükerler. Bu noktada, yumurtalar farelere enfekte edilmeden önce dört degrees Celsius'ta saklanabilir. Yumurta içeren çözeltiyi iyice yeniden gönderdiğinizden emin olun.İstenilen miktardaki inokülümü 14 mililitrelik kilit kapaklı bir tüpe aktarın ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Hayvan boyutuna uygun, bir mililitrelik şırıngaya takılmış uygun boyuttaki bir besleme iğnesiyle 200 mikrolitre yumurta çekin. Fareyi ensesinden kavrayın ve yumurtaları oral gavage yoluyla uygulayın.Enfekte fareyi kafesine geri koyun ve enfeksiyonun 21 gün boyunca ilerlemesine izin verin. 21 gün sonra, enfekte farelerin kanını kalp ponksiyonu ile toplamak için heparinize edilmemiş bir şırınga kullanın. Karbondioksit ile ötanazi sonrası kan örnekleri dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir.Serum izolasyonu ve ELISA ile tra'ya özgü IgG ve IgE'lerin analizi için. Farening abdominal kavitesini daha önce açıklandığı şekilde açığa çıkarın. Ardından, sekumu makas veya başka bir pens yardımıyla çekip çıkarmak için pens kullanın.Mezenterik lenf düğümlerini açığa çıkarmak için ince bağırsağı sağa doğru itin. Bağırsakları kesmemeye dikkat ederek lenf düğümlerini nazikçe çıkarın ve iki mililitre besiyeri içeren 15 mililitrelik bir Falcon tüpüne yerleştirin. Parazite karşı hücresel bağışıklık yanıtını analiz etmek için lenf düğümü hücreleri, daha sonra solucan kültürlerinden elde edilen dört saatlik antijen S süpernatantı ile in vitro ortamda beslenebilir.Lenf nodları toplandıktan sonra, daha önce açıklandığı gibi forseps kullanarak sekum ve kolonu çıkarın, distal kolondaki dışkı peletlerini serbest bırakıp iki mililitrelik oksijen tüpüne yerleştirin; peletler -20 °C'de saklanabilir ve makas kullanılarak protein içeriği açısından western blot ile analiz edilebilir. Proksimal kolonun yaklaşık bir santimetresini kesin ve RNA içeren bir tüpe yerleştirin. Daha sonra 4 °C'de saklayın.Sekum ucunu bir forsepsle tutarak uçtan yaklaşık beş milimetrelik bir parçayı kesin. Numuneyi PBS ile yıkamak için üç mililitrelik bir şırınga ve 22 gauge iğne kullanın. Ardından numuneyi %4 paraldehit içeren beş mililitrelik bir flk ve snap kapaklı tüpe aktarın.Paraldehit ile fikse edilmiş sekum örneği dört °C'de saklanabilir ve histolojik analiz için kullanılabilir. Solucanları öldürmek için sekumun geri kalanını bir Petri kabına yerleştirin ve -20 °C'de dondurun. Solucanları daha kolay sayabilmek için sekumu çözdürün ve makas kullanarak yaklaşık 5 mL su içeren bir Petri kabına yerleştirin.Lümeni açığa çıkarmak için sekumu kesin ve dışkıyı bir kaba toplamak için sallayın. Temiz sekumu su içeren taze bir Petri kabına yerleştirin ve intestinal epitel hücrelerini sıyırmak için kavisli düz uçlu pensler kullanın. Sekumu su içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve dokuyu küçük parçalara ayırın.Dışkıyı, bağırsak epitel hücrelerini ve sekum dokusunu bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyiniz ve solucanları sayarak, saydıkça bunları çıkarıp taze bir kaba yerleştiriniz. Sekumdaki solucanların izolasyon öncesi ve sonrası görünümleri burada gösterildiği gibidir. Tragus aynaları enfeksiyonu takiben, black six fareleri parazitleri kontrol altında tutabilirken, KR farelerinde parazit yükü artış göstermektedir.Benzer şekilde duyarlı A KR farelerinde, serum ELISA ile belirlendiği üzere, black six farelerine göre belirgin şekilde daha yüksek TRA spesifik IgG iki a titreleri gelişir. Bu deneyde, Western blot analizi, enfeksiyon sonrası black six farelerinin dışkısında goblet hücresi spesifik protein realm beta miktarının arttığını, ancak a KR farelerinde böyle bir artış olmadığını ortaya koymuştur. Distal sekumun histolojik analizi, dirençli TRA'lar MOUs enfekte black six farelerinde goblet hücresi hiperplazisi ve mukus üretimini gösterirken, duyarlı a KR farelerinde bu durum görülmemektedir.Bu videoyu izledikten sonra, trismus yumurtalarının nasıl çoğaltılacağı, deneysel farelerin nasıl enfekte edileceği ve duyarlı veya dirençli farelerdeki enfeksiyon analizleri için bağırsak dokularının, mezonun, enterik lenf düğümlerinin ve kanın nasıl hasat edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

trichuris-muris-infection-model-type-2-immunity-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Postoperatif ileus (POI) artmış morbidite ve uzamış hastanede kalış yol abdominal cerrahi bir komplikasyonudur. Profilaktik veya terapötik stratejiler yoğunlaştırılmış araştırma yokluğu nedeniyle gereklidir. Bu nedenle İÇN patofizyolojisi araştırmak ve olası tedavi seçenekleri incelemek için bir standart ve uygulanabilir fare modeli kurulmuştur.

Bağırsak Manipülasyon bir Standart Model Analizleri: Kemirgenler Barsak Motilite ve Gut Duvar İnflamasyon İşlevsel Değerlendirilmesi

Citrobacter rodentium enfeksiyonu enterik bakteriyel enfeksiyonlar çalışma yanı sıra farelerde bağışıklık yanıtları ve kolit barındırmak için değerli bir model sunar. Bu protokol bariyer bütünlüğünü, patojen yük ve murin infeksiyöz kolit patojen ve konak katkıların tam karakterizasyonu izin histolojik hasar ölçümü özetliyor.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

Hayvan modelleri kronik inflamasyon gelişimine katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmaları tanımlarken paha biçilmez araçlardır olduğu kanıtlanmıştır. Burada, lokal ve sistemik inflamasyon bölgelerinde ilerlemesini değerlendirmek için insan patojeni Porphyromonas gingivalis ve detay metodolojileri ile ağızdan enfeksiyondan bir fare modeli tarif eder.

Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Bu antijen güdümlü kolit modelinde, kırmızı bir floresan proteini eksprese eden OT-II CD4+ T hücreleri, mononükleer fagositlerde (MP'ler) yeşil bir floresan proteini eksprese eden RAG-/- farelere evlat edinilmiş olarak aktarıldı. Ev sahipleri, bir camgöbeği floresan proteinine (CFP) kaynaşmış ovalbümin proteinini (OVA) eksprese eden Escherichia coli (E.coli) ile sorgulandı.

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Burada bağırsak bariyer ihlali sonra girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit için bir protokol sunulmuştur. Lipopolysaccharide sublethal düşük dozda sistemik 24 saat sonrası enjeksiyon için izlenen fareler içine enjekte ettiler. Pro-inflamatuar sitokinlerin ifade dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste birkaç saat noktada tespit edilmiştir.

Lipopolysaccharide enjeksiyon bağırsak bariyer ihlali sonra giriş ürünlerin mikrobiyal kaynaklı taklit etmek için fareler içine

Fare distal kolostomi insan saptırma kolit, ağırlıklı olarak Lenfositik kolit dışkı akışından hariç iki nokta üst üste segmentinde için bir fare modeli sağlar.

Fare Distal kolostomi, C57BL/6 farelerde saptırma kolit roman modeli

Bu protokol, transmural inflamasyon ve fibrozis de dahil olmak üzere Crohn hastalığının önemli patolojik işaretleri benzer Salmonella tahrikli bağırsak fibrozis bir fare modeli açıklar. Bu yöntem, C57Bl/6 genetik arka planda tutulan mutant fareler kullanılarak fibrotik sonuçları değiştiren konak faktörlerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Ayrıntılı protokolümüz, insan bağırsak mukozasını 3D yapılar ve çeşitli hücre tipleri ile simüle eden, mikrobiyal kolonizasyona yanıt olarak bağışıklık tepkilerinin ve hücresel fonksiyonların derinlemesine analizini sağlayan gelişmiş çip üzerinde bağırsak modelinin oluşturulmasını ve kullanımını özetlemektedir.

Bağırsak mukozal bağışıklık tepkilerini analiz etmek için immünokompetan çip üzerinde bağırsak modeli

Öğrenin Trichuris muris enfeksiyon modeliyle Th2 bağışıklık ve inflamasyon mekanizmalarını farelerde incelemeyi. Bu yöntem bağırsak parazitlerine karşı koruyucu immün yanıtları anlamanıza yardımcı olur.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Daha fazla video keşfet