Name: Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mitofaji sürecini Mt Rosea çift emisyonlu floresan biyosensörü ve floresan mikroskopi kullanarak nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, mitokondri alımını görselleştirmek için sağlam bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Hibe DP0986937 tarafından desteklenmiştir.

Uygun kontrol maya suşları seçme Tahlil görsel maya vakuol kırmızı floresan birikimi değerlendiren deneyci dayanmaktadır. Bu testin öznel ve uygun kontrol suşları ve büyüme koşulları seçimi dayanmaktadır. Vahşi tip kontrol otofaji normalde beklenen düzeyde göstermek için kullanılır. Negatif kontrol olarak çekirdek otofaji genler (örneğin, ATG3) bir ifade için bir yük boş uygundur; bu suşları vakuol (örneğin, mitokondri, çekirdek) malzemenin teslim edemez 1. Plazmid DNA ile maya hücreleri Dönüşüm Maya hücreleri kolayca dönüşümü için yetkili LiAcetate ile tedavi yapılabilir. Ticari kitleri satın alınan (örneğin, EasyComp, Invitrogen) ve yayınlanan protokolleri mevcuttur 13 olabilir. Bu protokolde, vahşi tip suşu BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) ve türetilen silme mutant (örneğin, atg3 Δ), zorunlu olmayan farklı bir genin her eksik ifade kapsamlı bir kütüphane bazı üyeleri kullanın . Silme suşu kütüphane Rosella tabanlı sensörler kullanılarak otofaji araştırmak için değerli bir araç temsil eder. Mt-Rosella 12: Bu protokol çalışan muhabir pAS1NB tarafından kodlanan mitokondri için mt-Rosella (Şekil 2A). Aşağıdaki adımları EasyComp Dönüşüm Kiti ve rahat kullanım için -80 ° C arasında dondurulup saklanan yetkili yapılan hücrelerin kullanımı dayanmaktadır. <ol><li> Çözüm III (EasyComp Dönüşüm Kiti) 30 dakika maya hücreleri eklemeden önce oda sıcaklığına kadar dengeye. </li><li> 2-2.5 ul: muhabiri kodlayan plazmid DNA (mt-Rosella pAS1NB) (~ 100 ng / ml), 1.7 ml steril bir ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp ekleyin. </li><li> Yetkili maya hücreleri ve nazik bir pipetleme karışım taze çözülmüş süspansiyon 5 ul ekleyin. </li><li> 50 Solution III ul (EasyComp Dönüşüm Kiti) ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 1.5), 28-30 ° C'de 1 saat süreyle kuvvetli veya parmak ile el tüp Flicking tarafından her 15 dakikada bir vorteks karıştırıcı kullanılarak karıştırma dönüşüm reaksiyonları inkübe. </li><li> Dikkatli bir şekilde tek bir YMM agar büyüme metionin histidin ile takviye plakası ve urasil dönüşüm karışımı transferi ve hafifçe agar yüzeyine steril bir cam dağıtıcı ile çevresindeki hücreleri dağıtmak. Maya hücreleri bu aşamada kırılgan ve yumuşak taşıma transformants verimi artırabilir. </li><li> Büyüme plaklarının 28-30 ° C'de 2 ila 4 gün veya koloniler, yaklaşık 2-3 mm çapında görüntülenir kadar inkübe edin. </li></ol> 2. Maya hücreleri Rosella ifade Onaylanması Ayrıntılı deneyler başlamadan önce, doğru yerelleştirme ve verimli bir şekilde ifade Rosella teyit edilmelidir. <ol><li> Steril kürdan kullanarak, her bir suş 5 ayrı steril 1,7 ml ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp içinde steril su 50 ul dönüşüm plaka ve tekrar süspansiyon hücreleri tek koloniler için seçin. </li><li> 10 ayrı etiketli cam mikroskop slayt (76 x 26 mm) üzerine bir kare lamel (22 x 22 mm) ile her hücre süspansiyonu ul ve hücre süspansiyonu kapsamaz. </li><li> Hemen bir floresan mikroskop kullanılarak (örneğin, Olympus Fluoview FV500) floresans emisyon hücreleri inceler. Güçlü, yeşil ve kırmızı floresan ve mitokondriyal lokalizasyonu (Şekil 2B ve 2C) tipik etiketleme arayın. </li><li> Floresan Bu şekilde incelenen her koloninin kalan taze bir YMM büyüme plağı üzerine inoküle edilmelidir. </li><li> 2 gün boyunca 28-30 ° C'de inkübe plakaları koloni kadar çapı yaklaşık 2-3 mm. </li></ol> 3. Hücre büyümesi ve otofaji indüksiyonu Otofaji sabit faz, karbon kaynağı, rapamisinin yönetim, ya da azot açlık değişim içine giriş de dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında, bir numarasını kullanarak indüklenen olabilir. Biz rutin olarak azot açlık mitophagy ikna etmek için bir yöntem olarak kullanın. <ol><li> Büyüme orta ve uygun auxotrophic takviyeleri etanol içeren 10 ml tek bir koloni İnokülasyon. </li><li> Maya kültürleri, yaklaşık 48 saat boyunca yörünge sallayarak (200 rpm) 28-30 ° C'de inkübe edin. Hücreler orta-log büyüme aşamasında olmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj 1.7 ml steril ek kapaklı plastik santrifüj tüplerine yinelenen 1ml kültür örneklerinden Pelet hücreleri. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Hücrelerin kalan m kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda 1 ml steril distile su ile üç kere yıkayınedium. </li><li> Üçüncü yıkama büyüme orta veya azot açlık orta 100 ml hücreleri tekrar süspansiyon sonra. </li><li> 10 ml taze büyüme orta veya 10 ml azot açlık orta içine yeniden süspanse hücreleri yeniden aşılamak. Mitophagy indüksiyonu izin 6-12 saat yörünge sallayarak inkübe edin. Sonra açlık floresan mikroskobu ile görüntülemek için hücreleri hazırlarlar. </li></ol> Not: CMAC-Arg vakuol Etiketleme Testin ilk kurarken vakuol Rosella, floresan mikroskop teslim altında onaylamak için yararlıdır. Maya vakuol büyük bir organel olan konumu genellikle vakuol parçalanmış ve bulmak zor olabilir, maya bazı suşları ve bazı büyüme koşulları altında iletilen ışık görüntü, referans kolayca tespit edilebilir olmasına rağmen. Vakuol kolayca CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arjinin amid) gibi kumarin tabanlı bir vakuol boya kullanarak etiketli olabilir. Vakuol parlak mavi floresan etiketleme boya sonuçları vakuoler proteazların eylem. Mavi emisyon Rosella 11, kırmızı ve yeşil emisyon kolayca ayırt edilebilir. CMAC-Arg Etiketleme rutin olması gerekmez, ama maya vakuol konumunu ve görünümünü aşina olmayanlar için tavsiye edilir. 4. CMAC-Arg vakuol Etiketleme <ol><li> Önce görüntüleme büyüyor veya azot-starved hücrelerin CMAC-Arg (100 mM son konsantrasyon) ekleyin. CMAC-Arg çözümü önceden hazırlanmış, ancak çözüm ışığa duyarlı olduğu gibi ışığa maruz kalmaktan korunması gerekir. </li><li> 28-30 ° C'de 30 dakika süreyle (200 rpm) ile yörünge sallayarak inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Steril distile su ile hücreler üç kez yıkayın, artık orta ve aşırı CMAC Arg boya kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda. </li><li> Aşağıda anlatıldığı gibi görüntüleme için hücreler monte edin. </li></ol> 5. Konfokal lazer tarama mikroskopisi için Montaj canlı maya hücreleri (CLSM) <ol><li> 70 ° C'de inkübe büyüme orta ve azot açlık orta ayrı 1 ml alikotları 2 mg düşük erime noktası agaroz eritin Erimiş agaroz 70 korunur ° C </li><li> Yavaşça pelet oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj hücre ve her hücre kültürü 1 ml alikotları süpernatantlar atmak. </li><li> Hücreler adım 5.2 'de tabanda ve santrifüj 1 ml steril distile su ile üç kez yıkayın. </li><li> 100 ul steril distile su ile yıkanmış hücreleri tekrar </li><li> Erimiş agaroz hücreleri nokta 20 ul etiketli cam mikroskop lamı (76 x 26 mm) üzerine monte etmek için. </li><li> Hemen agaroz yatağa yıkanmış hücre süspansiyonu 10 nokta ul. </li><li> Agaroz yatak lamel (22 x 22 mm) ile kaplayın. Hücreler lamel altında agaroz yüzeyine yayılmış. </li><li> Lamel dehidrasyon ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için dikkatle oje ince bir film tabakası ile lamel kenarlarında mühür. </li><li> Oje tamamen kuru olduğunda (10 dk) slayt floresan mikroskopi sakının görüntülemek için hazırdır: oje mikroskop hedeflerine zarar verebilir. </li><li> Hücreler, bu tekniği kullanarak montaj sonrasında 1 saat kadar görülebilir monte edilebilir. </li></ol> 6. CLSM kullanarak görselleştirme otofaji Hücrelerden oluşan bir nüfus otofaji düzeyi rutin olarak önce kırmızı vakuoler floresan gösteren hücrelerin sayısını belirleyerek ve otofaji indüksiyonundan sonra değerlendirilir. İdeal otofaji ilerlemesini otofaji indüksiyon (Şekil 3) seçilen zaman noktalarında izlenir. Bu en iyi mikroskop dürbün aracılığıyla görselleştirme yapılır. Bu doğru kontroller istihdam (örneğin, Δ atg3 mutant) ve mikroskop ayarları farklı örnekleri (örneğin, nötral yoğunluk filtreleri, filtre seçimi kullanımı) gözlemleyerek arasında değişmeden kalması olduğunu önemlidir. GFP ve / veya pHluorin (yeşil floresan emisyon) (FITC filtresi) ve DsRed.T3 (kırmızı ayrı bir görünüm için uygun uyarma / emisyon filtresi ile donatılmış kaliteli bir floresan mikroskobu (örneğin, Olympus Fluoview FV500) gerektiren maya hücreleri nispeten küçük floresans emisyon) (TRITC filtre). <ol><li> Dönüşümlü FITC ve TRITC filtreleri kullanarak non-starved vahşi tip hücrelerin 60x su objektif bir bakış açısı kullanma. Vahşi tip hücrelerin mitokondri hem de kırmızı ve yeşil floresan gösteren hücrelerin çevresindeki tipik bir hücresel dağılımı göstermelidir. Mitokondri bu dağıtım pinh bağımlı olduğunu unutmayınkonfokal mikroskop ole ayarı. Biz genellikle sadece mitokondri, vakuol 12 gizlenmiş değildir hücre periferinde lokalize (Şekil 2C) nokta bir dizi olarak dikkat edilmesi gereken, 125 mm, daha düşük bir iğne deliği değer kullanın. Yüksek bir iğne deliği değeri (200 mm) ise, bu tipik ipliksi mitokondriyal ağ 11 uyulması gereken (ve uğrar değişiklikleri) hücre boyunca dağıtılan sağlar. Hücre yok diğer yapılar floresan ile işaretlenmiş olmalıdır. </li><li> Sırayla açlık orta transfer her zaman puan hücreleri görmek. Yeşil ve kırmızı emisyon filtreleri kullanarak dönüşümlü olarak gözünüzde canlandırın. 6 saat açlık süresi noktası kırmızı floresan, ancak hiçbir karşılık gelen yeşil emisyon vakuol ayırt edilebilir olmalıdır. Vakuoler yerelleştirme ayrı CMAC-Arg (Şekil 2C) kullanarak teyit edilebilir. View ~ 200 hücre ve vakuol (yani mitokondri vakuoler alımı) sadece kırmızı floresan gösteren sayısını. </li><li> &gt; 200 hücre ve sonra arsa vakuoler birikimi gösteren hücrelerin yüzde gözlemleyerek tüm zaman noktalarında vakuoler birikimi güvenin. </li><li> Mt-Rosella ifade açlıktan önce ve 6 saat açlık otofaji-negatif kontrol hücreleri inceleyin. </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları: Burada, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler ifade mt-Rosella kullanarak elde edilen sonuçlar göstermektedir. Karbon kaynağı olarak etanol ile büyüyen koşullar altında, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler hem hücresel tipik bir floresan maya hücreleri mitokondri (kırmızı ve yeşil) bir dağılım göstermesi. Kırmızı ve yeşil floresan emisyon vakuol (Şekil 2B ve 2C) tespit değildir. 6 saat ve azot açlığa maruz kaldığında (Şekil 2B; Şekil 3) sonra ötesinde, mitokondri ile ilgili kırmızı ve yeşil floresan ek, vahşi tip hücrelerin de kırmızı birikimi sergilemek, ama vakuolar lümen yeşil floresan . Ancak, Δatg3 mutant hücreler ne kırmızı ne de yeşil floresan vakuolar lümen (Şekil 3 Şekil 2C) birikir. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Top, maya hücre organelleri ve bölmeler şeması. Alt, bir maya hücresidir bir vakuol-merkezli bir bakış, farklı organelleri ve bölmeler otofajik bozulması belirten sunulmaktadır. Otofaji (örneğin, mitophagy, nucleophagy) çeşitli organel belirli türleri arasındaki bazı farklılıkları yuttu içeriğinin özgüllüğü (kargo seçim), çeşitli hücre içi ihtiyaçlarını ve ekstrasellüler ipuçları (örneğin, açlık, hasar), belirli sinyaller, ATG genler ve zaman bağımlılık. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2a"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Şekil 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Şekil 2d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2d"> Şekil 2. (A) mt-Rosella şematik gösterimi. Mitokondriyal lideri dizisi (sitrat sentaz Bu durumda) mitokondrial matriks Rosella biyosensör hedef kullanılır. Uyarma ve kırmızı floresan proteini (DsRed.T3) ve yeşil floresan protein (pHluorin) için emisyon maxima gösterilir. Yüksek pH (mitokondriyal pH ~ 8.2) biyosensör sadece kırmızı fluoresces düşük pH (vakuolar pH ~ 5.5), ancak, kırmızı ve yeşil fluoresces ifade vahşi tip ve Δ atg3 mutant hücreler beklenen sonuçlarla (B) şematik mt-Rosella (C) yabani yetişen altında tipi hücreleri ve azot açlık koşulları CLSM tarafından Gerçek sonuçlar elde edilmiştir. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), TTT (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresans ve birleştirme görüntü (D) Gerçek sonuçlar altında Datg3 mutant hücreler için floresan mikroskobu ile elde büyüyen ve azot açlık koşulları. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), RFP (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresan ve birleştirme görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3, 48 saatlik bir süre boyunca vakuol kırmızı floresan gösteren mt-Rosella ifade ve azot açlık altında yetişen vahşi türü ve Δ atg3 mutant hücreler, yüzdesi . Kırmızı floresan birikimi vakuol gösteren hücrelerin yüzde 0, 6, 12, 24 ve 48 saat azot açlık başlamadan sonra kaydedildi.

<ol><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li>
<li>Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li>
<li>Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li>
<li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+live+long+and+prosper%3A+autophagy%2C+mitochondria%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li>
<li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li>
<li>Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+yeast%3A+actors+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li>
<li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li>
<li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K%2B%2FH%2B+exchange+activity%2C+osmotic+swelling+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li>
<li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
</ol>

Şekil sunulan temsili görüntüler. 2B ve 2C açıkça organel özel floresan gazetecilere ve floresan mikroskobu kullanımı, büyüyen ve azot hasret hücreler hem de mitokondriyal yerelleştirme / dağıtım kanıt sağlar ve görüntülenebilmekte mitophagy sağlar olduğu görülebilir . Bu yöntem aşağıdaki mitophagy sınırlı olmadığını vurguladı olmaktır. Diğer hücre bileşenleri ya da organelleri (örneğin, ribozom, lipid damlacıkları, peroksizomlara, endoplazmik retikulum ve çekirdek) otofaji uygun etiketleme ile izlenebilir. Rosella biyosensör yapısı, hücre kültürü koşullarında ve çekirdeğin cirosu (nucleophagy) için tipik sonuçlar yöntemin geniş bir uygulama gösteren 11,12 bildirilmiştir. Izleme otofaji organel özel floresan gazetecilere kullanımı, yapı tasarımı bazı noktalar akılda tutulmalıdır gerektirir. Bunlar: (1) organel özel hedefleme ulaşmak için uygun bir hedef sinyal seçimi ve füzyon; uygun bir floresan protein (ler) (2) seçim (3) güçlü floresans emisyon; (4) doğru organel yerelleştirme ve / veya hücre içinde dağılımı. (3) sonra organel özel muhabiri başarıyla düşünceler haline ikinci bir grup zorlanma seçilen maya konak ifade edilmiştir: (2) hücre numune hazırlama (1) maya büyüme koşulları görüntüleme parametreleri parametreleri seçtiği önemlidir. CLSM (örneğin, lazer yoğunluğu, tarama hızı ve modu, iğne deliği değeri, zoom değeri, kullanılan hedefleri veya CCD kamera için pozlama kontrolü (büyüyen hücreleri) ve açlıktan örnekleri arasında karşılaştırmalar yapılabilir emin bir deney boyunca devam); ( 3) vakuol içine muhabir otofaji indüksiyon ve başarılı teslimat. Genel olarak, bu floresan mikroskopi yöntemi nispeten hızlı, kolay ve düzenliyor veya otofaji modüle genler için yeni ilaçlar geliştirmek veya inhibe otofaji ve yüksek verimlilik tarama için potansiyel uygulama.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Dönüşüm Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat olmadan </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Düşük erime agaroz </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop lamelleri (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Fluoview FV500 </td><td> Olympus </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Problar-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Aksi belirtilmedikçe verilen tüm konsantrasyonlarda, w / v. Maya minimal orta (YMM):% 0.67 maya azot temel amino asitler,% 2 glukoz,% 1.5 agar (yalnızca katı ortam yaparken eklendi) ve istenilen auxotrophic takviyeleri (% 0.01)] olmadan. Saccharomyces Tuzlar (SS): (NH 4) 2 S0 4,% 0.12; KH 2 PO 4,% 0,10; MgC1 2 .6 H2O,% 0.07; NaC1,% 0.05; CaCl2,% 0.01, FeC1 3, 0.0005%. Büyüme orta: SS ve% 2 etanol (v / v) ve uygun auxotrophic takviyeleri. Azot açlık orta:% 0.17 maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat (Difco),% 2 etanol (v / v) olmadan.

maya İzleme mitophagy floresan mikroskopi testi saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Otofaji bir dizi farklı koşullar altında hücresel bileşenleri ciro için önemlidir. Bu, önemli bir homeostatik fonksiyonunun yanı sıra, hedef ve seçici organelles1-4 olmak üzere hücresel malzeme düşürebilir bir kalite kontrol mekanizması hizmet vermektedir. Örneğin, hasarlı veya mitokondri gereksiz (Şekil 1), otofaji, hücresel homeostaz ve hücre sağkalım için bir tehdit temsil edebilir atılmazsa. Maya, Saccharomyces cerevisiae, besin yoksunluk (örneğin, azot açlık) ya da hasar mitophagy 5-9 olarak adlandırılan bir süreç otofaji mitokondri seçici ciro teşvik edebilir. Otofaji değerlendirmek için basit bir floresan mikroskopi yaklaşım açıklar. Netlik için yaklaşım, maya hücreleri mitophagy izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için buraya açıklamasına kısıtlamak. Tahlil, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein bağlantılı bir pH-kararlı kırmızı floresan proteini içeren bir çift emisyon biyosensör bir floresan muhabiri, Rosella, yararlanır. Bu muhabir operasyon, canlı hücrelerde vakuol (pH ~~ 5.0-5.5) ve mitokondri (pH ~ 8.2) arasında pH farklılıkları dayanmaktadır. Büyüyen koşullar altında, vahşi tip hücrelerin mitokondri bir şekilde karakteristik dağıtılan iki kırmızı ve yeşil floresan sergilerler. Floresans emisyon vakuol ile ilişkili değildir. Azot açlık, kırmızı ve yeşil floresan mitokondri etiketleme yanı sıra, mitophagy indükler bir durum tabi, hücrelerin mitokondri, vakuol teslim temsil asidik vakuoler lümen, kırmızı birikimi sergiler, ancak yeşil olmayan floresan. Kırmızı hücrelerin puanlama, ancak yeşil olmayan floresan Vakuollerin, hücrelerin 5,10-12 mitophagic aktivitesinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir .

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Otofaji, çeşitli farklı koşullar altında hücresel bileşenlerin döngüsü için önemlidir. Temel bir homeostatik işlev görmesinin yanı sıra ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, mitokondriyaların otofajisi olarak bilinen mitofaji sürecini incelemek amacıyla, mitokondriyaların vakuole alımını takip etmektir. Bu, maya hücrelerinde, mitokondriyaları kırmızı ve yeşil floresans ile işaretleyen, Mt Rosea adlı, genetik olarak kodlanmış ve mitokondri hedefli çift emisyonlu floresan pH biyosensörünün eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, otofajiyi indüklemek için maya hücreleri azot açlığına maruz bırakılır.Ardından, mitokondriyaların va içine alımını görselleştirmek için hücreleri floresan mikroskobu veya konfokal lazer tarama mikroskobu ile inceleriz. Azot bakımından fakir hücrelerin VA'larında kırmızı floresans birikimi olduğu, ancak yeşil floresans birikimi olmadığı görülür. Hücre popülasyonundaki hücrelerin otofaji skorlamasının yapılması, mitofaji derecesinin belirlenmesine olanak tanır.Mitozondrilerin maya hücrelerinin vakuolüne alımını izlemek için rosea kullanmak, mii sürecine dair mekanistik bilgiler sağlayabilir. Bu yaklaşım, çekirdek gibi diğer hücresel kompartmanların otofajisini izlemek için uyarlanabilir ve prosedür, laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı dalibor alica tarafından gösterilecektir. Bu protokolde, mitokondrilerin lokalizasyonunu görselleştirmek için aynı genetik altyapıdan türetilmiş olan yabani tip suş BY 4 7 41 ve bir delesyon mutant suşu olan delta A TG üç kullanıyoruz.Bu suşlarda, bunlar floresan bir raporlayıcı ile işaretlenmiştir. Rosea Rosea, nispeten pH kararlı bir kırmızı floresan protein ve pH duyarlı bir yeşil floresan protein içeren çift renkli emisyonlu bir biyosensördür. Rosea biyosensörünü mitokondriyal matrise yönlendirmek için mitokondriyal hedef dizi kullanılır.Bu raporlayıcı Mt.Rosea olarak adlandırılmıştır; yüksek pH'da biyosensör hem kırmızı hem de yeşil floresans verir. Ancak, düşük pH'da sadece kırmızı floresans verir. Yabani tip suş, negatif kontrol olarak normalde beklenen otofaji seviyelerini belirtmek için kullanılan bir kontroldür.Esansiyel bir otofaji geninin ekspresyonu için null olan bir suş uygundur. Bu tür bir suş mitokondrileri vakuole iletemediği için, maya suşlarını mitokondriyal hedefli rosala reporter taşıyan plazmid ile transforme etmek amacıyla standart prosedürler kullanılır; büyüme plakaları, yaklaşık iki ila üç milimetre çapında koloniler oluşana kadar 28 ila 30 °C'de iki ila dört gün inkübe edilir. Otofaji indüksiyonu için hücreleri büyütmek amacıyla, her suş için tek bir maya kolonisi, fermente edilemeyen bir karbon kaynağı içeren 10 mL büyüme ortamına inoküle edin.Bu durumda, etanol ve uygun oksitrofik takviyeler kullanılır. Her suş için ikişer kopya kültür büyütülerek toplam dört kültür elde edilir. Maya kültürlerini, orbital çalkalama ile yaklaşık 48 saat boyunca 28 ila 30 °C'de inkübe edin; bu süre sonunda kültürlerin büyümenin orta logaritmik fazında olması gerekir.İnkübasyon süresinin sonunda, her kültürden birer mililitrelik iki örneği 1,7 mililitrelik kapaklı plastik santrifüj tüplerine aktarın ve düşük hızda santrifüj ederek hücreleri nazikçe çöktürün. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini dağıtmadan her tüpteki süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve atın.Hücreleri resüspansiyon ve ardından santrifüj yoluyla bir mililitre steril distile su ile yıkayın. Kalıntı besiyerini uzaklaştırmak için yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri 100 mikrolitre büyüme besiyeri veya azot açlığı besiyerinde resüspande edin.Azot açlığı ortamı karbon kaynağı olarak etanol içerir, ancak azot takviyeleri içermez ve hücrelerde otofajiyi indükler. Ardından, resüspande edilen hücreleri 10 mililitre taze büyüme ortamına veya 10 mililitre azot açlığı ortamına yeniden inoküle edin.Otofaji indüksiyonundan sonra kültürleri altı ila 12 saat boyunca orbital çalkalamalı inkübatöre tabi tutun. Mt Rosea'nın vae'ye iletimini floresan mikroskobu altında doğrulamak faydalıdır. Vae, yedi amino dört kloro metil kumarin (kısaca L arginine mi cmac arg) gibi kumarin bazlı bir mavi floresan boya kullanılarak etiketlenmek suretiyle konumlandırılabilir.cmac ARG ile işaretleme rutin olarak yapılmasına gerek yoktur, ancak mayadaki vakuolün konumu ve görünümüne aşina olmayanlar için önerilir. Vakuol işaretleme prosedürüne başlamak için, her bir kültürden bir mililitrelik örnekleri ayrı 1,7 mililitrelik snap kapaklı plastik santrifüj tüplerine aktarın. Ardından her tüpe cmac arg ekleyin.Tüpleri 28 ila 30 °C'de, orbital çalkalayıcı ile 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, santrifüj ile hücreleri çöktürün, süpernatanı uzaklaştırın, hücreleri bir mililitre steril distile su ile süspansiyon yoluyla yıkayın ve ardından tekrar santrifüjleyin. Hücreleri steril distile su ile iki kez daha yıkayın.Bu adım, kalıntı besiyerini ve fazla cmac arg boyasını uzaklaştırır. Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri 100 µL steril distile su içerisinde yeniden süspande edin. Hücreler artık floresan mikroskopisi ile görüntüleme için monte edilmeye hazırdır.Bu protokolü uygularken, yüksek derecede floresan mitokondriyellere sahip T hücreleri elde ettiğinizden emin olmak için taze transformasyon yapılmış maya kültürleri kullanmanız oldukça önemlidir. Canlı maya hücrelerini floresan mikroskopi ile görüntüleme için hazırlamak amacıyla, öncelikle iki miligram düşük erime noktalı agarı, büyüme ortamı ve azot açlığı ortamının ayrı birer bir mililitrelik alikotları içerisinde 70 °C'de bir saat boyunca inkübe ederek eritin; erimiş agar 70 °C'de muhafaza edilir. Hücreleri sabitlemek için, etiketlenmiş 76 x 26 mm'lik bir cam lam üzerine 20 µL erimiş agar damlatın.Yıkanmış hücre süspansiyonundan 10 µL miktarını hemen aros yatağına damlatın. Aros yatağını 22 x 22 mm boyutunda bir cam lamelle kapatın. Hücreler, lamellin altındaki agros yüzeyine yayılacaktır.Ardından, lamelin kenarlarını ince bir tabaka oje ile dikkatlice mühürleyin. Bu işlem, görüntüleme sırasında lamelin hareket etmesini ve dehidrasyonu önleyecektir. Oje tamamen kuruduğunda, hücreleri monte edilmiş lamlar floresan mikroskobu ile incelenmeye hazır hale gelir. Bu teknik kullanılarak, montajdan sonraki bir saate kadar hücreler üzerinde belirgin bir olumsuz etki olmaksızın gözlem yapılabilir.Maya hücreleri nispeten küçük olduğundan, GFP emisyonu ve RFP emisyonunun ayrı ayrı görüntülenmesine uygun eksitasyon emisyon filtrelerine ve 1,2 sayısal açıklığa sahip 60 x su daldırma objektif lensine sahip yüksek kaliteli bir floresan mikroskobuna ihtiyacınız olacaktır. Yaban tip hücrelerde eksprese edilen MT Rosea kullanılarak ve konfokal lazer tarama mikroskopisi ile elde edilen tipik sonuçlar, karbon kaynağı olarak etanolün kullanıldığı açlık karşıtı koşullar altında burada gösterilmiştir; yaban tip hücreler, hem kırmızı hem de yeşil floresans gösteren maya hücrelerinin çevresinde tipik bir mitokondriyal hücresel dağılım sergilemektedir.Vakuolde kırmızı ve yeşil floresan emisyonu tespit edilmemiştir. Vahşi tip hücreleri eksprese eden MT.Rosea'lar altı saat ve daha uzun süre azot açlığına maruz kaldıklarında, mitokondrilere karşılık gelen kırmızı ve yeşil floresansın yanı sıra, vaküolde yeşil floresans olmaksızın kırmızı floresans birikimi sergilerler.Bu sinyal otofajinin göstergesidir. Mitokondrilerin otofajik alımı. Rosea lokalizasyonu, CMAC arg kullanılarak ayrıca doğrulanabilir.Buna karşılık, açlık öncesinde ve altı saat ile daha uzun süreli açlık sonrası gözlemlenen MT.Rosea eksprese eden mitofaji negatif kontrol hücrelerinde, vakuolde kırmızı floresans birikimi görülmemiştir. Yabani tip ve A TG üç mutant suşlarında otofaji düzeyini değerlendirmek için mitokondriyal markalama güçlü kalmaya devam ederken, otofaji indüksiyonu öncesinde ve otofaji indüksiyonunu takip eden seçili zaman noktalarında, suş başına 200'den fazla hücre vakuolde kırmızı floresans birikimi açısından gözlemlenmiştir. Vakuoler birikim gösteren hücrelerin oranının grafiğe dökülmesi, vakuoler alımın derecesinin yabani tip hücrelerde zamanla arttığını, ancak gelişimin ardından mitokondrileri vakuole iletemeyen delta ATG üç mutant hücrelerinde artmadığını ortaya koymaktadır. Bu teknik, otofaji alanındaki araştırmacıların, mitokondrilerin ve çekirdek gibi diğer organellerin vakuole iletimini ve bu hücrelerdeki çeşitli büyüme koşullarını keşfetmelerine zemin hazırlamıştır.

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Burada, hasarlı mitokondrinin seçici olarak uzaklaştırılması sırasında EYFP-Parkin'in zamansal alımını ölçmek için hızlandırılmış bir video mikroskobu yaklaşımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Hasarlı mitokondrinin EYFP-Parkin'e bağlı olarak uzaklaştırılmasının bu dinamik süreci, farklı deneysel koşullar altında hücresel sağlığın bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Hücresel Mitophagy için bir Marker olarak EYFP-Parkin Toplama Değerlendirme Time-Lapse video Mikroskopi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

Mitofaji'yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.

Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması

Hidrojen peroksit (H2O2) hem oksidatif hasar kaynağı hem de bir sinyal molekülüdür. Bu protokol, canlı mayada genetik olarak kodlanmış bir oransal biyosensör olan mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7) kullanılarak mitokondriyalH2O2'ninnasıl ölçüleceğini açıklar. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve kantitatif hücresel ve hücre altı analizin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mitofaji sürecini Mt Rosea çift emisyonlu floresan biyosensörü ve floresan mikroskopi kullanarak nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, mitokondri alımını görselleştirmek için sağlam bir çerçeve sunar.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Daha fazla video keşfet