Name: Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, çoklu patojen tespiti için çok yönlü PCR ve ters çizgi blot hibridizasyon yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, klinik örneklerde yüksek verimli mikrobiyal tipleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matthew O&#39;Sullivan ve Fei Zhou Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Lisansüstü Tıbbi Araştırma Bursu alıcıları.

Dikkatli göz astar ve prob tasarımı verilmelidir. GenBank olarak veritabanlarından ilgi hedefleri mevcut tüm dizileri uygun hedefler korunmuş alanları tanımlamak için kullanılmalıdır. Hedeflerin çok sayıda tek bir mPCR tayininde amplifiye olduğu yerlerde, her güçlendirilmiş dizisi benzer uzunlukta olmalı ve rekabeti önlemek için 300 baz çiftinden geçmemelidir. Yönteminin bir alternatif uygulama korunmuş bölgelere karşı primerler kullanılarak bir uzun hedef yükseltmek ve Amplikon içinde dizisi varyasyonu tanımlamak için birden fazla probları kullanmak. Bu durumda, güçlendirilmiş PCR ürününün daha uzun olabilir. Primer tavlama sıcaklıkları buna göre ayarlanır PCR koşulları ile benzer olmalıdır. Güçlü bir ikincil yapı veya astar dimer formu Astarlar kaçınılmalıdır. Sigma Aldrich DNA hesap makinesi ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) bu özellikleri güvenilir bir şekilde tahmin etmek için kullanılabilir. DNA probları ile 60 ° C Tavlama sahip olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır Özgüllüğü maksimize etmek için, tahlil, biri ters astar bağlayıcı sitesine bitişik ileri DNA iplikçik literatürde ve diğer ileri astar bağlayıcı sitesine bitişik ters iplikçik ilgi her hedef için iki probları dahil edilebilir. Bu durumda, her iki ileri ve geri primerler biotin değiştirilmesi gerekir. Amplifiye hedef başına sadece tek bir prob kullanılan ediliyorsa, o zaman sadece bir astar biotin değiştirilmiş olmak zorunda. Astar ve mPCR / RLB testi için yoklamaları tasarlarken güçlü bir in vitro sonuçlar ile korele PCR ürünleri ve prob hibridizasyon tahmin siliko yöntemleri kullanmanız önerilir . İdeal olarak bu tüm genom dizisi kullanılabilir olduğu izolat kullanılarak yapılır. FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html mevcut) gibi yazılımlar, bu amaç için kullanılabilir. Zayıf ya da hiç prob sinyali siliko analizinde, düşük prob tavlama sıcaklıklarda baz çifti uyumsuzluklarını gösterir tahmin edilebilir . DNA ekstraksiyon teknikleri test edilen numunelerin bağlı olarak değişecektir ve PCR koşulları astar tasarım bağımlı olacaktır. Okuyucular, DNA ekstraksiyonu ve PCR ve koşulları 1-19 ile ilgili daha fazla bilgi için bireysel testlerin yayınlara adlandırılır . Her test membran üzerindeki her bir prob için en az bir pozitif ve bir negatif prob sinyali yanı sıra DNA kontrolü sağlamak için uygun kontrolleri ile çalıştırılır. Ayrıca, tüm örnekler (bir mikro-organizma halinde bir tür ya da cins özel prob gibi) pozitif olması bekleniyor membran üst kısmında bir prob için faydalıdır. Bu bir pozitif kontrol probu olarak görür, ama aynı zamanda sonuçların kolay yönlendirme izin verir. 1. Membran Hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8.4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml% 16 EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml% 2xSSPE/0.1 SDS - 60 ° C'de su banyosunda </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> 60 ° C'ye kadar ön ısıtma fırın </li><li> Immunetics Miniblotter% 70 etanol ile temizleyin. </li><li> 2 pmol / ml son bir konsantrasyon ve 200 ul hacmi 0.5 M NaHCO 3 oligonükleotid problar sulandırınız. </li><li> 15x15 cm BiodyneC naylon membran kesin. 0.5 cm'lik bir kalem ve cetvel kullanarak, membran üst kısmı boyunca kapalı kural ve burada ayrıntıları yazmak. </li><li> 20 ml plastik bir torba içinde Seal membran, 10 dakika boyunca taze oda sıcaklığında% 16 EDAC çözüm ve kaya yaptı. </li><li> 30 saniye boyunca, deiyonize su ile membran yıkayın. </li><li> Membran (kalem hattına paralel) üzerinde çalışan kanallar miniblotter yerleştirin membran. Yeri ve yakın emici kağıdı destek yastık koyun. Kanallarından sıvı aspire. </li><li> 150 ul 0.5 M NaHCO 3 ile 1 ve 45 şeritli doldurun. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olmak, şerit sırayla 2-44 doldurmak için her sonda çözüm 150 ul kullanın. Bir hava kabarcığı pipet yerde tutarak, kanal görünmüyor hızla hava kabarcığı pipet üst şamandıra izin çözüm aspirat, daha sonra tekrar deneyin. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Prob çözümler aspire, membran çıkartın ve oda sıcaklığında 250 ml 0,1 M NaOH 9 dakika süreyle yıkayın. </li><li> 30 saniye boyunca 250 ml 2xSSPE membran yıkayın. </li><li> ° C 5 dakika boyunca 60 250 ml önceden ısıtılmış fırında 2xSSPE/0.1% SDS membran yıkayın. </li><li> Hemen hibridizasyon için kullanılan değilse, oda sıcaklığında 20 dakika (saklı kalan 10 ml) 240 ml 20 mM EDTA membran yıkama, daha sonra kalan 10 ml 20 mM EDTA ve stor ile plastik torba membran mühüre buzdolabında 4 ° C </li><li> Miniblotter deterjan ve fırça Pyroneg ile yıkayın. Durulayın ve kurumasını bekleyin. </li></ol> 2. Hibridizasyon ve algılama <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - su banyosu mağaza, 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - su banyosu mağaza, 60 ° C </li><li> 500 ml% 2xSSPE/0.5 SDS - 42 fırın mağaza ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - oda sıcaklığında tutmak </li><li> 500 ml% 1'lik SDS - 60 su banyosunda mağaza ° C başlangıçta (adım 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA oda sıcaklığında saklayın (3 adım için). </li></ul></li><li> 60 yaşında bir fırın açın ° C ve bir fırın 42 ° C. Bir ocak üzerinde büyük bir beher kaynatmak için su getir. </li><li> % 70 etanol ile Miniblotter Temiz Immunetics. </li><li> Küçük bir kap içine 2xSSPE/0.1% SDS kısım 10 ml. Her PCR ürünü 20 ul 150 numaralı tüpler% ul 2xSSPE/0.1 SDS ekleyin. </li><li> PCR ürünleri kaynatın 10 dakika için 100 ° C strafor sahipleri. En az 5 dakika boyunca buz üzerinde hemen yerleştirin. </li><li> 60 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS kalan membran ° C fırında 5 dakika yıkayınız. </li><li> Miniblotter desteğiyle yastık ile yerleştirin membran. Yolunuzu kadar kanal (kalem hattı dik) dikey olarak çalıştırın. </li><li> Miniblotter kanallarından Emiş aşırı sıvı. </li><li> Ilk ve son kanallar kalan 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS ekleyin. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olmak, sırayla kalan kanal (2-44) haşlanmış PCR ürünleri ekleyin. </li><li> 60 düz Yeri miniblotter hibridizasyon yer almasına izin ° C fırında 1 saat. </li><li> Her kanal aspire sıvı sonra miniblotter membran kaldırmak. </li><li> 10 dakika boyunca 60 ° C fırında prewarmed 250 ml% 2xSSPE/0.5 SDS iki kez yıkayın. </li><li> 2xSSPE/0.5% 42 SDS ile naylon ayıran örgü ıslatın ° C ve membran rulo kullanın. </li><li> Silindir tüp içine yerleştirin membran haddelenmiş, ve membran iç yüzey abuts sağlamak için alemini. 42 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS 3 ul streptavidin-peroksidaz konjuge (Roche Uygulamalı Bilimler) ° C ve silindir tüpü eklemek. Kapağı sıkıca vidalayın ve rulo fırında 42 ° C'de 60 dakika için. Rulo yönde membran sıkın olmadığı gibi olduğundan emin olun. Sızıntı olup olmadığını düzenli olarak kontrol edin. </li><li> Miniblotter su ve deterjanla Pyroneg yıkayın, durulayın ve kurumasını bekleyin. </li><li> Rulo tüpten membran çıkarın. 2xSSPE/0.5% SDS kalan 42 ° C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez 2xSSPE yıkayın. </li><li> 80 kadar fırında öncesi sıcak ° C ve yer 500ml% 1 SDS fırın. Çevirin </li><li> Makyaj 15 ml Amersham ECL algılama solüsyonu (7.5 ml çözelti A ve B çözeltisi 7.5 ml). 2xSSPE ve algılama çözümü eklemek atın. 2 dakika çözümü ile membran tam kapsama sağlamak için elle hafifçe sallayın. Kemilüminesan çözüm atın. </li><li> Pozlama kartuş uygun plastik şeffaflık iki yaprak kesin. Iki yaprak ve maruz kalma kartuş yerleştirmek arasında yer membran. </li><li> Karanlık oda için devam edin. Kırmızı ışık altında, kartuş ECL algılama filmi ekleyin ve 5 dakika boyunca maruz. Film izlerken doğru yönde izin kaldırılması üzerine Dog-kulak, sağ alt köşede. </li><li> Başına üreticinin yönergelerini gibi otomatik geliştirici ya da kimyasal banyoların film geliştirin. </li><li> Gerekirse daha uzun veya daha kısa pozlama süreleri ile pozlama tekrarlayın. </li></ol> 3. Membran rejenerasyonu <ol><li> 80 ° C'de 30 dakika boyunca iki kez 250 ml% 1'lik SDS membran yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 240 ml 20 mM EDTA membran yıkayın. </li><li> Seal plastik bir torba içinde 10 ml 20 mM EDTA ile membran ve gelecekte yeniden kullanım için 4 ° C buzdolabına. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: En iyi film yerleştirerek, baskılı bir ızgara üzerinde ya da başka görüntü tarama ve BioNumerics (Uygulamalı Matematik, Sint-Martens-Latem, Belçika) gibi yazılım içine ithal görüntülenebilir. Her prob sonucu pozitif ve negatif kontrol probları referans yorumlanması gerekir. Sonuçları en zayıf, negatif veya pozitif olarak sınıflandırılır. Olumlu sonuçlar, sinyal gibi güçlü ya da pozitif bir kontrol probu daha güçlü olduğu. Sinyal yok veya negatif kontrol (arka plan sinyal durumda) eşit olduğu olumsuz sonuçlar. Zayıf sinyal pozitif kontrol probu daha sönük, ancak negatif kontrol daha güçlü olduğu. Zayıf sonuçlar zayıf prob bağlama ya da astar dimer oluşumu non-spesifik sinyaller nedeniyle önde gelen nokta mutasyonu sonucu olabilir. Ilgi hedef başına iki problar kullanılarak, tek bir zayıf bir sonuç, güvenli bir şekilde spesifik olmayan sinyal olarak yorumlanabilir özgüllüğü artırabilir. Herhangi bir şüphe kalırsa, tek bir karmaşık PCR reaksiyonu, herhangi bir amplifikatöre jel tabanlı algılama ve sıralama ile yapılabilirsonuç gerçekten olumlu olup olmadığını belirlemek için ürün lified. Bir temsilci sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 mPCR / RLB ilkeleri (P1) Adım 1.9. Amine modifiye probları bir naylon membrana kovalent bağlıdırlar. (P2) Adım 2.10. Biotin modifiye PCR ürünleri probları melezleşmiştir. (P3) Adım 2.14. Peroxidase ile işaretlenmiş Streptavidin, membran ile inkübe ve biotin bağlanır. (P4) 2,19-2,21 Adımlar. Peroksidaz ışık, ışığa duyarlı film maruz kaldığı üreten, ECL algılama reaktifler bir reaksiyonu katalizler. Membran sonra tekrar kullanmak için yıkanır. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Temsilcisi mPCR / RLB sonucu. Örnekler 1 - 6 arasındaki pozitif kontrol temsil aralarında 43 probları her biri için en az bir pozitif prob sinyali var. Her hedef dizisi (U yoluyla), özgüllüğü en üst düzeye çıkarmak için iki farklı problar ile tespit edilmiştir. A1 ve A2 Problar her numune için olumlu ve filmin yönlendirme yardımcı bekleniyor türe özgü probları temsil eder. Probe A1 zarının alt kısmında tekrarlanır. 7 ve 8 Örnekleri negatif kontrol. Problar S1, S2, T1 ve T2, astarlar veya astar dimer ürün muhtemel nonspesifik bağlanma gösteren negatif kontroller sinyal olduğunu unutmayın. Bu problar veya primerlerin yeniden dizayn gerekli olacaktır. Problar C1, D1 ve streptavidin-peroksidaz konjuge veya kemilüminesan substrat bazı non-spesifik alımı nedeniyle olasılıkla zarından şeritli F1 göstermek, ancak bu gerçek pozitif prob sinyalleri kolayca ayırt edilir. Problar D1 ve D2 diğer problar göre nispeten zayıf bir sinyal var, bu daha az verimli amplifikasyon önde gelen büyük amplikonlarının nedeniyle olabilir. Probe J2 negatif prob J1 olumlu birkaç örnek (1, 3, 4, 6, 39). Bu büyük olasılıkla, bu örnekler için J2 bağlayıcı sitesinde bir mutasyon temsil eder.

<ol><li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li>
<li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li>
<li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li>
<li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li>
<li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%2C+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li>
<li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li>
<li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li>
<li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li>
<li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+%28mPCR%2FRLB%29+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+%28mPCR%2FRLB%29+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MPCR / RLB yöntemi PCR amplikonlarının çok sayıda eş zamanlı algılama izin verir. Çünkü, kemilüminesan prob-bazlı saptama yüksek hassasiyet, çok sayıda primer çiftleri ile tek bir multipleks PCR reaksiyonu DNA örneğinin yükseltmek için kullanılabilir. Prob sinyalleri kalan PCR ürünü ile jel elektroforezi gerçekleştirirken, bir veya daha fazla numune ile elde edilen PCR veya prob hibridizasyon sorunu olup olmadığını ayırt yardımcı olabilir. Membran tüm prob sinyalleri zayıf veya yok, ama jel elektroforezi başarılı PCR gösterir, olasılıklar membran etiketleme ile ilgili sorunlar, bir önceki kullanımdan sonra membran yanlış rejenerasyon, hibridizasyon veya streptavidin inkübasyon sırasında yanlış sıcaklıklarda, ya da kusurlu streptavidin peroksidaz konjuge veya algılama reaktif. Kontrol örnekleri, bireysel probları yanlış negatif sinyaller, jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama ile tek PCR PCR ürün amplifikasyon doğrulamak ve prob bağlama yerinde dizisi varyasyon bakmak için yapılabilir üreten olabileceğini göstermektedir. Zayıf ya da hiç prob sinyali geniş Amplikon boyutuna bağlı olabilir: Mümkünse tüm amplikonlarının benzer uzunluğu ve 300 bp den az olmalıdır. Amplikonlarının İkincil DNA yapılarını da kötü prob bağlama üretebilir ve astar yeniden tasarlamak gerekebilir. Bireysel primer veya prob konsantrasyonları da sinyal gücünü optimize etmek için farklı olabilir. Nonamplified astarlar veya primer-dimer ürün bağlayıcı prob nedeniyle yanlış pozitif sinyaller tek PCR jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama yaparak incelenmiştir. Bu durum oluşursa, gerekli olabilecek problar yeniden tasarımı. Prob bağlanma yerleri nokta mutasyonlarının, zayıf ya da hiç sinyal yol açabilir. Amplifiye her ürün için iki probları tespit etmek bu kadar kolay hale getirir. Bu özellik dikkatli astar ve prob tasarımı ile küçük hedef DNA dizisi değişimleri tespit etmek için yararlanılabilir. Ürün algılama aşağıdaki multipleks PCR reaksiyonları pek çok yöntem varken Özetle, mPCR / RLB düşük kurulum maliyeti ile yüksek verimli ve ucuz olma avantajına sahiptir. Yöntemi esneklik, geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılmasına izin verir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 5 &#39;amin C6 değiştirilmiş oligonükleotid problar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0.5 M çözüm pH 8.4 kadar yapılan </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0.1M çözümü </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampon </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> % 10 stok solüsyonu Makyaj, otoklav, 1 hafta kullanmadan önce maksimum tutulmalıdır </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Makyaj, pH 8.0 ve otoklav ayarlanabilir 0.5 M çözüm </td></tr><tr><td> N-(3-Gaz sistemlerinde)-N &#39;ethylcarbodiimide hidroklorür (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> 3.2 g EDAC ve 18 ml Millipore su ile kullanımdan hemen önce 20 ml% 16 çözüm Makyaj </td></tr><tr><td> BiodyneC 0.45 mikron naylon Membran 20x20 cm </td><td> PALL yaşam bilimleri </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deiyonize, arıtılmış su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıvı Pyroneg deterjan </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-peroksidaz konjuge </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL algılama reaktifleri </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL algılama reaktifleri </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Tepegöz Şeffaflık film </td><td> Kurumsal Express </td><td> EXP 504 Tepegöz </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hyperfilm ECL yüksek performans kemilüminesan film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Buz </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sarf mPCR / RLB tayininde kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Fırınlar (2) yuvarlanan şişe ve naylon ayıran örgü </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Yöntem 42 çözümler korumak için mümkün olduğu sürece tek bir fırın ile yapılabilir ° C ve 60 ° C önceden </td></tr><tr><td> Belly Dancer sallanan platformu </td><td> Stovall hayat Bilim </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Emme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot plate </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pozlama kartuş </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray film geliştirici </td><td></td><td></td><td> Karanlık bir odada yerine otomatik tepsileri geliştirici, sorun çözücü ve su kullanabilir miyimgeliştirici. Lumino-görüntüleyici ayrıca Xray film yerine kullanılıyor olabilir </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ekipman mPCR / RLB testi için gereklidir.

multiplex pcr ve reverse line blot hibridizasyon testi (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR / Reverse Line Blot Hibridizasyon tahlil yeniden kullanılabilir bir naylon membran, prob hibridizasyon bir multipleks PCR reaksiyonu kullanılarak 43 örneklerinde 43 moleküler hedeflere kadar algılanmasını sağlar. Problar 5 &#39;amin membran fiksasyonu sağlayacak şekilde değiştirilmiştir. Astarlar streptavidin-peroksidaz ve ışığa filmi üzerinden bir kemilüminesan substrat kullanarak melezleşmiş PCR ürünlerinin algılanmasını sağlar 5 &#39;biotin değiştirilmiş. Düşük kurulum ve tüketim giderleri ile bu tekniği ucuz (yaklaşık US $ 2 örnek), yüksek verimlilik (aynı anda birden fazla membranlar işlenebilir) ve kısa bir geri dönüş süresi (yaklaşık 10 saat) sahiptir. Bu teknik, bir kaç yolu kullanılabilir. Çoklu problar, tek bir amplifiye ürün içinde sıra varyasyonu tespit etmek için tasarlanmış olabilir, ya da sonraki tespiti için kullanılan bir (veya daha fazla) probları ile aynı anda birden fazla ürün yükseltilecek. Her iki yaklaşım da bir arada tek bir tahlil içinde de kullanılabilir. , Tek bir hedef sırası için birden fazla probları içerecek şekilde tahlil yeteneği son derece özel kılar. Yayınlandı mPCR / RLB uygulamaları metisiline dirençli Staphylococcus aureus 3-5 ve Salmonella sp 6, moleküler, Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 ve enterovirüslerin 10,11, kimlik serotipleme yazmaya, antibiyotik direnç genleri 1,2 tespit Mycobacterium sp 12, 13-15 genital ve solunum yolu 16 ve diğer 17 patojenler ve algılama ve mollicutes 18 tanımlama tespit. Ancak, tekniğin çok yönlülük uygulamaların neredeyse sınırsız ve mikro-organizmaların moleküler analizi ile sınırlı değildir anlamına gelir. MPCR / RLB beş adım a) Primer ve Prob tasarım, b) DNA ekstraksiyonu ve PCR c) membran hazırlanması, d) Hibridizasyon ve algılama, e) Membran Rejenerasyon.

43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Ters Hat Blot Hibritleme analizi, tek bir multiplex PCR reaksiyonu kullanarak 43 örnekte 43'e kadar moleküler hedefin tespit edilmesine olanak tanır...

Bu prosedürün genel amacı, daha önce bir multipleks PCR reaksiyonunda amplifiye edilmiş bir dizi spesifik nükleik asit dizisinin varlığını veya yokluğunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle aminle işaretlenmiş DNA problarının yeniden kullanılabilir bir naylon membrana sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, biyotinle işaretlenmiş PCR ürünleri membranla bağlı problarla hibridize edilir ve peroksidaz içeren strep TTR uygulanır.Bağlı PCR ürünlerine konjugat eklenir. Ardından, kemilüminesans saptama reaktifleri eklenerek ve membran yüksek hassasiyetli x-ray filme maruz bırakılarak bağlı PCR ürünleri saptanır. Son olarak, hibridize olmuş PCR ürünlerini uzaklaştırmak için membran yıkanır ve böylece gelecekteki analizlerde yeniden kullanıma uygun hale getirilir.Sonuç olarak, röntgen filmi üzerindeki membrana bağlı problarla PCR ürünlerinin hibridizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, jel elektroforezli multipleks PCR, gerçek zamanlı PCR veya mikroarray gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; yüksek kapasiteli olması, nispeten hızlı olması, herhangi bir özel ekipman gerektirmemesi ve en önemlisi düşük maliyetli olmasıdır. Başlamadan önce, bu protokolün yazılı bölümüne göre aşağıdaki çözeltileri hazırlayın.Membranı hazırlamak için fırını 60 °C'ye önceden ısıtın. Mini blotter'ı %70 etanol ile temizleyin, oligonükleotit problarını 0,5 molar sodyum bikarbonat ile mikrolitre başına iki pikomol nihai konsantrasyona ve 200 µL hacme gelecek şekilde seyreltin. Naylon membranı 15 x 15 cm boyutlarında kesin; bir kurşun kalem ve cetvel kullanarak membranın üst kısmında 0,5 cm'lik bir boşluk işaretleyin ve deneyin detaylarını buraya yazın.Membranı, 20 mililitre taze hazırlanmış %16'lık EDAC çözeltisi ile birlikte plastik bir torbaya yerleştirip ağzını kapatın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sallandırın. Membranı deiyonize su ile 30 saniye boyunca yıkayın. Ardından, membranı, membran boyunca uzanan kanalları olan bir mini blotter'a yerleştirin.Ardından destek minderini yerleştirin ve blot cihazını kapatın. Kanallardaki tüm sıvıları tamamen aspire edin. 1. ve 45. kuyucukları 150 µL 0,5 M sodyum bikarbonat ile doldurun.Hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek, iki ila 44 arasındaki kuyucukları sırasıyla doldurmak için her bir prob çözeltisinden 150 µL kullanın. Kanalda bir hava kabarcığı oluşursa, pipeti yerinde tutarak çözeltiyi hızla aspire edin; böylece hava kabarcığının pipet ucunun üst kısmına çıkmasını sağlayın ve ardından işlemi tekrarlayın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Prob çözeltilerini aspire edin. Membranı çıkarın ve oda sıcaklığında, 250 mililitre 0,1 molar sodyum hidroksit içerisinde dokuz dakika boyunca yıkayın. Membranı 250 mililitre 2x SSPE içerisinde 30 saniye boyunca yıkayın.Ardından, hemen hibridizasyon için kullanılmayacaksa, membranı 60 °C'deki fırında, önceden ısıtılmış 250 mL %0,1 SDS içeren SSPE içinde beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Membranı oda sıcaklığında 20 mM EDTA içeren 240 mL çözelti ile 20 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra membranı, geri kalan 10 mL 20 mM EDTA ile birlikte bir plastik torbaya koyun ve 4 °C'de saklayın.Son olarak, mini blosser'ı pyro neck deterjanı ve bir fırça ile yıkayın, ardından durulayın ve çoklu olarak kurumaya bırakın. İlgi duyulan hedeflerin PCR amplifikasyonu bu gösterimde açıklanmamıştır, ancak prob hibridizasyonundan önce gerçekleştirilmelidir. Hibridizasyon prosedürüne başlamadan önce, bu protokolün yazılı kısmına uygun olarak aşağıdaki çözeltileri hazırlayın.Bir fırını açıp 60 °C'ye, başka bir fırını ise 42 °C'ye ayarlayın. Isıtıcı tabla üzerindeki büyük bir beherde suyu kaynama noktasına getirin. Mini blotter'ı %70 etanol ile temizleyin.Sıradaki adımda, küçük bir kaba 10 mililitre 2x SSPE 0.1%SDS alıkotlayın. Ardından, numaralandırılmış tüplerdeki 150 mikrolitre 2x SSPE 0.1%SDS içerisine her bir PCR ürününden 20 mikrolitre ekleyin. PCR ürünlerini 100 °C'de 10 dakika boyunca kaynatın ve strafor tutucular kullanarak hemen en az beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin.Membranı, 60 °C'deki fırında, geri kalan 240 mililitre iki kat SSPE %0,1 SDS çözeltisi ile beş dakika boyunca yıkayın. Membranı, destek pediyle birlikte mini blotter'a yerleştirin. Kanalların dikey yönde olacak şekilde konumlandırın.Mini blotter kanallarındaki fazla sıvıyı vakumla çekin. Kalan 150 µL iki katlı SSPE %0,1 SDS'yi birinci ve son kanallara ekleyin. Kaynatılmış PCR ürünlerini, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, 2 ile 44 arasındaki kanallara sırayla ekleyin.Hibridizasyonun gerçekleşmesi için mini blotteri 60 °C'lik fırına bir saat boyunca düz bir şekilde yerleştirin. Her kanaldaki sıvıyı püskürtün. Ardından membranı mini blotterdan çıkarın.60 °C'lik fırında 10 dakika boyunca, önceden ısıtılmış 250 mL 2x SSPE, %0,5 SDS ile iki kez yıkandı. Naylon desteği 42 °C'deki 2x SSPE %0,5 SDS ile nemlendirin ve membranı rulo yapmak için kullanın. Rulo haline getirilmiş membranı bir rulo tüpüne yerleştirin ve membranın iç yüzeye tam olarak yaslandığından emin olmak için sıkıştırın.42 °C'de, 15 mL iki katı SSPE (%0,5 SDS) içerisine üç µL peroksidaz konjuge strept AD ekleyin ve tüpe ilave edin. Kapağı sıkıca kapatın ve döner fırında 42 °C'de 60 dakika inkübe edin. Dönüş yönünün membranın gerilmeyeceği şekilde olduğundan emin olun.Sızıntılar için periyodik olarak kontrol edin. Mini blotter'ı pyro neck deterjanı ile yıkayın, suyla durulayın ve kurumaya bırakın. Membranı rulo tüpten çıkarın ve kalan son iki kez SSPE 0.5%SDS içerisinde 42 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.Ardından, oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez SSPE ile yıkayın. Her iki fırını da 80 °C'ye ısıtın ve ön ısıtma için bir fırına 500 milliliters 1% SDS yerleştirin. ECL solüsyonunu hazırlayın ve membranı iki dakika boyunca ECL tespit solüsyonu içinde inkübe edin.Ardından membranı filme maruz bırakın ve geliştirin. Membranı yeniden aktive etmek için gerekliyse pozlama işlemini daha uzun veya daha kısa sürelerle tekrarlayın. Membranı 80 °C'de 30 dakika boyunca 250 mililitre %1 SDS ile iki kez yıkayın.Ardından, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 240 mililitre 20 milimolar EDTA ile yıkayın. Membranı, 10 mililitre 20 milimolar EDTA içeren plastik bir poşetle kapatın ve gelecekte yeniden kullanmak üzere dört santigrat derece sıcaklıktaki buzdolabında saklayın. Bu şekil, bir multipleks PCR ters hat blot hibridizasyon testi sonuçlarını göstermektedir. Bir ile altı arasındaki örnekler, bunlar arasındaki pozitif kontrolleri temsil eder.43 probun her biri için en az bir pozitif prob sinyali mevcuttur. Özgüllüğü maksimize etmek amacıyla, A'dan U'ya kadar her bir hedef dizi iki farklı prob ile tespit edilir. Bir ve iki, her örnek için pozitif olması beklenen ve film probunun yönlendirilmesine yardımcı olan türe özgü probları temsil eder.Membranın altında bir numune tekrarlanmıştır. Yedi ve sekiz numaralı örnekler negatif kontrollerdir. Q1, Q2, T bir ve T iki problarının negatif kontrollerde sinyal verdiğine, bunun da muhtemelen primerlerin spesifik olmayan bağlanmasına veya primer dimerine işaret ettiğine dikkat edin.Bu probların veya primerlerin ürün tasarımı yeniden gözden geçirilmelidir; C1, D1 ve F1 probları, muhtemelen streptavidin peroksidaz konjugatının veya kemilüminesans substratın spesifik olmayan alımı nedeniyle membran boyunca çizgilenmeler göstermektedir. Bununla birlikte, bu durum gerçek pozitif problardan kolayca ayırt edilebilmektedir. D1 ve D2 problarının sinyalleri, diğer problarla karşılaştırıldığında nispeten zayıftır.Bu durum, daha büyük amplikonların daha az verimli amplifikasyona yol açmasından kaynaklanabilir. Son olarak, prob J bir'in pozitif olduğu birkaç örnekte prob J iki negatiftir. Bu durum, büyük olasılıkla bu örneklerdeki J iki bağlanma bölgesinde bir mutasyonu temsil etmektedir.DNA ekstraksiyonundan PCR Pro hibridizasyonuna kadar olan bu teknikte uzmanlaşıldığında; sonuçların yorumlanması ve membranın rejenerasyonu dahil tüm işlemler 10 saatten kısa sürede tamamlanabilir.

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Metisiline dirençli Staphylococcus aureus için Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) tip I-V'nin hızlı taraması ve tiplendirilmesi için basit bir multipleks PCR testi gösteriyoruz ve bu testi bireysel laboratuvarlara uyarlamak için başarılı kılan bazı hayati adımları ve prosedürel nüansları sağlıyoruz.

Metisiline diren

Doğrusal amplifikasyon aracılı (LAM)-PCR genomu içinde entegre viral vektörlerin tam konumlarını belirlemek için geliştirilen bir yöntemdir. Teknik gen tedavisi hastaların, vb roman vektör teknolojileri, T-hücresi çeşitlilik, kanser kök hücre modelleri, biyogüvenlik klonal dinamiklerini incelemek için üstün bir yöntem olarak gelişmiştir...

Doğrusal Amplifikasyon Dolayımlı PCR - Bilinmeyen Yollardan DNA Genetik Elemanları ve Karakterizasyonu lokalizasyonu

Genetik raportör testi, DNA dizileri ve gen düzenleyici aktiviteleri arasındaki ilişkiyi incelemek için iyi kurulmuş ve güçlü bir araçtır. Aday düzenleyici elemanların, tanımlayıcı dizi etiketlerini taşıyan raportör genlere bağlanması, bu tahlillerin büyük ölçüde paralelleştirilmesini sağlar.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Öğrenin, çoklu patojen tespiti için çok yönlü PCR ve ters çizgi blot hibridizasyon yöntemini. Bu maliyet etkin teknik, klinik örneklerde yüksek verimli mikrobiyal tipleme sağlar.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Daha fazla video keşfet