İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, dendritik hücreleri Q nokta nano kristalleri kullanarak görüntüleme çalışmaları için hazırlamaktır. Bu, önce kemik iliği hücrelerinin murn, femur ve tibialardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, GM BOS varlığında dendritik hücrelere hücre farklılaşmasını kolaylaştırmak için kemik iliği hücre kültürleri kurulur.

Daha sonra dendritik hücreler, sekiz gün sonra kemik iliği hücre kültürlerinden geri kazanılır. İşlemin son adımı, hücreleri floresan Q nano kristalleri ile boyamaktır. Sonuçta, parlak lekeli dendritik hücreler floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.

GFP etiketli dendritik hücrelerin kullanılması gibi diğer yöntemlere kıyasla bu teknolojiyi kullanmanın temel avantajı, Q nokta nano kristallerinin aseton gibi organik çözücülerle boyandıktan sonra bile floresanlarını korumasıdır. Bu yöntem, dendritik hücre biyologlarında, bu hücrelerin farklı hastalıklarda veya farklı hastalıklar bağlamında göç özellikleri gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Boyama prosedürünü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Maria Ali olacak.

Kurban edildikten sonra, kemik uçlarını kesmeden iki fareden tibia ve femurları dikkatlice inceleyin. Ardından, bağlı tüm dokuları kemiklerden temizlemek için kağıt mendil kullanın ve onları kırmamaya dikkat edin. Biyogüvenlik davlumbazında.

35 milimetrelik bir Petri kabını% 70 etanol ile doldurun ve ardından kemikleri 10 dakika boyunca etanole batırın. Kemikler sterilize edildikten sonra, onları etanolden geri kazanın ve yeni bir Petri kabında beş dakika kurumaya bırakın. Şimdi, uyluk kemiğini ortadan ve kaval kemiğini en ince uçlarından kesin.

Steril bir şırınga kullanarak kemiklerin iç kısımlarını bir mililitre RPMI ortamı ile infüze edin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve sallanan bir kova rotorlu bir santrifüjde dört santigrat derecede 300 kez G'de 10 dakikalık bir santrifüjleme ile RPMI ortamı ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri iki mililitre CK lizizinde tekrar askıya alın, tamponlayın ve kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, 13 mililitre RPMI artı% 10 FBS ekleyin ve hücreleri bu ortamda daha önce olduğu gibi aynı santrifüj ayarlarıyla iki kez daha yıkayın. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu mililitre başına 10 ila beşinci hücrelere iki kez ayarlayın. RPMI artı% 10 FBS ile, mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona rekombinant murin G-M-C-S-F ekleyin.

Daha sonra bu süspansiyonun 10 mililitresini steril mikrobiyolojik kalitede 10 santimetre Petri kabına ve kültürüne ekleyin. Bir karbondioksit inkübatöründe hücre süspansiyonu. Üç gün sonra, hazırlanan plakaların her birine mililitre rekombinant murin G-M-C-S-F başına 20 nanogram içeren 10 mililitre RPMI ve% 10 FBS ekleyin.

Üç gün daha sonra, her bir Petri kabından 10 mililitre hücre süspansiyonunu geri kazanın, hücreleri aynı koşullar altında santrifüjleyin ve peleti Petri kaplarından geri kazanıldığı gibi aynı hacimde RPMI artı% 10 FBS'de yeniden süspanse edin ve yeni rekombinant murin G-M-C-S-F ile doldurun. Son olarak, hücre süspansiyonunu her bir orijinal Petri kabına geri koyun ve hücreleri karbondioksit inkübatöründe iki gün daha kültürleyin. Kültürde sekiz gün geçirdikten sonra, Petri kaplarını taze ortamla yıkayarak yüzen ve gevşek bir şekilde yapışan hücreleri geri kazanın.

Daha sonra toplanan hücreleri, 10 nano molar konsantrasyonda Q nano kristalleri ile murin kemik iliğinden türetilmiş dcs'nin beş, 10 ila altıda birini etiketlemek için üreticinin talimatlarına sıkı sıkıya bağlı kalarak Q tracker 6 55 hücre etiketleme kiti ile etiketleyin. İlk olarak, kit bileşenleri A ve B'nin her birinden beş mikrolitreyi bir einor tüpünde karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından bir mililitre RPMI artı %10 FBS ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca girdap haline getirin.

Ardından, beşinciye beş çarpı 10 ekleyin. Dcs, 0.5 mililitre RPMI ve% 10 FBS'de einor tüpüne süspanse edilir ve hücreleri D çözeltisinde 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe eder. Daha sonra hücreleri daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında RPMI artı% 10 FBS'de iki kez yıkayın ve peleti RPMI'de yeniden süspanse edin.

Bu şekil, dcs'nin floresan mikro fotoğrafının bir örneğini göstermektedir. Etiketlemeden hemen sonra, bir cam slayt üzerine bir damla etiketli hücre bırakıldı ve bir kapak fişi ile kapatıldı. Daha sonra örnekler floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.

Bu şekilde, 48 saat sonra dcs'nin floresan bir mikro fotoğrafı, in vitro olarak maturasyon etiketli olarak görülebilir. Dcs, bir karbondioksit inkübatöründe slayt kültür odalarında mililitrede 100 nanogram, LPS ve mililitrede 20 nanogram, TNF alfa ile 48 saat boyunca kültürlendi. Daha sonra numuneler PBS ile yıkandı, aseton ile sabitlendi, DPI ile karşı boyandı ve floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.

İn vitro olgunlaştırılan etiketli dc'ler akış sitometrisi ile analiz edildi, nokta lekeli hücreler FL'de güçlü bir sinyal verir, üç Kanal Q lekeli ve lekesiz yapar. Dc'ler ayrıca olgunlaşma belirteçleri olan CD 86 ve CD 40'a karşı spesifik antikorlarla boyandı ve izotip kontrol hücreleri daha sonra akış sitometrisi ile analiz edildi. Ek olarak, olgun Q boyası DCS ve kontrollerin süpernatanlarında IL altı ve nitrik oksit seviyeleri belirlendi.

Burada, diseke edilmiş bir dokuda etiketli DCS'nin temsili bir figürü etiketli olarak gösterilmiştir. Olgun dc'ler intravenöz olarak C 57 siyah altı fareye enjekte edildi. Üç gün sonra fareler kurban edildi ve dalaklar toplandı.

OCT'ye gömülü çıtçıtlı donduruldu ve sekiz mikronluk kesitler kriyostat kullanılarak hazırlandı. Numuneler daha sonra aseton ile sabitlendi, DPI ile karşı boyandı ve bir floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi. Bu prosedürleri takip etmek.

Farklı olgunlaşma uyaranlarına yanıt olarak dendritik hücrelerin göçü gibi ek soruları yanıtlamak için antijen pozasyonu veya farklı uyaranlarla olgunlaşma gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.