Name: İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri Qdot nanokristallerle etiketleme ve görüntüleme yöntemini. Bu teknik, farelerde hücre göçünü floresan mikroskopi ile incelemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hibe R15 CA137499-01 (FB) ve Ohio Üniversitesi (FB) bir başlangıç ​​fonu altında NIH tarafından kısmen desteklenmektedir.

1. Fare femur ve kemik iliği hücrelerinin süresince tibialar ve kültür diseksiyonu <ol><li> CO 2 boğulma 2 fareler Kurban ve dikkatli bir şekilde kemik uçları kesmeden tibiaları ve femur teşrih. </li><li> Kağıt mendil kullanarak, bağlı tüm dokulardan kemikleri temizleyin. Kemikleri kırmak için değil dikkatli olun. </li><li> 35 mm Petri kabında 10 dakika boyunca% 70 etanol daldırma kemikleri sterilize edin. Bu andan itibaren, hücre kültürleri kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kaput içinde çalışır. </li><li> Etanol kemikleri kurtarma ve biyogüvenlik kabini içinde bir Petri kabındaki 5 dakika boyunca onları hava kurumaya bırakın. </li><li> En ince ucu yarısında femur ve tibia kesin. Steril bir Petri kabı steril bir şırınga kullanarak RPMI orta 1 ml (serum olmadan ancak antibiyotiklerle) ile kemik içinde infüze. </li><li> Hücre süspansiyonu sallanan bir kova rotor ile soğutmalı santrifüj 1100 RPM (4 ° C) 15 ml santrifüj tüpüne 10 dakika santrifüj RPMI ortamda toplanan ve 2X yıkanır. </li><li> Son yıkamadan sonra, ACK lizis tamponu 2 ml hücrelerin tekrar süspansiyon ve kırmızı kan hücreleri ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> % 10 FBS RPMI 13 ml ekleyin, tekrar süspansiyon ve 1.6 'da açıklandığı gibi aynı ayarları ile bu ortamda 2X yıkayın. </li><li> 2 ayarlamak, hücre sayımı RPMI% 10 FBS ve eklemek rm-GM-CSF (20 ng / ml son konsantrasyon) 5 x 10 5 hücre / ml. </li><li> CO 2 inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2), steril, mikrobiyolojik kalite, 10 cm Petri kabı ve kültür için 10 ml süspansiyon ekleyin . </li><li> Üç gün sonra, hazırlanan plakaların her biri için 20 ng / l ile rmGM-CSF RPMI% 10 FBS başka bir 10 ml ekleyin. </li><li> Üç gün sonra 10 ml hücre süspansiyonu, her Petri kabı kurtarıldı 1.6 olarak santrifüj, rmGM-CSF RPMI% 10 FBS aynı hacimde yeniden süspanse ve Petri kabı geri döndü. Hücreler, CO 2 inkübatör 2 ek gün boyunca kültür . </li></ol> 2. DC'ler Toplama ve etiketlenmesi <ol><li> 8 gün sonra kültür gevşek yapışık hücrelere taze orta Petri kapları yıkanarak kurtarıldı. Bu protokol elimizde 2-4 x10 yaklaşık 8 DC'ler vermektedir. Hücreler flow sitometri DC fenotip için analiz edilebilir. </li><li> Toplanan hücreler daha sonra üreticinin talimatlarına sıkı sıkıya takip Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti ile etiketlenir. </li><li> Biz 10 nM konsantrasyonda Qdots fare kemik iliği kökenli DH'leridir etiketleme mükemmel sonuçlar aldı. Bunu başarmak için, aynı hacimde Qtracker Hücre Etiketleme Kit bileşenleri A ve B, eşit hacimlerde karıştırıldığında, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ve hemen 30 saniye vorteks taze orta 1 / 100 sulandırılmış. </li><li> 5 x 10 6 DC'ler leke için, her kiti bileşenleri Eppendorf tüp ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe A ve B 5 ul karıştırın. Daha sonra, 1 ml RPMI% 10 FBS inkübe ve 30 saniye için vorteks ekleyin. </li><li> Içeren hücre süspansiyonu 5 x10 6 DC'ler 0,5 ml ekleyin ve 37 inkübe ° C, 60 dk . </li><li> Daha sonra, RPMI% 10 FBS (1,100 RPM) 2X hücreleri yıkayın. Hücreler, deneysel fareler enjeksiyon için daha fazla kültür veya RPMI PBS içinde yeniden süspanse edilebilir. </li></ol> 3. Etiketli DC Değerlendirilmesi <ol><li> Hücre etiketleme floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bunu başarmak için, hücre süspansiyonu bir damla (Şekil 3, bir mikroskop lamı eklenir, bir cam lamel ile kaplı ve floresan mikroskobu bu Qdots sırasıyla 565nm ve 405-525nm emisyon ve eksitasyon spektrumları olduğunu dikkate alarak ile değerlendirildi. ) </li><li> Bu noktada, hayvanlar etiketli hücreler enjekte etmek için kullanılacak, ya da olgunlaşma bu hücrelerin 48 saat süreyle inkübe edilmesiyle tetiklenen olabilir (37 ° C, 5 CO 2) (100 ng / ml) ve TNF-(LPS varlığında 20 ng / ml). Floresan etiketleme DC olgunlaşma (Şekil 4) tarafından etkilenmez. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Bu vesile ile biz fare kemik iliği kökenli DH'leridir hazırlamak için nasıl tanımladı ve bunların nasıl floresan Qdots etiketli Şekil. Şekil 1, hücre elde etmek için yordamı özetlemektedir. 2 Qdots onları etiket prosedürü gösteriyor. Şekil. 3, neredeyse tüm hücreleri bu yordamı ile etiketlenir ve bu inflamatuar faktörlerin DC olgunlaşma (Şekil 4). Şekil etkilenmez. 5 inflamatuar bir kokteyl ile tedavi edildiklerinde Qdot lekeli DC'ler (Fig.5a) lekeli olmayan hücrelere benzer davrandığını göstermektedir. Her iki hücre hazırlıkları kostimülatör moleküllerin benzer şekilde ifade upregüle (Şekil 5b); ve olgunlaşması uyaranlara üzerine IL-6 (Şekil 5c) ve nitrik oksit (Şekil 5d) benzer miktarlarda üretmek. Önceki teknolojik sıçramalarda ile aynı fikirdebu Qdot boyanma gösteren lı yayınlanan verilerin, immün yanıtları [6] eliciting yetenekli olgun hücrelere dönüşme yeteneği DC etkilemez. Bu hücreler daha sonra enjekte eden deney hayvanları için de kullanılabilir. Şekil. 6, farelere etiketli DC'ler intravenöz enjeksiyon 2 gün sonra, biz, dalak Qdot lekeli hücreleri algılamak için başardık . Bu aynı zamanda, in vivo olarak DC göç değerlendirmek için Qdot nanokristallerin kullanımını gösteren yayınlanmış daha önceki veri ile anlaşma [6], non-invaziv görüntüleme ve akım sitometri. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 kemik iliğinden DC nesil akış şeması. Bu vesile ile biz, kemik iliğinden elde edilen DC elde süreci betimliyor. Tibiaları ve femur disseke ve doku çevresindeki temiz. Kemik ipuçları korunur ve kemiklerin iç vasatı ile yıka. , Kırmızı kan hücreleri ortadan kaldırarak sonra, kemik iliği hücreleri DC'ler onları ayırt etmek için, GM-CSF huzurunda 8 gün boyunca kültür. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 etiketleme prosedürü akış şeması. Eşit alikotları Qtracker Hücre Etiketleme Kit bileşenleri A ve B Eppendorf tüp içinde karıştırılır. Dendritik hücreler, GM-CSF ile 8-gün kemik iliği kültürleri toplanan ve 37 ° C'de 60 dakika etiketleme boya ile karıştırılır. Sonra hücrelerin aşırı etiketleme partikülleri ortadan kaldırmak için medya yıkanır. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 etiketleme hemen sonra DC'ler Floresan microphotography. Etiketli hücreleri bir damla, bir cam slayt üzerine yatırılır ve bir lamel ile kaplıydı. Sonra floresan mikroskop, örnekler incelendi ve görüntüleri Micropublisher 5.0 Dijital CCD Renkli Kamera (Qimaging, Surrey, BC Kanada) yoluyla elde edildi. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 DC'ler in vitro olarak 48 saat olgunlaşma sonra Floresan microphotography. Etiketli DC'ler LPS (100 ng / ml) ve CO 2 inkübatör (37 ° C,% 5 CO 2) cam slaytlar TNF-α (20 ng / ml) ile 48 saat kültüre edildi. Daha sonra, örnekler, PBS (5 dakika, 2X) ile yıkanır aseton (15 dk, 4 ° C) ile sabit ve DAPI ile zıt. Hücreler, yukarıdaki gibi bir floresan mikroskop değerlendirildi. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Qdot lekeli olgun DC'ler Biyolojik aktivite. Yukarıdaki gibi in vitro olgunlaştı Etiketli DC'ler flow sitometri analiz (A) ve (B). (A) Qdot boyanan hücrelerin FL3 (PercP) kanal güçlü bir sinyal verir. Gölgeli histogram: lekesiz kontrolü. Ve izotip kontrolleri, (B) Qdot lekeli ve lekesiz DC'ler ayrıca CD86 ve CD40 olgunlaşma belirteçlerinin karşı spesifik antikorlar ile boyandı. Hücreler daha sonra bir FACSort akış sitometresi (Becton Dickinson, San Jose, CA) incelendi. Ayrıca, IL-6 (C) ve nitrik oksit (NO), olgun Qdot lekeli DC'ler ve kontrollerin Süpernatantları tespit edildi. IL-6 ve nitrik oksit düzeyleri, ELISA analizi ve daha önce 7 açıklandığı gibi Griess tahlil, 8 sayesinde tespit edildi . Bu rakam gösterdi tüm veriler benzer sonuçlar gösteren iki ya da üç bağımsız deneyler temsilcisidir. Veri GraphPad yazılımı kullanılarak ANOVA ile analiz edildi. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 disseke dokularda etiketli DC'ler tespiti. Etiketli olgun DC'ler (1x10 6 hücre) intravenöz C57BL / 6 farelere enjekte edildi. (A) İki gün sonra fareler sakrifiye edildi ve toplanan dalak, dondurulmuş ek bileşenini, OCT gömülü ve 8 mcM bölümden bir Kriyostat kullanılarak hazırlanmıştır. Daha sonra, numunelerin aseton (15 dk, 4 ° C) sabit ve DAPI ile zıt. Hücreler yukarıdaki gibi bir floresan mikroskopta incelendi Şekil 6a: 40X büyütme, Şekil 6b: 100X büyütme, Şekil. 6C, 400X büyütme.

<ol><li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Bonasio, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+migration+and+function+of+circulating+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation, migration and function of circulating dendritic cells.</a> Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+instructive+role+of+dendritic+cells+on+T+cell+responses%3A+lineages%2C+plasticity+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics.</a> Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).</li>
<li>Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+dendritic+cell+precursors+recruited+by+a+beta-defensin+contribute+to+vasculogenesis+under+the+influence+of+Vegf-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.</a> Nat Med. 10, 950-958 (2004).</li>
<li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+near-infrared+fluorescent+semiconductor+nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals.</a> Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV+oncolytic+therapy+upregulates+interferon-inducible+chemokines+and+recruits+immune+effector+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer.</a> Mol Ther. 12, 789-802 (2005).</li>
<li>Gilboa, E., Vieweg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+with+mRNA-transfected+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells.</a> Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).</li>
<li>Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+murine+dendritic+cell+antitumor+dysfunction+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging.</a> Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).</li>
<li>Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+infection+of+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells%3A+influence+on+antigen+presentation+and+initiating+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).</li>
<li>Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+tumor+antigen+vaccination+using+dendritic+cells%3A+comparison+of+RNA+electroporation+and+pulsing+with+UV-irradiated+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells.</a> J Transl Med. 6, 21-21 (2008).</li>
<li>Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+CD11c-DTR%2FGFP+mice+after+in+vivo+depletion+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells.</a> Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).</li>
<li>Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+angiogenesis+and+promote+lesion+growth+in+a+murine+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis.</a> Faseb J. 22, 522-529 (2008).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dendritic+cells+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular dendritic cells and atherosclerosis.</a> Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).</li>
<li>Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+augment+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells augment choroidal neovascularization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).</li>
<li>Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+dendritic+cells+delays+ovarian+cancer+progression+by+boosting+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity.</a> Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).</li>
<li>Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+peripheral+monocytes+express+endothelial+markers+and+in+the+presence+of+angiogenic+growth+factors+differentiate+into+endothelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells.</a> Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).</li>
<li>Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+tumour-associated+dendritic+cells+into+endothelial-like+cells%3A+an+alternative+pathway+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis.</a> Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li>
</ol>

T hücre etkileşimleri veya DC gelişimi ve çeşitli hastalıklar 9-11 rollerini belirlemek: DC araştırmak; murin miyeloid) DC&#39;ler yoğun DC-temelli aşıların etkinliği ve iyileştirme belirlemek amacıyla kullanılan edilmiştir. Bu vesile ile biz tibiaları ve femur kemik ilikleri kurtarıldı öncülerden DC&#39;ler oluşturmak nasıl göstermektedir. Biz, etanol 70% boğulma yolu ile bize bunları sterilize etmek için izin verir, böylece kontaminasyon olasılığını azaltmak ipuçları kesmeden kemikleri kurtarabilirsiniz. DC&#39;ler kemik iliği hücreleri ayırt etmek için sadece 5 Daha önce açıklandığı gibi GM-CSF kullanmak. Bazı protokoller de IL-4 kullanmalarına rağmen, GM-CSF (12) yüksek düzeyde çalışırken bu sitokin gerekli olmadığı bildirilmiştir. Gerçekten de, daha önce bu DC&#39;ler bağışıklık yanıtlarını 13 ikna etmek mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bakım, bağlı hücreleri daha monosit gibi fenotip beri 8-günlük kültürlerden gelen orta ile Petri bulaşık sadece gevşek yapışık hücrelere kurtarmak için alınması gereken vardır. Burada DC&#39;ler floresan Qdot parçacıklar ile etiketleme göstermektedir. Bu etiketleme, diğer yöntemler açısından bazı avantajları vardır. İlk olarak, Qdots parçacıkları kolayca hücre içine dahil edilmiştir. İkincisi, floresan sinyal çok yüksek ve DC olgunlaşma değişmez. Üçüncü olarak, doku veya hücrelerin, aseton gibi çözücüler, GFP boyama protokolleri seçmek için şu anda daha fazla esneklik vererek, DC&#39;ler 14 etiketlemek için kullanılır ise ne olur aykırı ile sabit floresan kayıp değil . Son olarak, bu parçacıklar tarafından verilen yüksek floresan sinyal hücrelerin doku otomatik floresan rağmen görselleştirme sağlar. Daha önce 6 açıklandığı gibi, Qdot boyama, bu hücrelerin olgunlaşma yeteneği etkilemedi . Bu vesile ile biz Qdot-lekeli DC&#39;ler kostimülatör molekülleri upregulating ve inflamatuar uyaranlara yanıt olarak IL-6 ve nitrik oksit üreten, lekeli olmayan DC&#39;ler benzer bir şekilde davrandığını göstermektedir. DC&#39;ler bağışıklık tepkileri tetikleyen uzmanlaşmış hücreler olsalar da, kanser ve ateroskleroz 4, 15, 16 gibi patolojik durumların katılmak gösterilmiştir. Onlar da hatta yeni gemiler 19, 20 gelişmekte katılan yapısal olarak önerilen anjiyogenik süreci 17, 18, ​​katılmak için öne sürülmektedir. Böylece, DC in vivo izleme ve dokuların farklı 4, ​​21 coğrafi lokalizasyon belirlenmesi için izin yöntemleri, 22 çok değerlidir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 farelerinde </td><td> Jackson laboratuvarlar </td><td></td><td> Kadın, eski 6-8 hafta </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu, nitelikli </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotik-antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK Parçalama Tampon </td><td> Lonza Walkersville, Inc. </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> GM-CSF Rekombinant fare </td><td> PeproTech Inc. </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Hücre Etiketleme Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolisakkaritlerinin </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant fare TNF alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 antikor </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Griess reaktif sistemi </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 yakalama antikor </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 algılama antikor </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

İzleme araştırmaları qdot nanokristaller murin kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve etiketleme

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritik hücreler (DC), periferik dokularda ve immünolojik, timus, kemik iliği, dalak, lenf düğümleri ve Peyer Kullanıcı yamaları 1-3 gibi organlarda bulunan profesyonel antijen sunan hücreler (APC ). DC&#39;ler onlar, süreç ve major histokompatibilite moleküller (MHC) bağlamında kendi yüzeyinde bulunan antijenlerin varlığı, periferik dokularda örnek organizma mevcut. Sonra, antijen yüklü DC&#39;ler T lenfositlerin spesifik immün yanıtları tetikleyen işlenmiş antijenini immünolojik organlara göç ederler. DC&#39;ler göçmen yeteneklerini değerlendirmek için bir yolu, onları floresan boyalar 4 etiket . Bu vesile ile biz fare kemik iliği kaynaklı DC etiket Qdot floresan nanokristaller kullanımını göstermek. Bu etiketleme avantajı Qdot nanokristaller kurtarılan dokularda etiketli hücreleri tespit için ideal istikrarlı ve uzun ömürlü floresan sahip olmasıdır. Bunu başarmak için, ilk hücre DC farklılaşma ikna etmek için fare kemik ilikleri kurtarıldı ve granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör varlığında 8 gün kültüre olacaktır. Bu hücreler daha sonra in vitro inkübasyon kısa floresan Qdots ile etiketlenir. Boyanan hücrelerin floresan mikroskobu ile görüntülenebilir. Hücreler noktada deney hayvanlarının içine enjekte edilebilir ya da inflamatuar uyaranlara ile in vitro inkübasyon üzerine olgun hücrelerin içine olabilir Bizim ellerde, DC olgunlaşma floresan sinyal kaybı tespit etmedi ne Qdot boyama DC&#39;ler biyolojik özellikleri etkilemez. Enjeksiyon üzerine, bu hücrelerin tipik diseksiyon ve tespit işlemleri aşağıdaki floresan mikroskobu ile bağışıklık organlarda tespit edilebilir.

Dendritik hücreler alımı antijenler ve T hücrelerine işlenir antijenleri bağışıklık organları doğru göç. Qdot nanokristal etiketleme, uzun ömürlü ve istikrarlı bir floresan sinyali sağlar. Bu floresan mikroskobu ile farklı organlara dendritik hücreler izleme sağlar.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritik hücreler (DC'ler); periferik dokularda ve timus, kemik iliği gibi immünolojik organlarda bulunan profesyonel antijen sunan hücrelerdir (APC'ler).

Bu prosedürün genel amacı, Q nokta nanokristallerini kullanarak görüntüleme çalışmaları için dendritik hücreler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle kemik iliği hücrelerinin murn, femur ve tibialardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, GM CSF varlığında hücrelerin dendritik hücrelere farklılaşmasını kolaylaştırmak için kemik iliği hücre kültürleri kurulur.Ardından, sekiz gün sonra dendritik hücreler kemik iliği hücre kültürlerinden geri kazanılır. Prosedürün son adımı, hücrelerin floresan Q nano kristallerle boyanmasıdır. Sonuç olarak, parlak şekilde boyanmış dendritik hücreler floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.Bu teknolojiyi GFP etiketli dendritik hücreler kullanmak gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında kullanmanın temel avantajı, Q-nokta nanokristallerinin aseton gibi organik çözücülerle boyama işleminden sonra bile floresan özelliklerini korumalarıdır. Bu yöntem, dendritik hücre biyologlarının, bu hücrelerin farklı hastalıklardaki veya farklı hastalıklar bağlamındaki göç özellikleri gibi temel soruları yanıtlamalarına yardımcı olabilir. Boyama prosedürünü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Maria Ali uygulamalı olarak gösterecektir.Sakrifyasyon sonrası, kemik uçlarını kesmemeye dikkat ederek iki fareden tibia ve femur kemiklerini dikkatlice diseke edin. Ardından, kemikleri kırmamaya özen göstererek, yapışmış olan tüm dokuları kağıt havlu ile temizleyin. Bu işlem biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.35 mm'lik bir Petri kabını %70 etanol ile doldurun ve ardından kemikleri 10 dakika boyunca etanolda bekletin. Kemikler sterilize edildikten sonra onları etanolden çıkarın ve yeni bir Petri kabında beş dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Şimdi, femur kemiğini ortadan, tibia kemiğini ise en ince uçlarından kesin.Steril bir şırınga kullanarak kemiklerin iç kısmına bir mililitre RPMI medyumu enjekte edin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve salıncaklı kova rotorlu bir santrifüjde, dört santigrat derecede 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek RPMI medyum ile iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, eritrositleri uzaklaştırmak için hücreleri iki mililitre CK lizis tamponu içinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, 13 mililitre %10 FBS içeren RPMI ekleyin ve hücreleri bu ortamda, daha öncekiyle aynı santrifüj ayarlarını kullanarak iki kez daha yıkayın. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu mililitre başına iki x 10⁵ hücre olacak şekilde ayarlayın. %10 FBS içeren RPMI ile birlikte, final konsantrasyonu 20 nanogram/mililitre olacak şekilde rekombinant murin G-M-C-S-F ekleyin.Ardından, bu süspansiyondan 10 mililitreyi steril mikrobiyolojik kaliteye sahip 10 santimetrelik bir Petri kabına ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir karbondioksit inkübatöründe kültüre edin. Üç gün sonra, hazırlanan her bir plağa 20 nanogram/mililitre rekombinant murine G-M-C-S-F içeren %10 FBS'li RPMI'dan 10 mililitre daha ekleyin.Üç gün sonra, her bir Petri kabından 10 mililitre hücre süspansiyonu alın, hücreleri aynı koşullar altında santrifüjleyin ve pelletlemiş hücreleri, Petri kaplarından alınanla aynı hacimde %10 FBS içeren RPMI içinde yeniden süspande ederek yeni rekombinant murin G-M-C-S-F ile takviye edin. Son olarak, hücre süspansiyonunu orijinal Petri kaplarına geri aktarın ve hücreleri karbondioksit inkübatöründe iki gün daha kültüre edin. Sekiz günlük kültür süresinin ardından, Petri kaplarını taze besiyer ile yıkayarak yüzen ve gevşek yapışık hücreleri toplayın.Ardından, üretici talimatlarına sıkı sıkıya uyarak, 5 × 10⁶ fare kemik iliği kaynaklı DC'yi 10 nM konsantrasyondaki Q nano kristalleri ile işaretlemek için Q tracker 6 55 hücre işaretleme kiti ile işaretleyin. Öncelikle, kit bileşenleri A ve B'den beşer µL'yi bir eppendorf tüpünde karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, 1 mL %10 FBS içeren RPMI ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin.Ardından, 0,5 mililitre RPMI artı %10 FBS içinde süspande edilmiş beş x 10⁵ Dcs ekleyin ve hücreleri D çözeltisi içinde 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Sonra hücreleri, öncekilerle aynı koşullar altında RPMI artı %10 FBS ile iki kez yıkayın ve peleti RPMI içinde yeniden süspande edin.Bu şekil, dcs'nin floresan mikrograf örneğini göstermektedir. Etiketleme işleminin hemen ardından, etiketlenmiş hücrelerden bir damla cam lam üzerine damlatılmış ve bir lamel ile kapatılmıştır. Ardından örnekler, floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir.Bu şekilde, 48 saatlik in vitro olgunlaşma sonrası dcs'lerin işaretlenmiş floresan mikrofotografı görülmektedir. Dcs'ler, bir karbondioksit inkübatöründeki lam kültürü odacıklarında 100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL TNF alpha ile 48 saat boyunca kültüre edilmiştir. Ardından örnekler PBS ile yıkanmış, aseton ile fikse edilmiş, DPI ile karşıt boyama yapılmış ve floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir.İn vitro ortamda olgunlaştırılan etiketli dcs'ler akış sitometrisi ile analiz edildi; Q dot ile boyanmış hücreler FL üç kanalında güçlü bir sinyal verdi (Q dot boyalı ve boyanmamış). Dcs'ler ayrıca olgunlaşma belirteçleri olan CD 86 ve CD 40'a karşı spesifik antikorlar ve izotip kontrolleri ile boyandı, ardından akış sitometrisi ile analiz edildi. Ek olarak, olgun Q boyalı DCS'lerin ve kontrollerin süpernatantlarında IL altı ve nitrik oksit seviyeleri belirlendi.Burada, diseke edilmiş bir dokudaki işaretlenmiş DCS'nin temsili bir figürü gösterilmiştir. Olgun DCS'ler C 57 black six farelere intravenöz olarak enjekte edilmiştir. Üç gün sonra fareler sakrifiye edilmiş ve dalaklar toplanmıştır.Örnekler OCT içinde şok dondurularak gömülmüş ve kriyostat kullanılarak sekiz mikron kalınlığında kesitler hazırlanmıştır. Ardından örnekler aseton ile fikse edilmiş, DPI ile karşıt boyama yapılmış ve floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu prosedürler takip edilmiştir.Farklı olgunlaşma stimülasyonlarına yanıt olarak dendritik hücrelerin göçü gibi ek soruları yanıtlamak için, antijen sunumu veya farklı stimülasyonlarla olgunlaştırma gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

MRI kullanarak hücrelerin Takip geçmiş yıllarda kayda değer bir ilgi kazanmıştır. Bu protokol, flor ile dendritik hücrelerin etiketlenmesi açıklanmaktadır...

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Bir transgenik fare, T hücresi reseptörüne bağlanan bir 64Cu-modifiye edilmiş monoklonal antikorun hazırlanmasını takiben, T hücreleri, canlılık, fonksiyonellik, etiketleme stabilitesi ve apoptoz için analiz, in vivo olarak radyoaktif işaretli olan ve adoptif bir nefes yolu gecikmeli tipte aşırı duyarlılık ile farelere aktarıldı pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET / BT) ile invazif olmayan görüntüleme için reaksiyon.

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Öğrenin kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri Qdot nanokristallerle etiketleme ve görüntüleme yöntemini. Bu teknik, farelerde hücre göçünü floresan mikroskopi ile incelemeyi mümkün kılar.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Daha fazla video keşfet