Name: Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Öğrenin makromolekül-ligand bağlanmasını izotermal titrasyon kalorimetresi ile incelemeyi. Bu yöntem, E. coli dihidrofolat redüktazı ve NADPH kullanarak bağlanma termodinamiğini tek deneyde belirler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NSF hibe MCB-0817827 tarafından desteklenen oldu.

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bir deneyde bağlayıcı bir etkileşim tüm termodinamik parametreler (yakınlık, entalpi ve stokiyometri) belirleyebilirsiniz iyi kurulmuş teknik, izotermal şartlar altında ikinci bir reaktanı bir reaktanı titre 1 ITC çalışır . Ölçülen sinyal iki reaktanları etkileşimi üzerine serbest (bağlama) veya emilen ısı. Bir dizi enjeksiyon yapılır ve ısı sinyali sınırlayıcı reaktanı doygun hale sıfır yaklaşım olacaktır. Izoterm Montaj termodinamik parametreleri verir. Bazı değerlendirmeleri enstrümantasyon yanı sıra veri toplama ve analiz matematik anlatan kullanılabilir. 2,3 diğer kalorimetreleri mevcut olmakla birlikte (en önemlisi küçük hacimleri ile ITC 200), biz burada genel bir protokol VP-ITC için imal tarif MicroCal tarafından (artık GE Healthcare parçası). 1. Hazırlanması Örnekleri <ol><li> Tampon makromolekül ve ligand hazırlamak için, bazı olası sorunları ele alınması gerekir. Doğru uyan makromolekül uygun konsantrasyonları, genellikle örnek ITC hücre ve ligand gider türleri, enjeksiyon şırınga tür gerektirir. Çünkü bazı proteinler enjeksiyon şırınga türler için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda agrega protein, çoğu zaman örnek hücre içine yüklenir. Optimal makromolekül konsantrasyon ITC kullanmadan önce ortogonal yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir "c", sistemin tahmin edilen benzeşim ürünü, ve toplam makromolekül konsantrasyonu belirlenir c = K a * [M]. C aralığı 10-1000, 1 Optimal değerler alt sınırının c değerleri ile belirli deneysel koşullar altında zayıf bağlama sistemleri için doğru veri elde etmek mümkün olsa Böylece 4 makromolekül konsantrasyonu bu aralığın ile tespit edilmelidir c akılda değerleri (yani, bir K 10 6 M -1, 10 1000 mcM makromolekül konsantrasyonlarda kullanılması gerekir). Afinitesi sistem hakkında önceden bilgi sahibi ITC deneyi daha iyi bir tasarım ile ITC için kullanılan protein en aza indirmeye yardımcı olabilir. Bu doygunluk titrasyon yarısı ilk üç içinde meydana gelir ligand konsantrasyonu (7-25 kat zayıf ligand bağlanma yeri için K d daha konsantre) kadar büyük olmalıdır. Verileri doğru uydurma da doygunluk sinyali gerektirir. Yüksek afinitesi olan sistemler için, daha düşük bir ligand konsantrasyonu yanlış uyan verecek, çok erken titrasyon doygunluğunu önlemek için kullanılmalıdır. Bir kez seyreltme kontrol ısı (yani tampon içine ligand titrasyon) titrasyon çıkarılır, doygunluk entalpi sıfır yaklaşım gerekir. </li><li> Küçük molekül kirleri ITC ölçümleri artefakt sinyaller ortaya çıkmasına neden olabilir, çünkü makromolekül ve ligand ince ayrıntısına kadar tampon karşı diyalize olması, mümkünse, en iyisidir. Alternatif olarak, kolon kromatografisi, dönüş sütun tuzsuzlaştırma, ya da tampon değişimi santrifüj filtreleri (örneğin, Centricons) makromolekül tampon değiştirmek için kullanılabilir. Ligand küçük bir molekül ise, makromolekül küçük moleküller için uygun (yani 100-500 Da Spectra / Por Float-A-Lyzer kesilecek Diyaliz membranları karşı diyaliz diyaliz veya edildikten sonra diyaliz tampon kullanılarak hazırlanmış olabilir .) Ligand ve macromolecule çözümler arasında tampon kompozisyonu farklılıklar örneklerde safsızlıkların seyreltme ısı eserler sinyal yol açabilir. Hazırlandıktan sonra, entalpi gölgeleri, tampon, makromolekül ve ligand maç pH (± 0.05 pH birimi) tampon protonasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkabilir emin olmak için kontrol edin. 5 her tür yeterince hazırlamak için emin olun . Üç nüsha deney ve seyreltme kontrolü için gerekli malzeme miktarı, kullanılan ITC bağlıdır. Ancak, yaklaşık 2 ml hacimli numune hücreleri en ITC enstrümanlar için makromolekül çözüm en az 6-7 ml gereklidir olacak ve 15 ml şahin tüpleri uygun hazırlanmış olabilir. 300 mcL enjeksiyon şırınga için, 1-2 ml çözüm yeterli olmalı ve şahin tüpler veya mikrosantrifüj tüpleri ya da hazırlanmış olabilir. </li><li> Toz ve diğer partiküller, ITC değeri şekilden temel eserler neden olabilir. Bu deney çalıştırmadan önce çıkarılmasını zorunludur. Örnek stok çözümleri ön hazırlıktan sonra, numuneler, 8000 çözüm pelet parçacıklar 14.000 RPM için beş dakika mikrosantrifüj tüpler santrifüj edilmelidir. Süpernatantı pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak ve yeni bir Şahin / mikrosantrifüj tüp içine koyun. Reductants azaltılmış cysteines korumak için gerekli ise, β-Merca düşük konsantrasyonlarda ve taze stokları kullanınptoethanol, TCEP (tris (2-karboksil) fosfin) veya dithiothreitol indirgeyici oksidasyon nedeniyle herhangi bir eser en aza indirmek için. Ayrıca, organik çözücüler (çözünür için metanol veya DMSO gerekebilir bazı küçük molekül ligandlar için ortak) varlığı tampon sinyali eserler neden olabilir. Eğer organik çözücüler ligand için gerekli olan, daha sonra makromolekül çözüm organik çözücü seyreltme sıcaktan kaynaklanan herhangi bir sinyal önlemek için de aynı konsantrasyonu içermelidir. Ligand cosolvents nedeniyle makromolekül arasındaki tampon bileşimi hafif farklılıklar, tuz veya pH örneklerinin hazırlanması sırasında mümkündür. Makromolekül içine örnek tampon veya numune tamponu içine tampon içerik farklılıklardan kaynaklanan ısı sinyalleri sadece kalıntılarından kaynaklanan veri neden olmamasını sağlamak için seyreltme ligand kontrol etmek en iyisidir. </li><li> Dikkatlice tam konsantrasyonları kayıt sistemine uygun teknikleri (absorbans ölçümleri, HPLC, kolorimetrik testleri, proteinler için BCA testleri, vb gibi) kullanarak makromolekül ve ligand konsantrasyonları kontrol edin. Izoterm sığdırmak için kullanılan gerçek konsantrasyon ve konsantrasyonu farklılıklar stokiyometri, entalpi ve deney belirlenen afinitesi hatalarına neden olur. Bu, özellikle yüksek sıcaklıklarda hava kabarcıkları veya titrasyon sırasında çözünmüş gazları salınımı nedeniyle sinyal eserler, önlemek için gazını örnekleri yaygındır. </li></ol> 2. Deney ayarlama <ol><li> Örnek hücre ve enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand yükleme önce üretici firmanın protokolüne göre temizlenir emin olun. Örnek hücresi, iki veya üç kez 1.8 ml distile su Hamilton şırınga (varil kolayca kırık olarak Hamilton şırınga veya iğne bükük ile dikkatli) kullanarak ile durulayın. Sonraki tampon 1.8 ml örnek hücre birkaç kez yıkayın. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olmak, macromolecule çözüm 1.8 ml örnek hücre yükleyin. </li><li> Referans hücre saf su ile doldurun. En tamponlar için, distile su referans çözüm olarak kullanmak için iyidir. Ancak, özellikle yüksek iyonik güçlü veya osmolalitesi tamponlar, tampon bir referans olarak kullanmak daha iyidir. </li><li> Hamilton şırınga yardımıyla referans ve örnek hücreleri hava kabarcıklarını çıkarın. Şırınga, iğne, hücrenin altındaki ve hücrenin en iyi ekli herhangi bir kabarcıkları vurma hücre kenarları yukarı ve aşağı yavaşça hareket. Örnek ve referans hücreler herhangi bir aşırı ses çıkarın. </li><li> Plastik bir enjektör boru kullanarak enjeksiyon şırınga doldurma bağlantı noktasına takın. Enjeksiyon şırınga saf su ile durulayın. Durulama tarafından bir tampon uygulayın. Enjeksiyon şırınga sistemi aracılığıyla hava çekerek tamamen boşaltılmış olduğundan emin olun. Tüm şırınga dolana kadar ligand çözüm içine enjeksiyon şırınga iğnesi enjeksiyon enjektör içine yerleştirin ve ligand çözümü çizmek. Liman ve ekli boru içine biraz fazla hacmi (yaklaşık 50 ul veya daha fazla) çizmeye devam. Hemen şırınga doldurma portu kapatmak ve boru ve plastik şırınga ayırmak. Şırınga herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için Temizle ve dolum enjeksiyon şırınga iki kez daha. Ligand çözüm şırınga çıkarın ve bu şırınga ses çıkarabilir kimwipe şırınga ucu dokunmamaya dikkat ederek, kimwipe herhangi bir damla kaldırmak için bir yan silin. Ayrıca, bu da şırınga ucu hacim kaybına neden olabilir şırınga vurmayın veya kavanoza dikkatli olun. Örnek hücre içine enjeksiyon şırınga yerleştirin. </li><li> ITC çalıştırmak için parametreleri ayarlayın. Güçlü ısı sinyalleri ile bağlayıcı sistemler için, düşük hacimli enjeksiyonlar çok sayıda montaj için daha fazla veri noktaları (örneğin 3 ul 75 enjeksiyon) verecektir. Zayıf ısı sinyallerini sahip sistemler için, az sayıda büyük hacimli enjeksiyonlar (8 ul örneğin 33 enjeksiyon) tercih. En sık olarak, yüksek enjeksiyon hacimleri ile daha az enjeksiyonlar kullanılır. Bu sizin sisteminiz için en iyi koşulları optimize etmek için birkaç titrasyonları sürebilir. Bağlayıcı entalpi çalışılan sisteme bağlı olarak, ekzotermik yada endotermik olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bazı sistemler, ısı tepki belirlemek zor hale, düşük ısı sinyalleri var. Potansiyel olarak bu tür sistemleri ile ilgili problemler, makromolekül konsantrasyonu artırarak, değişen sıcaklık deneyi (bağlama sistemi ısı kapasitesine bağlı olarak), ve / veya pH değerini değiştirerek veya tamponun iyonik gücü tarafından aşılabilir. </li><li> Ayrıca her enjeksiyon arasındaki zaman aralığı göz önünde bulundurun. Ligand, her enjeksiyondan sonra, sistem denge sağlaması için süre verilir şarttır ve sonraki enjeksiyon meydana gelmeden önce ısı sinyali başlangıca döner. Çoğu sistemde, 3-5 minutes yeterli olmalıdır. Enjeksiyonlar arasındaki süre, dengeleme beş dakika içinde oluşmaz sistemleri için artırılması gerekmektedir. </li><li> Örnek hücre içine eklenir kez enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand çözümleri arasında biraz da karışıklık olacağı için, ilk enjeksiyon sahte sonuçlar verecektir. Bu ilk bir veya iki enjeksiyon (bu yüzden daha sonra iptal edilebilir) için küçük hacimli (örneğin 2 ul) ve istediğiniz değerleri sonraki enjeksiyonlar tutmak en iyisidir. </li><li> Deney sıcaklığı (25 ° C arasındaki sıcaklıklarda 2 ile 80 ° C kullanılabilmesine rağmen, en yaygın olarak). Seçin Ligand makromolekül sistemi üzerinde yapılan diğer deneylerin (bağlama, kinetiği, vb.) Eşleşen bir sıcaklık seçmek için en iyisidir. ITC deney sıcaklığı farklı bir sıcaklıkta dengeye kurulabilir. Deney fazla 10 ° C uzakta oda sıcaklığında bir sıcaklıkta olacak ise, o zaman 5 ° C deneysel sıcaklık içinde araç dengeleme sıcaklığını ayarlamak için iyi. Bu cihaz deney sıcaklığına ulaşmak için alacaktır zaman azalacaktır. Şırınga karıştırma hızı da göz önüne alınması gerekiyor. Karıştırma titrasyon sırasında ligand ve makromolekül yeterli karıştırma için gerekli, ancak bazı proteinler hızlı karıştırarak istikrarsızlaştırdı. Bu gibi durumlar için, karıştırma hızı nispeten düşük bir oranda ayarlanmış olmalıdır. Bir kez tüm deneysel parametreleri, daha sonra deney başlamış olabilir kurmak olmuştur. </li><li> Deney bittikten sonra, ITC, üretici firmanın protokolüne göre temizlenir. Makromolekül-ligand kompleks karışımı ilave deneyler istendiğinde, deney sonunda örnek hücre çözüm tutulabilir. </li><li> Titrasyonları tekrarlanabilir verileri almak için en az bir ya da iki kez daha tekrarlayın. Ligand ligand için seyreltme ısı belirlemek için örnek hücre içine tampon titre edilir bir kontrol çalıştırın. Bazı sistemler için bağlayıcı süreci hakkında kooperatif bağlama, ek bilgi yoktur makromolekül ligand içine enjekte edilerek elde edilebilir. Farklı enjeksiyon yönelimleri küresel montaj için yararlı olabilir ek bilgi verebilir. 6 </li></ol> 3. Veri analizi <ol><li> Veri Montaj kolayca herhangi bir veri montaj programı (genellikle cihaz ile birlikte üretici tarafından sağlanan) makrolar kullanılarak yapılabilir. Ilk veri dosyası yükleyin. Herhangi bir işaret sinyal hava kabarcıkları veya diğer eserler için ham değeri şekilden kontrol edin. (O zaman noktasında herhangi bir enjeksiyon vardı temel ya da zirveleri ani gibi) herhangi bir eser varsa, bunlar kaldırılacak olması gerektiği gibi, daha sonra bu veri noktalara dikkat. Sonra, ligand seyreltme kontrol verileri yük ve ligand bağlayıcı izoterm seyreltme veri çıkarma. Şu anda, seyreltme eserler meydana gelen titrasyon ilk bir veya iki veri noktası (7. adıma bakınız) dahil olmak üzere, tüm sahte veri noktaları çıkarın. </li><li> Verilerin sığması amacıyla kullanılmak üzere veri uydurma modeli (bir bağlanma yeri, iki / çoklu bağlayıcı siteleri, kooperatif bağlama, vb.) Seçin. Verileri (K), uydurma parametreleri, stokiyometri (n), entalpi (ΔH) ve bağlanma afinitesi ilk tahmin uygun olabilir . Afinitesi veya diğer parametreler önceden bilgi, dik deneyler bilinen ise, bu değerler girilebilir. Bu uydurma sırasında yerel minimum sıkışıp haline uyum uzak durmanıza yardımcı olur. Veri ilk titrasyon için uygun edildikten sonra, geri kalanı için izotermleri 15 ve 16. adımları tekrarlayın. Alternatif olarak, veriler, dünyada bu tür SEDPHAT programları kullanarak uygun olabilir 6 SEDPHAT üçlü karmaşık veri setleri ile birlikte ikili karmaşık veri setleri (yani moleküller A + B) küresel uydurma özellikle yararlı olabilir (moleküller A + B + C) . Örneğin, bir AB karmaşık molekül C bağlayıcı (tam doymuş değilse) A ya da B, C bağlayıcı nedeniyle herhangi bir sinyal olabilir mi her zaman açık değildir. </li><li> ITC verileri artefakt olduğundan emin olmak için, afinitesi ve ITC elde stoichiometries dik bir yöntem ile karşılaştırıldığında olmalıdır. 7,8 Ayrıca, ITC van't Hoff arsa entalpi entalpi değeri mukayese edilebilir. 9 Ayrıca, artan macromolecule konsantrasyon ile ısı sinyali mutlak değerini artırmak gerektiği gibi ligand veya makromolekül farklı konsantrasyonlarda kullanmak yararlı olabilir. Eserleri, hücre ve şırınga tamponlar uyumlu değilse ortaya çıkması en muhtemel. Eserler için bir başka olasılık saf örnekleri ortaya çıkar. </li><li> Biz K d ve stoich önceki bilgi yoktur kullanıcı için basit bir ikili karmaşık titrasyonları ile başlamanızı öneririziometry. Daha sonra, eğer ek ligandlar bağlayan, kullanıcı ligand konsantrasyonları farklı, daha karmaşık bir üçlü kompleksi titrasyonları deneyebilirsiniz, ve belki de şırınga ve hücre bileşenleri anahtarlama. Entalpi bir devlet fonksiyonu olarak, hem de yolları için üçlü kompleks oluşum entalpisi bir karşılaştırma katkı olmalıdır. 10, SEDPHAT 6, burada oldukça yararlı muhtemeldir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. E. NADPH kofaktör bağlama için iyi davranmış titrasyon bir temsilci örnek coli kromozom dihidrofolat redüktaz (ecDHFR). Paneli (A), ham değeri şekilden gösterir; (B), entegre değeri şekilden uyum bağlayıcı izoterm Kökeni yazılım bir yerinde modeli kullanarak ve (C) boyunca SEDPHAT izoterm uygun bir bağlayıcı site modeli kullanılarak fit artıklar. Kökeni yazılımı, tek bir site bağlama modelini kullanarak, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0.194 ± 0.001 mcM, H = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / mol ve işaretiyle karar verilir = - 9.16 ± 0.01 kcal / mol. Sedphat 0.94 n göze kullanarak veri uyar ± 0.01, 0.195, K d ± 0.013 ΔM, bir ΔH -22.5 ± 0.2 kcal / mol, -13,39, TΔS kcal / mol ve -9,15 kcal / mol, işaretiyle karar verilir.

<ol><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li>
<li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li>
<li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT%3A+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li>
<li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase%2C+a+D2+symmetric+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li>
<li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides%3A+calorimetric+and+NMR+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li>
<li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li>
<li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+%283%29-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li>
<li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2008%3A+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li>
<li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li>
<li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles%3A+a+thermodynamic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li>
<li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li>
<li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li>
<li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li>
<li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin%3ANADP%2B+reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li>
<li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li>
<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

ITC ligand makromolekül etkileşimleri, 11, 12 DNA-13 ve RNA makromolekül 14 çalışma ligand, protein-ligand bakarak çalışmaları ile eğitim yaygın olarak kullanılan olmuştur . ITC bile üniforma süspansiyonlar formu gibi nanopartiküller gibi sağlam malzemeler, Ayrıca 15, bir ligand zaten makromolekül bağlı ve ikinci bir ligand titre üçlü sistemler, termodinamik belirlemek için kullanılabilir, Örneğin, bir enzim kofaktör sistemi substrat bağlanması 7 Araştırmalar aynı zamanda, normalde zayıf bağlayıcı ligandlar ile rekabet bağlayıcı deneyleri yaparak ITC algılama sınırını aşacak çok yüksek bağlanma afiniteleri ile moleküller için yapılabilir. 16 zayıf bağlayıcı Bilgiler son 19 ligandlar rekabet analizleri ile de elde edilebilir. 17 su bağlama rolü çözücü yeniden yapılanma entalpi bağımlılığı ile birlikte, 18 ITC tarafından keşfedilmeyi olabilir. DNAK varyantlarının konformasyonel değişim termodinamik bağlayıcı üzerine ölçüldü ADP ve ATP bağlayıcı entalpi 20 protein-protein birliği hetero kompleksleri 21 homo-dernek hakkında bilgilerin yanı sıra verimli, ITC tarafından incelenecektir. 22 Sıcaklık etkileri bağlayıcı olay ısı kapasitesi 2 numara verecektir. ek ITC çalışmaları farklı pH değerlerinde yapılırsa proton emilir veya bağlayıcı üzerine yayımlanan iyonizasyon farklı entalpisi ile tampon yapılan deneyler de tespit edilebilir. 5 pKa katılan grup, daha sonra potansiyel olarak tespit edilebilir. 23 Özetlemek gerekirse, makromolekül ve ligand konsantrasyonu iyi bir ITC deneyi için doğru ölçümler zorunludur. Örnek konsantrasyonları da güvenilir veri elde etmek için uygun bir aralık içinde olması gerekir. Küçük molekül kirlilikler ve pH uyumsuzlukları değeri şekilden gölgeleri neden olacaktır Bakım tamponu ile alınmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 1.7 mL mikrosantrifüj tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml şahin borular </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2.5 mL Hamilton şırınga </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

makromolekül-ligand affinity Ölçüm İzotermal titrasyon kalorimetre

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bağlayıcı bir reaksiyon termodinamik resim anlamak için yararlı bir araçtır. Biyolojik bilimler, makromoleküler etkileşimleri hücre makine anlamak çok önemlidir. Tampon ve sıcaklık gibi deneysel koşullar, çalışılan belirli bir bağlama sistemi için uygun olabilir. Ancak, belirli bir ligand ve makromolekül konsantrasyon aralıkları yararlı veriler elde etmek için gerekli olduğundan, dikkatli bir planlama gereklidir. Makromolekül ve ligand konsantrasyonları güvenilir sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde tespit edilmesi gerekmektedir. Bakımı da kirleri deney önemli ölçüde etkileyebilir örnekleri hazırlanırken alınması gerekir. Stokiyometri, yakınlık ve entalpi gibi kontrollerle birlikte ITC deneyleri, doğru yapılır, yararlı bağlama bilgileri, elde edilir. Farklı tampon veya sıcaklık koşulları altında ilave deneyler çalıştıran, sistemi hakkında daha ayrıntılı bilgi elde edilebilir. ITC deneyi temel kurulum için bir protokol verilir.

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

İzotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), bir bağlanma reaksiyonunun eksiksiz termodinamik tablosunu anlamak için faydalı bir araçtır. Biyolojik...

Bu prosedürün genel amacı, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanarak ligand-makromolekül bağlanmasını incelemek için genel bir tekniği göstermektir. Bu işlem, öncelikle safsızlıklardan arındırılmış ve hem tampon kompozisyonu hem de pH açısından eşleştirilmiş ligand ve makromolekül çözeltilerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, ligand ve makromolekül çözeltilerinin nihai konsantrasyonları belirlenir.Ardından ITC deneysel parametreleri ayarlanır ve veri toplama işlemine geçilir. Prosedürün son adımı, verilerin analiz edilmesi ve uydurulmasıdır. Nihayetinde, bağlanma ve termodinamik parametrelerini belirlemek için titrasyon verilerinin grafiksel analizi yoluyla ligand-makromolekül etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilir.Bu bağlanma tekniğinin absorpsiyon ve floresans titrasyonları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bağlanma entalpisinin ve dolayısıyla entropisinin aynı deneyden belirlenebilmesidir. Örnek hazırlama, hem makromolekül hem de ligand için uygun konsantrasyonların belirlenmesiyle başlar. Doğru ITC uyumları elde etmek için kritik bir adım olan ve bu konsantrasyonlar hesaplanırken dikkate alınması gereken bilgiler yazılı prosedürde yer almaktadır.Bu gösterimde, ko-faktör N-A-D-P-H'nın e coli kromozomal dihidrofolat redüktaz enzimine bağlanması incelenmektedir. Öncelikle liyofilize makromolekülü tampon içerisinde istenen konsantrasyonda yeniden oluşturun, ardından ligandı gerekli hacimdeki tamponda çözün. Sonrasında, makromolekül ve ligand örneklerinin pH değerlerinin tamponla ve birbirleriyle artı veya eksi 0,05 pH birimi sınırları içinde olduğunu kontrol edin; hem kromozomal dihidrofolat redüktaz hem de N-A-D-P-H çözeltilerini mikro santrifüj tüplerinde beş dakika boyunca santrifüjleyin.8.000 ila 14.000 RPM'de yapılacak bu işlem, ITC termogramının taban çizgisinde artefaktlara neden olabilecek çözeltideki tüm partiküllerin çöktürülmesini sağlayacaktır. Santrifüj işleminin ardından, makromolekül ve ligand çözeltilerinin konsantrasyonlarını UV-Vis spektroskopisi ile dikkatlice kontrol edin ve kesin konsantrasyonlarını kaydedin.Ardından, hazırlanan stok makromolekül ve ligand çözeltilerini gerekli deneysel konsantrasyonlara seyrelterek her bir ITC çözeltisinin uygun hacmini hazırlayın. Son olarak, makromolekül ve ligandı ITC'ye yüklemeden önce, titrasyon sırasında hava kabarcıkları veya çözünmüş gazların salınımı nedeniyle oluşabilecek sinyal artefaktlarını önlemek için örneklerin gazını alın. Örnek hücresini ve enjeksiyon şırıngasını üretici protokolüne göre temizleyin.Ardından, bir Hamilton şırınga kullanarak örnek hücresini iki veya üç kez 1.8 milliliters distile su ile durulayın. Şırınganın uzun ucu kolayca büküldüğü için şırıngayı kullanırken dikkatli olun. Daha sonra, örnek hücresini aynı hacimdeki tampon çözelti ile birkaç kez durulayın.Numune hücresi temizlendikten sonra, hücreye 1,8 mililitre makromolekül çözeltisi yükleyin. Çözeltinin hücre gövdesinden çıktığı noktada hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek numune eklemesini durdurun. Mevcut kabarcıkları uzaklaştırmak için Hamilton şırıngasını kullanarak iğneyi hücrenin yan duvarlarında nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirin.Şırıngayı geri çekin ve hücrenin üst kısmındaki kuyucukta bulunan fazla hacmi uzaklaştırın. Ardından, referans hücreyi distile su ile doldurun. Sonra, bir boru yardımıyla plastik bir şırıngayı enjeksiyon şırıngasının dolum portuna bağlayın.VP viewer 2000 konsolundaki doldurma portunu açın. Enjeksiyon şırıngasını önce distile suyla, ardından tampon çözeltiyle durulayın. Sistem üzerinden hava çekerek enjeksiyon şırıngasının tamamen boşaltıldığından emin olun.Enjeksiyon şırıngasının iğnesini ligand çözeltisine yerleştirin ve çözeltiyi şırınga tamamen dolana kadar çekin. Port içine biraz fazla hacim çekmeye devam edin ve dolum portunu hemen kapatarak tüpleri ayırın. Tüpleri ve plastik şırınga tahliye düzeneğini çıkarın; şırıngadaki tüm kabarcıkları gidermek için enjeksiyon şırıngasını iki kez boşaltıp yeniden doldurun.Enjeksiyon şırıngasını ligand çözeltisinden çıkarın ve yanındaki damlacıkları bir kimyasal temizleme beziyle silin. Şırınganın ucunu temizleme bezine değdirmemeye veya şırıngayı çarpmamaya dikkat edin; aksi takdirde şırıngadaki hacim azalabilir. Ardından, enjeksiyon şırıngasını dikkatlice örnek hücresine yerleştirin.Bağlanma sistemleri için Micro Cal tarafından sağlanan V VP viewer 2000 programını kullanarak ITC çalıştırma parametrelerini ayarlayın. Kromozomal DIHYDROFOLATE redüktaz N-A-D-P-H sistemi gibi güçlü ısı sinyallerine sahip sistemlerde, çok sayıda düşük hacimli enjeksiyon yapmak uyumlama için daha fazla veri noktası sağlayacaktır. Buna karşılık, zayıf ısı sinyallerine sahip sistemler için az sayıda yüksek hacimli enjeksiyon kullanmak daha uygundur.İlk bir veya iki enjeksiyon için enjeksiyon hacmini iki mikrolitreye ayarlayın. Ligand ve makromolekül çözeltileri arasındaki karışma nedeniyle yanıltıcı sonuçlar verebileceği için bu enjeksiyonlar sonunda göz ardı edilecektir. Enjeksiyonlar arası süreyi girerken, sistemin dengelenmesi ve ısı sinyalinin baz hattına dönmesi için birkaç dakika süre tanıyın.Ardından deney sıcaklığını seçin ve titrasyon sırasında ligand ile makromolekülün yeterli düzeyde karışması için gerekli olan şırınga karıştırma hızını girin; deneysel parametre kurulumunun ardından deneyi başlatın. Deney sona erdiğinde, final ısı sinyali doygunluğa yakın olmalıdır. ITC'yi üretici protokolüne göre temizleyin ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için titrasyonları en az bir veya iki kez daha tekrarlayın.Son olarak, örneğin bulunduğu hücredeki tampon çözeltiye ligand titrasyonu yaparak bir kontrol deneyi gerçekleştirin; bu işlem, ligandın seyreltme ısısını belirlemek içindir. Verilerin ligand uyumlandırması, herhangi bir veri uyumlandırma programındaki makrolar kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Burada veri uyumlandırmasını göstermek için MicroCal tarafından sağlanan Origin Seven programı kullanılmıştır. İşleme başlamak için ilk veri dosyasını yükleyin.Ham termogramda, baz çizgisindeki ani yükselmeler veya enjeksiyon noktası olmayan yerlerdeki pikler gibi sinyalde hava kabarcığı veya diğer artefakt belirtileri olup olmadığını kontrol edin. Bu veri noktaları çıkarılması gerektiği için bunları not edin. Ardından, ligand dilüsyon kontrol verilerini yükleyin ve bunları mevcut bağlanma izoterminden çıkarın.Seyreltme artefaktlarının genellikle meydana geldiği titrasyonun ilk birkaç veri noktası da dahil olmak üzere tüm hatalı veri noktalarını kaldırın. Ardından veri uyum modelini seçin. Model seçildikten sonra; stokiyometri, entalpi ve bağlanma afinitesi gibi uyum parametrelerinin başlangıç tahminleri manuel olarak girilerek veriler uydurulabilir.Buna karşın, eğer ortogonal deneylerden herhangi bir parametreye dair ön bilgi mevcutsa, bu değerler girilmelidir; çünkü bu durum, uyumlama sırasında verilerin yerel minimumlarda kalmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Veriler ilk titrasyon için uyumlandıktan sonra, veri analizi adımlarını geri kalan izotermler için tekrarlayın. Alternatif olarak, veriler "said fat" gibi bir program kullanılarak küresel olarak uyumlanabilir; küresel uyumlamayı başlatmak için verileri Origin'de bir .dat dosyası olarak kaydedin.Ardından verileri söz konusu yazılıma aktarın. Uydurma için bir model seçin ve küresel chi-kare değeri minimuma ulaşana kadar simplex ve Marquardt-Levenberg uydurma seçenekleri arasında geçiş yaparak verileri küresel olarak uydurun. Bu videoda gösterilen temsili ITC prosedürü, N-A-D-P-H'nin e coli kromozomaldehidrofolat redüktazına bağlanmasını izlemektedir.N-A-D-P-H'nin dihidrofolat redüktaza ekzotermik bağlanması, ısı açığa çıktığı için ham termogramda belirgindir. Her ardışık enjeksiyonda azalan ısı sinyalleri, titrasyonun ilk yarısında gerçekleşen bağlanma doygunluğunu gösterir. Bileşenlerin saflığı ve tamponların iyi uyumu, ligandın dilüsyon ısısından kaynaklanan yalnızca minimal ısı sinyallerinin olduğu grafiğin doygun kısmından anlaşılmaktadır.Bağlanma izotermini ortaya çıkarmak için veriler Origin yazılımı kullanılarak tek bölgeli bir modele uyduruldu. Ardından, iki veri seti söz konusu model kullanılarak tek bölgeli bir modele uyduruldu. Artıkların küçük değerleri ve rastgele dağılımı, termodinamik parametrelerin makul olduğunu göstermektedir. Bu parametreler ayrıca, ortogonal yöntemlerle elde edilen literatür değerleriyle karşılaştırılarak doğrulanmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, çözeltilerin uygun şekilde hazırlanması, deneysel parametrelerin ayarlanması ve verilerin analizi yoluyla, bir MicroCal VP-ITC kullanarak ligand makromolekül bağlanmasını nasıl inceleyeceğiniz konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Bu video, bir biyomolekül ve bir ligand arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan bir teknik olan diferansiyel taramalı kalorimetriyi göstermektedir. Bir DNA aptamer ve bir termolabil ligandın bağlanması, numuneye tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri uygulanarak ve termodinamik analiz için taramalar elde edilerek incelenir.

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

Öğrenin makromolekül-ligand bağlanmasını izotermal titrasyon kalorimetresi ile incelemeyi. Bu yöntem, E. coli dihidrofolat redüktazı ve NADPH kullanarak bağlanma termodinamiğini tek deneyde belirler.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Daha fazla video keşfet