Name: Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin, fare yumurtalık ve fallop borularında üç boyutlu organ kültürü yöntemiyle normal epitel hücrelerini yetiştirmeyi. Bu teknik, yumurtalık kanserinin erken evrelerini incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Yumurtalık Kanseri Araştırma tarafından desteklenen Fonu [hibe LT/UIC/01.2011], Klinik ve Translasyonel Bilim, UIC Kanser Merkezi ve Sağlık hibe C06RR15482 National Institutes of UIC Merkezi. UIC Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış hayvan bakım protokolleri altında AAALAC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı. Bu proje için Animals of Illinois at Chicago Üniversitesi Biyolojik Kaynaklar Laboratuvarı (BRL) bariyer odalar yerleştirilmiştir. BRL, günde en az iki kez hayvanlar izler ve hayvan bakımı konusunda danışmanlık sağlayan bir tam veteriner bir kadroya sahiptir.

1. Yumurtalık diseksiyon ve doku yalıtımı <ol><li> % 0.5 'lik (w / v) sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın, protokol değiştirilmiş bir versiyonu hazırlamak steril PBS ve 37 ısı ° C kullanarak, daha önce 5 açıklanan Inversiyon veya sallanan karıştırın, ancak girdap yok. 25 G iğne ile 1 ml şırınganın içine aljinat çizin ve 37 ° korumak ° C </li><li> Crosslinking aljinat doku kapsülleme üzerine ve 37 sıcak ° C 10mM steril CaCl 2 çözüm hazırlayın </li><li> 1 ml kültür vasatı (αMEM + 5 adet penisilin ve 5 mg / ml streptomisin) başına her bir deney için 24 plaka hazırlayın. Kültür ortamında çeşitli ilaçlar, peptidler, ya da virüsler ekleyin. Organı kapsülleme önce transfeksiyon için, 37 ° C'de dört saat için Lipofectamine 2000 ve plazmid DNA doku inkübe </li><li> Hayvan organları teşrih, herhangi bir yağ ya da kalıntı doku kaldırmak, yumurtalık çevresindeki bursa membran yavaşça çekin ve organ bisecting dört adet yumurtalık veya yumurtalık kesmek. Hayvanlar servikal dislokasyon CO 2 boğulma tarafından ötenazi edildi. Boruların için, yavaşça bağlantı membranlar ayrı çekme ve zıt yönlerde kesmeden önce forseps kullanarak tüp biter uzanan doku çözmek. </li><li> Steril bir örgü lif üzerine tek bir aljinat damlacık (~ 1-3 mcL) yerleştirin. </li><li> Steril forseps kullanarak, organ aljinat damlacık ve merkezi forseps veya steril bir iğne kullanarak damlacık içine bir parça taşımak. </li><li> Steril forseps ile örgü lif açgözlü ve yerçekimi asılı damla aljinat zorlamasına izin ters çevirerek organ parçası (organoid) içeren damlacık haricindekileri. </li><li> Forseps 10cm petri açılan çözüm denk gelecek şekilde 10mM CaCl 2 çözüm içeren bir kenarına dokunun. </li><li> 2 dakika boyunca inkübe, kültür ortamı içine ekstra 10mM CaCl 2, ve transfer serbest bırakmak için gözenekleri içeren steril kaşıkla çıkartın. 24 plaka kültür ortamı içeren tek bir kuyunun içine dört aljinat jeller transfer edilebilir. Kültür belirli bir süre için. </li></ol> 2. Aljinat ve toplama hücrelerin bozunması <ol><li> Aljinat jel çözünürleştirme için kültürler, 37 ° C'de 30 dakika kadar veya jel tamamen eriyene Leibovitz L-15 medya çözünmüş aljinat liaz (3.4 mg / ml) kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Aljinat liaz doku çıkarın. </li><li> OSE toplanması için, 500 adet 1 saat 8 Leibovitz L-15 medya kollajenaz organoid kuluçkaya yatmaktadır. Vortex, 1 dakika için 1 saniye bakliyat (1 saniye vorteks ve 1 saniye geri kalanı) takip 1 dakika orta güç 2 saniye bakliyat (2 saniye girdap ve 2 saniye dinlenin),. Organı adet taze, steril mikrosantrifüj tüpe mikrosantrifüj tüp ve pipet süpernatant altına düşebilir. Pelet over yüzey epitel 3000 rpm'de 3 dakika santrifüjleyin. </li><li> Tubal epitel toplanması için, 5 adet penisilin ve 5 mg / ml streptomisin ve% 4 (v / v) FBS DMEM doku kültürü plastik uzunlamasına tüp kesme ve yer. 3-5 gün içinde, hücreleri tubal stroma "tarama" ve doku kültürü plastic9 üzerinde büyümek. </li></ol> 3. Kesitler için aljinat kapsüllü organ kültürleri fiksasyonu <ol><li> Seçilen bir zaman noktasında kültür ortamı boncuk kapsüllü aljinat toplayın. </li><li> Iki dakika süreyle steril 10mM CaCl 2 çözüm kültür bırakarak jel pekiştirmek için aljinat Recrosslink. </li><li> Jel sağlam kalır ve sabitleme sırasında tamamen doku kapsüller sağlamak için% 2 paraformaldehid 50 mM sukroz, 10 mM CaCl 2 ve 50 mM sodyum cacodylate içeren aljinat kapsüllü organı sabitleyin. </li><li> Takiben, doku işleme, parafin ve 5 mikron bölümleri oluşturmak için bir mikrotom bölüm içine tüm aljinat-kapsüllü organ kültürü parçası gömün. </li><li> Aljinat çözünmüş ve ısı tabanlı antijen alımı nedeniyle immünohistokimya performans halinde slayt kaldırılır olacaktır. Aljinat hematoksilen ve eozin boyama ayakta altında kalır ve eozin leke. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Yumurtalık ve yumurtalık üç boyutlu organ kültürünün bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Yumurtalıklar farklı boyutta parçalar halinde kesilir ve OSE çoğalırlar ve bistüri ile kesi yaralandı yüzey tamir göç. Bu süreçte, temel stroma göre OSE doğru yönde yumurtalık encapsulating OSE ile korunur. Şekil 2'de görüldüğü gibi, çeyrek veya sekizde oyulmuş yumurtalıklara karşılaştırıldığında yarıya yumurtalıkların OSE daha yumurtalık tamamen kapsülleyen. Over yara onarımıyüzey tüm yumurtalık bağlamında incelenebilir ve yumurtlama ve yüzey tamir over yüzey dönüşüm indükler nasıl ışık tutabilir. Deneyin son nokta, gerekli bilgileri bağlıdır. Mimari dokusu, hücresel morfoloji ve spesifik hücresel büyüme oranları kesitler kullanılarak kolayca takip edilmektedir. Örneğin, 7 gün boyunca 5 mg / ml insülin Ayrıca over yüzey epiteli ve çok katmanlı oluşumu hiperproliferasyonu indükler, tek bir over yüzey epitel tabakası 7 gün (Şekil 3A), serum serbest αMEM kültür sonra görülmektedir hücreleri (Şekil 3B). Fiksasyonu için 10 mcM 24 saat önce son bir konsantrasyonda kültürlere bromodeoxyuridine ekleyerek, hücre çoğalması (inset 3A ve 3B) ölçülebilir. Bakımı, serum serbest αMEM kültürler için, granüloza hücrelerinin daha büyük bir oranda çoğalırlar ise OSE yaklaşık% 3-5, 24 saat etiketleme dönemi sırasında (İçerlek 3A) yayılması tabi. Kültür ortamı insülin eklenmesi, toplam OSE yaklaşık% 30 (İçerlek 3B) OSE prolifere yüzdesi artar. Yeşil floresan proteininin (GFP) immünofloresan cDNA transfeksiyon (Şekil 3C) standart mikroskobu ile aljinat jel ile görüntülendi. Aljinat organ kültürü over yüzey epitel ve birincil foliküller büyüme ve analiz için sağlarken, olgun, ikincil foliküller bu kültürün sistemi (Şekil 3B) hayatta kalmak için başarısız olduğunu belirtmek gerekir. Başka bir yerde 10 bir aljinat hidrojel matriks içinde vade bireysel köklerinin Kültür tarif edilmiştir. Protein ya da RNA değişiklikler tüm organ veya özel hücre tiplerinden enzimatik bozulması (Şekil 4) kullanılarak analiz edilebilir. Bazı stromal hücreler izole olmasına rağmen (Şekil 4D) kollajenaz ile kültüre over organoids tedavisi, altta yatan stroma pelet tedavi sonrasında elde edilen hücre OSE zenginleşmesi için izin verirken (Şekil 4C) sağlam bırakır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 yaralama sonra OSE yaymak için kullanılan Fare yumurtalık üç boyutlu kültür sistemi. A) Mikroskop altında, Bursa ve çevresindeki yağ yastığı çıkarıldı. B) Bozulmamış oviductal tüp yumurtalık (O) (T) ve yağ yastığı (F). C) Bursa ve yağ yastığıyla birlikte Yumurtalık kaldırıldı (solda) ve uncoiled yumurtalık (sağda). D) Yumurtalık veya oviductal organoids aljinat bir damlacık içine yerleştirildi. E) Aljinatta kaplı organoids CaCl 2 çözüm crosslinking bir jel formu için aljinat içine düştü. F) Aljinatta over organoid kapsüllü. G) Aljinatta oviductal organoid kapsüllü. H) Aljinatta kapsüllü organoids kültür ortamında inkübe edildi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Yüzey alanı sitokeratin 8 ile ölçülen over yüzey rejenere. Sekizde, çeyrek, yarım, BSA orta kültür ve sitokeratin 8 (CK8) antikoru ile immünohistokimyasal analizi ile ölçülen oyulmuş sonra OSE over organoids Encapsulation. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Aljinatta kültür sistemi, geçiş ve büyüme faktörlerinin OSE içine cDNA transfeksiyon sağlar, ancak hızlı bir büyüme ve olgunlaşma köklerinin desteklemiyor . A) Yumurtalık organoid OSE işaretleri CK8 ifade analiz bazal ortamda 7 gün boyunca kültür. Ankastre, seri bölümü BrdU eklenmesi için boyandı. B) kültür ortamı insülin eklenmesi OSE hiperplazi neden olur. Ankastre, seri bölümü BrdU eklenmesi için boyandı. C) Yumurtalık organoid GFP ifade cDNA ile transfekte. D) Aljinatta kültür sistemi primordial foliküllerin (kırmızı ok ucu) büyümesini destekler, ama olgun değil ikincil foliküller (siyah ok). <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 OSE analizi aşağıdaki kültürü için izole edilebilir. A) 2 haftaya kadar orta ve kültüre organoid. B) Encapsulated organoid organoid sağlam çıkmak için aljinat liaz ile tedavi edilir. Yumurtalık işareti OSE CK8 ile boyandı. C) organoid yatan stroma ayrı OSE kollajenaz ile tedavi edilir. Kalan doku parçası over yüzey kaldırma vurgulamak için CK8 ile boyandı. D) CK8 (kırmızı) boyanmış olarak tedavi sonrası Toplanan hücrelerin OSE zenginleştirilmiştir. Hücreler, çekirdekleri işaretlemek için DAPI ile zıt.

<ol><li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2009.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+ovarian+carcinomas%3A+a+developmental+view%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The origin of ovarian carcinomas: a developmental view.</a> Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).</li>
<li>Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distal+fallopian+tube%3A+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).</li>
<li>Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ovarian+organ+culture+as+a+tool+to+study+normal+ovarian+surface+epithelial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair.</a> Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20, 45-53 (1999).</li>
<li>Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as biomaterials.</a> Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methoxychlor+and+estradiol+on+cytochrome+p450+enzymes+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).</li>
<li>Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+newly+established+clonal+oviductal+cell+lines+and+differential+hormonal+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+preventing+infection+after+abdominal+vascular+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma%22%5BJournal%5D)">Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries.</a> J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Oocyte+Maturation+and+Preantral+Follicle+Culture+from+the+Luteal+Phase+Baboon+Ovary+Produce+Mature+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes.</a> Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).</li>
<li>Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Hydrogels+for+cell+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Review: Hydrogels for cell immobilization.</a> Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).</li>
<li>Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bifunctional+alginate+lyase+from+Alteromonas+sp.+strain+no.+272+and+its+action+on+saturated+oligomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab Invest. 71, 510-518 (1994).</li>
<li>Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+ovarian+epithelial+carcinogenesis%3A+progress+and+problems+in+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches.</a> Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).</li>
<li>Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+human+ovarian+surface+epithelial+cells+and+adjacent+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix.</a> Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).</li>
<li>Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropins+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropins and ovarian cancer.</a> Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).</li>
<li>Fathalla, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incessant+ovulation--a+factor+in+ovarian+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia.</a> Lancet. 2, 163-163 (1971).</li>
<li>Espey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+hypothesis+that+mammalian+ovulation+is+comparable+to+an+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction.</a> Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).</li>
</ol>

Ifşa etmek için hiçbir şey yoktur.

Aljinat hidrojeller kullanan üç boyutlu organ kültürü sisteminin gelişimi organizmaların geniş bir yelpazede birçok farklı doku tipleri analiz etmek için çok yönlü bir yöntem temsil eder. 11 hücreleri büyümek için bir iskele sağlar 3D kültürlerin kullanımı, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanlarında uzatılabilir . Şu anda, bizim laboratuar insan yumurtalık ve fallop tüpü doku kullanarak ilk çalışmalar geçiyor, ancak, insan ve insan dışı primat folikülleri kültürü 12,13 tarif edilmiştir . ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta </td><td> Gibco </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM orta </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum aljinat </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum cacodylate </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> Polipropilen örgü lif </td><td> McMaster Carr </td><td></td><td> 45 &quot;geniş rulo; 0,0041&quot; açılış </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Aljinat liyaz </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9697 </td><td> Clostridium histolyticum itibaren </td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> Çözüm </td><td> Roche </td><td> 11074547001 </td><td> İnsülin / transferrin / sodyum selenit </td></tr><tr><td> Sitokeratin 8 antikor </td><td> Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası </td><td> TROMA-1 </td><td> 1:200 az kullanın </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vektör Labs </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeoxyuridine </td><td> Sigma </td><td> B50002-1G </td><td> Final konsantrasyon 10 mcM </td></tr></tbody></table>

yumurtalıklar ve fallop borularında Üç boyutlu organ kültür aljinatta hidrojeller

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Yumurtalık kanseri, kadınlarda kanser ölümlerinin beşinci önde gelen nedenidir ve Amerika Birleşik Devletleri 1% 63 ölüm oranına sahiptir . Over kanseri için menşe hücre tipi, söz konusu hala ya da over yüzey epitel (OSE) veya fallop tüpü fimbria 2,3 distal epitel olabilir. In vitro bir temel kültür olarak normal hücreleri Kültürleme, bilim adamları, böylece kesin olarak belirlenmesi, farklı epitel kökenli hücre tipi yumurtalık kanserine yol açabilir belirli değişiklikler modeline sağlayacaktır. Bu, bu hastalığın hedefleyen daha doğru biyobelirteçleri, doku spesifik gen değişiklikleri ile hayvan modellerinde ve daha iyi önleme stratejileri gelişimini sağlayacaktır. Aljinat hidrojeller normal hücreleri korumak, kendi üç boyutlu bağlamında hücrelerin in vitro kültürü kısa vadeli teşvik ve plazmid DNA, siRNA ve küçük moleküllerin giriş izin verir. Tek bir hayvan deney sayısını artırarak, tek bir organ oluşturulabilir bir neşter, çeşitli kültürler ile stratejik kesimler türetilmiştir adet kültür organları tarafından. Bu OSE çoğalması, yumurtalık kanseri oluşumu ile ilgili önde gelen yumurtlama modeli yönlerini keser. Hücre tipleri, plastik yüzeylerde iyi büyümek değil OSE olarak bu yöntemi kullanarak kültürlü ve normal hücresel süreçler veya 4 kanser oluşumu ilk olaylar soruşturma kolaylaştırmak olabilir. Aljinatta hidrojeller dokuların 5 birçok çeşit büyümeyi desteklemek için kullanılabilir. Aljinat zarar dokuların 6,7 nazik olmayan bir jelleşme eylem sonucunda, β-D-mannuronic asit ve kalsiyum iyonları ile çapraz bağlı olabilir α-L-guluronic asit birimleri tekrar oluşan lineer bir polisakkarit. Matrigel olarak diğer üç boyutlu hücre kültürü matrisler gibi, aljinat dokular için mekanik destek sağlar ancak, proteinler aljinat matris ile reaktif değildir ve bu nedenle hücre 5 sinyalizasyon başlatmak değildir sentetik ekstraselüler matriks olarak aljinat fonksiyonları. Aljinat hidrojel, standart hücre kültürü ortamında yüzer ve in vitro doku büyümesini mimarisini destekler . Hazırlama, ayırma, yumurtalık ve oviductal organ parçaları, iki hafta kadar kültür muhafaza edilebilir aljinat hidrojeller, içine yerleştirilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Organ kültürü protein ve RNA örnekleri analiz için hücrelerin enzimatik sürümü de açıklanmıştır. Son olarak, birincil hücre tipleri büyüme, farelerin genetik ölümsüzleşme olmaksızın mümkün ve nakavt ve transgenik fareler kullanmak araştırmacılar izin verir.

Üç boyutlu bağlamında normal hücreleri Kültür, hücresel dönüşüm ve tümörogenez için gerekli erken olayları incelemek için alternatif bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, normal yumurtalık ve yumurtalık kanseri oluşumu erken olayları incelemek için oviductal hücreleri büyümek için kullanılır.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Over kanseri, kadınlarda kansere bağlı ölümlerin beşinci önde gelen nedenidir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde %63'lük bir mortalite oranına sahiptir1. ... için köken hücre tipi...

Bu prosedür, normal over ve viduktal epitel hücrelerinin üç boyutlu bir organ kültürü olarak çoğaltılmasını tanımlamaktadır. İlk olarak, bir fareden over UCT yağ yastıkçığını ve uterusun bir kısmını diseke edin. Ardından bursayı çıkarın, bir penset yardımıyla viduktal membranları birbirinden ayırın ve her bir over veya UCT'yi organoid olarak adlandırılan iki ila dört parçaya bölün.Son olarak organoidi, bir ağ fiberi parçası üzerindeki bir aljinat damlacığına kapsülleyin. Belirlenmiş besiyerlerinde kültüre edilen OSC ve TEC, doğal üç boyutlu mimarilerinde normal hücre özelliklerini korurlar. Doku kesitleri üzerinde yapılan immünohistokimya, RNA analizi ve protein analizi, OSC ve TEC'in over kanseri üzerindeki etkisine dair bilgiler sağlayabilir.Bu tekniğin geleneksel iki boyutlu ölümsüzleştirilmiş hücresel kültüre kıyasla temel avantajı, hücrelerin, hücresel yolakları değiştirebilecek genetik ölümsüzleştirme işlemine gerek kalmadan, alttaki hücre dışı matris ve stromal hücrelerle temas halinde büyütülebilmesidir. Bu yöntem, kanser oluşumundaki erken olayların tanımlanması ve seröz over kanserlerinin hangi hücre tipinden kaynaklandığının belirlenmesi gibi over kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem over kanserine dair içgörü sağlayabilse de, over folikül kültürü ve pankreatik beta adacık kültürü gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, yumurtalıklara ve UCT'ye zarar vermeden bursa ve uc membranlarının uzaklaştırılmasının zor olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. İlk olarak, steril PBS içinde %0,5'lik bir aljinat çözeltisi hazırlayın ve ters çevirerek veya sallayarak karıştırıp 37 °C'ye ısıtın. Ardından, aljinatı 25 gauge iğneli bir mililitre şırıngaya çekin ve 37 °C'de tutun.Ardından, doku enkapsülasyonu sonrası aljinatı çapraz bağlamak için 10 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın. Ayrıca, 24 kuyucuklu bir plakada her deney için kuyucuk başına bir mililitre kültür medyumu hazırlayın ve kültür medyumuna çeşitli ilaçlar, peptidler veya virüsler ekleyin. Organları hayvandan çıkarırken, tüm yağ veya kalıntı dokuları temizleyin.Overi çevreleyen burs membranını nazikçe sıyırın ve organı ikiye bölerek overi veya UCT'yi dört parçaya ayırıp ovidukt dokusunu nazikçe açın. Bağlayıcı membranları birbirinden ayırın ve tüpün uçlarını zıt yönlere doğru uzatın. Pens kullanın.Kesme işleminden önce, steril bir ağ örgü fiber üzerine yaklaşık iki mikrolitre tek bir alginat damlası yerleştirin. Steril pensler kullanarak, organoid parçasını alginat damlasının içine taşıyın ve organoid içeren damlayı ters çevirmek için damlayı merkezleyin. Ağ örgü fiberi ters çevirin ve yerçekiminin, alginatı 10 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi içeren 10 santimetrelik bir Petri kabının kenarında asılı bir damla oluşturacak şekilde itmesine izin verin.Damlanın çözeltiye düşmesi için penseye hafifçe vurun. İki dakika boyunca inkübe edin. Fazla 10 millimolar kalsiyum klorürü uzaklaştırmak için gözenekli steril bir kaşıkla çıkarın ve belirli bir süre boyunca kültür ortamına aktarın.Aljinat jelin çözünürleştirilmesi için kültürleri, Ovitz L 15 besiyerinde çözünmüş 3,4 mg/mL aljinat liyaz içinde 37 °C'de 30 dakika boyunca veya jel tamamen çözünene kadar inkübe edin.Ardından dokuyu aljinat liyazdan çıkarın. OSE'yi toplamak için organoidi, ovitz ISS. L 15 besiyerinde 500 ünite kollajenaz ile bir saat boyunca inkübe edin; ardından bir dakika boyunca orta güçte iki saniyelik darbelerle vorteksleyin ve bunu bir saniyelik bir darbe ile takip edin.Bir dakika boyunca darbeli karıştırın (pulse). Organ parçalarının mikro santrifüj tüpünün dibine çökmesini bekleyin ve süpernatanı taze, steril bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin; over yüzey epitelyumunu çöktürmek için 3000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, tüp epitelyumunu toplamak için tüpü boylamasına kesin ve üç ila beş gün boyunca doku kültürü plastiği üzerine yerleştirin.Hücreler tübüler stromadan dışarı çıkacak ve doku kültürü plastiği üzerinde büyüyecektir. Alginatla kapsüllenmiş boncukları, seçilen zaman noktasında kültür ortamından toplayın. Kültürü iki dakika boyunca steril 10 millimolar kalsiyum klorür çözeltisine damlatarak jeli sertleştirmek için alginatı çapraz bağlayın.Şimdi, fikse etme işlemi sırasında jelin katı kaldığından ve dokuyu tamamen kapsadığından emin olarak alginatla enkapsüle edilmiş organı fikse edin. Plastik yüzeylerde iyi büyülemeyen OSC gibi hücre tipleri kültürlenebilir. Bu yöntem kullanılarak normal hücresel süreçlerin veya kanser oluşumundaki en erken olayların araştırılması kolaylaştırılabilir.Mikroskop altında, bursa ve çevresindeki yağ yastığı çıkarıldı ve alginat kapsüllü organoidlerin kültür ortamında inkübe edilmesi için işlendi. OSC, neşter ile yapılan insizyon sonucu oluşan yaralı yüzeyi, zaman ve mesafeye bağlı olarak onardı.Sito keratin sekiz antikoru kullanılarak yapılan immünohistokimyasal analiz, ikiye bölünmüş yumurtalıkların, dörtte bir veya sekizde bir parçalara ayrılmış yumurtalıklara kıyasla yumurtalığı daha eksiksiz bir şekilde kapsüllediğini göstermektedir. Doku mimarisi, hücresel morfoloji ve spesifik hücresel büyüme oranları, parafin kesitleri kullanılarak kolayca izlenebilir. Örneğin, serumsuz MEM içerisinde yedi gün boyunca kültüre edildikten sonra tek katmanlı bir yumurtalık yüzey epiteli gözlemlenir.Mililitre başına beş mikrogram insülinin yedi gün boyunca eklenmesi, over yüzey epitelinin hiper proliferasyonunu ve çok katmanlı hücre oluşumunu tetikler. Burada, cDNA transfeksiyonunu takiben, yeşil floresan proteinin immünofloresansı standart mikroskopi ile aljinat jel üzerinden görselleştirilmiştir. Aljinat organ kültürü, over yüzey epitelinin ve primer foliküllerin büyümesi ve analizi için imkan sağlasa da, olgun sekonder foliküllerin bu kültür sisteminde hayatta kalamadığı belirtilmelidir.Protein veya RNA'daki değişiklikler, enzimatik degradasyon kullanılarak tüm organdan veya belirli hücre tiplerinden analiz edilebilir. Kültürlenmiş over organoidlerinin kollajenaz ilele işleme tabi tutulması, alttaki stromayı bozulmadan bırakırken, işlem sonrası elde edilen hücre peletinde over yüzey epitelinin zenginleşmesini sağlar. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, her zaman steriliteyi korumanın önemli olduğunu unutmayın. Hücre morfolojisinin ve doku mimarisinin erken transformasyon olaylarına nasıl katkıda bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak için, bu prosedürün ardından immünohistokimya, western blotting ve transkripsiyon dizileri gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, over ve ovidukt üç boyutlu aljinat kültürünün nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

alginate-hydrogels-for-three-dimensional-organ-culture-ovaries

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

3D fibrin aljinat nüfuz ağ over folikül kapsülleme için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu sistem, olgun oosit üretmek için olgunlaşmamış köklerinin gelişimini desteklemek için proteolitik degradasyon ile yapısal destek birleştirir. Bu yöntem, hücre-hücre genişleme sınırlayıcı olmadan kişileri korumak için kültürü hücre agrega uygulanan olabilir.

Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

Bu videoda, bir 3D kültür oluşturmak için domuz kümülüsü-oosit komplekslerinin (COC'ler) fibrin-aljinat boncuklarda kapsüllenmesi için protokoller açıklanmaktadır. Bu in-vitro olgunlaşma sistemi, normal hücreden hücreye iletişimi sürdürerek oosit olgunlaşmasını sağlar ve canlılığı korur.

Domuz COC'lerinin 3D Kültürü: Fibrin-aljinat Polimer Hidrojel Boncuklarda Kümülüs Oosit Komplekslerini Kapsüllemek İçin Bir Prosedür

Bu protokol yenidoğan farelerde ve prepubertal farelerden alınan bireysel yumurtalık folikülleri gelen yumurtalıklarını kullanarak, fare yumurtalık dokusunun primer kültür / ko-kültür açıklar. kültür teknikleri yumurtalık üzerindeki dışsal ajanların etkisi soruşturma olanak veren yüksek fizyolojik bir şekilde gelişimini desteklemek ve yumurtalık foliküllerinin arasındaki etkileşimlerin.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Bu protokol, birincil insan yumurtalık yüzey epitel (hOSE) hücrelerinden üç boyutlu (3D) doku organoidlerinin oluşturulmasını açıklar. Protokol, yeni toplanan yumurtalıklardan hOSE'nin izolasyonunu, hOSE'nin hücresel genişlemesini, kriyoprezervasyon-çözme prosedürlerini ve organoid türevini içerir. İmmünofloresan, kantitatif analiz ve bir tarama platformu olarak sergileme yardımcı programı dahildir.

Doku Rejenerasyonunu İncelemek İçin Bir Platform Olarak İnsan Yumurtalık Yüzeyi Epitel Organoidleri

Bu protokol, fare yumurtalığından preantral folikülleri kapsüllemek ve kültürlemek için tiramin bağlantılı bir hyaluronan hidrojel kullanan yeni bir üç boyutlu (3 D) kültür modelini açıklar. Ayrıca vitrifikasyon yoluyla yumurtalık folikülü kriyoprezervasyonuna yönelik iki yaklaşımı da detaylandırıyoruz.

Üç Boyutlu Folikül Kültürü için Yeni Bir Hyaluronan Hidrojelin Uygulanması ve Fare Yumurtalık Folikülü Kriyoprezervasyonu için Metodoloji

İn vitro gametogenezi tamamlayan yeni bir iskelesiz agaroz kalıbında yumurtalık foliküllerini kültürleme yöntemlerini açıklıyoruz.

İskelesiz Fare Yumurtalık Folikül Kültürü için Özelleştirilebilir Agaroz Kalıplarının Üretimi ve Kullanımı

Fare yumurtalık somatik hücrelerinin stroma ile zenginleştirilmiş bir yumurtalık fraksiyonundan izole edilmesi ve iskelesiz bir yaklaşımla fare yumurtalık somatik organoidleri üretme yöntemlerini açıklıyoruz.

Yumurtalık Mikro Ortamını İnceltmek: Fare Yumurtalık Somatik Hücrelerinin İzolasyon, 2D Kültür ve Organoid Kültürü Yöntemleri

Öğrenin, fare yumurtalık ve fallop borularında üç boyutlu organ kültürü yöntemiyle normal epitel hücrelerini yetiştirmeyi. Bu teknik, yumurtalık kanserinin erken evrelerini incelemek için değerli bir araçtır.

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Daha fazla video keşfet