Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, kalın beyin kesitleri içindeki floresan nöronları daha kolay görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle beynin bir aeros tapa tutucuya gömülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, beynin sıkıştırılmış tom üzerinde kalın kesitlere ayrılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, beyin kesitlerinin gliserol gradyanı ile optik olarak berraklaştırılmasıdır. Prosedürün son adımı ise, berraklaştırılmış beyin kesitlerinin floresan görüntüleme için lamlara monte edilmesidir. Sonuç olarak, epi-floresan veya konfokal mikroskopi aracılığıyla kalın beyin kesitlerindeki nöronlarda yüksek çözünürlüklü floresan protein raporlayıcı ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin ince kesit, seri floresan mikroskopi veya çok foton görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha hızlı olması, daha az iş gücü gerektirmesi ve pahalı veya karmaşık mikroskopi tekniklerine ihtiyaç duymamasıdır. Başlamak için, kardiyak perfüzyon yoluyla NC iki fiksasyonuna tabi tutulmuş ve dört derece Celsius'da bir ila iki saat boyunca postfikse edilmiş fare beyin dokusunu geri getirin. Ardından, PBS içinde %2'lik yüksek dayanımlı düşük jel noktalı bir agar çözeltisi hazırlayın ve çözünene kadar mikrodalgada ısıtın.

Eritilmiş agarozu bir deney tüpüne aktarın ve sıcaklığı dengelemek için 40 °C'lik bir ısıtıcı bloğa yerleştirin. Agaroz dengeye gelene kadar, sabitlenmiş beyin dokusunu numune şırıngasının pistonuna yapıştırın. Sano Aate yapıştırıcı ile monte edilen dokuyu, beyin yüzeyini kaplamak için doygun sükroz PBS çözeltisine daldırın ve ardından pistonu piston yuvasının içine doğru çekin. Sıcak agarozu, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek beyin dokusunu tamamen kapatacak şekilde pistonun içine pipetle aktarın.

Son olarak, örnek şırıngasını yaklaşık bir dakika boyunca soğutucu bir blokla sabitleyin. Aros'u kurmak için, gömülü beyin dokusunu içeren örnek şırıngasını sıkıştırma yuvasına yerleştirin. Bıçağın kenarını örnek şırıngasının çıkışıyla yakından hizalayın ve ardından tampon tankını PBS ile doldurun.

Mikrometriyi döndürün. Gömülü beyin dokusunu numune şırıngasından dışarı çıkarmak için dilim kalınlığı kadar ileri sürün. İlk dilimi oluşturmak için kontrol ünitesindeki başlatma düğmesine basın.

İstenilen sayıda kesit elde etmek için, gömülü dokuyu ilerletme ve başlat düğmesine basma işlemini tekrarlayın. Kesitleri bir transfer pipeti ile toplayın ve PBS ile doldurulmuş cam bir inhalasyon şişesine aktarın; toplanan kesitlerin üzerindeki PBS'nin çoğunu pipetle çekip yerine PBS içinde %10 gliserol çözeltisi ekleyin. Kesitler dibe çökene kadar şişeyi, bir masaüstü döner çalkalayıcıda dört derece Celsius sıcaklıkta nazikçe sallayın.

Dekantasyon ve yeniden doldurma işlemini %25, %50 ve ardından %75 gliserol çözeltileri ile tekrarlayarak kademeli temizleme işlemine devam edin. %75'lik gliserol çözeltisini pipetle çekerek alın ve yerine %90'lık gliserol ekleyin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, nazikçe sallama yöntemiyle dört derece Celsius'ta dengeye getirin.

Kesitler maksimum düzeyde şeffaflaştırıldığına göre artık batmayacaklar, bunun yerine nötr kaldırma kuvveti göstereceklerdir. Bir pens yardımıyla, 25 by 75 milimetrelik bir mikroskop lamının görünür alanına sığacak şekilde, iki ila üç milimetre kenarlığı olan açık bir dikdörtgen şeklinde çift taraflı yapışkan kesin. Beyin kesitlerini lam üzerindeki kenarlığın içine yerleştirin.

lamel camını nazikçe yapışkan bandın üzerine indirin. Hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek ve sızdırmazlık sağlamak için baskı uygulayarak fazla gliserolü aspire edin ve ardından şeffaf oje sürerek lamel camının kenarlarını mühürleyin. Mühür kuruduktan sonra lam, dört derece Celsius'ta bir lam kutusunda saklanabilir veya görüntüleme işlemine tabi tutulabilir.

Hemen epi floresan mikroskopi kullanın. Geliştirilmiş GFP eksprese eden viral bir vektörün ekspresyon paterni, 200 µm kalınlığındaki bir fare beyni dokusu koronal kesitinde görülebilir. Burada, epi floresan görüntüsündeki vurgulanmış alan, tekil katman beş kortikal nöronlarını ortaya çıkarmak için konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlükte gösterilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, hızlı ve yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için fikslemiş kalın beyin kesitlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.