Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Bu prosedürün genel amacı, intravital görüntüleme kullanarak nanopartiküllerin tümörler tarafından alınmasını nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kuş embriyolarının kabuklarının soyulması ve kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, koriyoallantoik membran (cam) üzerinde ksenogreft tümörler oluşturmak ve bunların yaklaşık bir hafta boyunca büyümesini sağlamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, nanoparçacıkların damar yoluyla fareye enjekte edilmesi ve ksenogreft tümörün gerçek zamanlı intravital konfokal görüntülemesinin gerçekleştirilmesidir. Prosedürün son adımı ise tümörün çıkarılması ve kesitlenmesidir. Nihayetinde, nanoparçacıkların tümör tarafından alınımı görüntüler üzerinden nicelleştirilir ve ikincil tümör analizleri gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tümörlerdeki nanopartikül birikimlerinin dinamiklerini mikroskobik düzeyde değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü görüntülerin oluşturulmasına olanak tanımasıdır. Ayrıca, bu model sistem kullanılarak, tek bir araştırmacının iki hafta içinde çok sayıda deneysel grubu analiz etmesi mümkündür. Ek olarak, Shells embriyolarının Cory Alloid membranı, fiziksel manipülasyon ve invaziv olmayan görüntüleme için kolayca erişilebilirdir.

Laboratuvarım, kanserde hedeflenmiş moleküler görüntüleme ve ilaç iletimi için nanoparçacıkların geliştirilmesine odaklanmıştır. Detaylı alım analizlerinin gerçekleştirilebileceği hızlı ve düşük maliyetli bir ksenogreft modeli arayışımız bizi kabuklu tavuk embriyosuna yönlendirmiştir. Burada, modifiye edilmiş bir kabuklu tavuk embriyosu modelindeki insan tümör ksenogreftlerinde nanoparçacık alımını değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanıyoruz.

Bu protokol için, dördüncü gündeki döllenmiş tavuk embriyolarını hazırlayın ve kabuklarını soyun. Standart yöntemi kullanarak, kalp atışını kontrol ederek embriyoların döllenmiş ve canlı olduğundan emin olun ve embriyonik dokuzuncu güne kadar 38 °C sıcaklıkta ve en az %60 bağıl nemde inkübe edin. Dokuzuncu günde embriyolar tümör hücresi inokülasyonu için hazır hale gelir.

18 gauge bir iğneyi, beş ila altı inç uzunluğunda bir tigon tüp aracılığıyla bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayarak bir mikro enjektör düzeneği kurun. İğnenin eğimli ucunu dikkatlice tüpün içine yerleştirin. Tüpün yaklaşık dört ila beş inçlik kısmı iğnenin ucundan dışarı uzanmalıdır.

Şimdi, tümör hücresi süspansiyonunu boru aracılığıyla şırıngaya çekin ve ters çevirin. Hava kabarcıklarını gidermek için şırınganın yan tarafına dikkatlice vurun ve pistonu aşağı itin. Ardından, borunun ucuna bir mikroenjeksiyon cam iğnesi yerleştirin ve hücre süspansiyonu iğnenin ucuna ulaşana kadar pistonu aşağı itin.

Şimdi, bir diseksiyon mikroskobu altında, 10.000 ile 100.000 arasında kanser hücresini kam içindeki interstisyel boşluğa yavaşça ve dikkatlice enjekte edin. Hücreler kam içerisinde görünür bir bolus oluşturmalıdır; kam yüzeyine çöken hücreler, bir kim wipe veya pamuklu aplikatörle hafifçe tamponlanarak temizlenebilir. Şimdi embriyoları, en az %60 nem oranına sahip 38 °C'lik bir inkübatöre geri yerleştirin.

Tümörün büyümesine ve damarlanmasına yedi güne kadar izin verilmiş ve görüntüleme öncesinde çapı en az beş milimetreye ulaşmıştır; nanopartiküller, intravital mikroskop ile uyumlu bir floresan boya ile işaretlenmeli ve en az bir yıl boyunca stabil kaldıkları PBS içinde dört santigrat derecede saklanmalıdır. Ardından, mikro enjektöre çekilmeden önce, herhangi bir agregatı çöktürmek için nanopartikülleri bir dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi nanopartikülleri seyreltmek için PBS kullanarak, nihayetinde 50 mikrolitre hacimde 50 mikrogram nanopartikül enjekte etmek amacıyla mililitre başına bir miligramlık bir çalışma konsantrasyonu hazırlayın.

Şimdi embriyonik gelişimin 16. gününde enjeksiyonlara geçiniz. İntravenöz olarak en iyi tümör taşıyan embriyoları seçebilmek için tümörlerin yeterince vaskülarize olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücrelerinden ve nanopartiküllerden spektral olarak farklı, düşük moleküler ağırlıklı floresan bir dekstrin enjekte edin.

Ardından, dekstrini floresan mikroskobunda görüntüleyin ve en damarlanmış tümörlere sahip embriyoları seçin. Embriyolar seçildikten sonra, hazırlanan nanopartiküllerden en az 200 µL damlatmak için hazır bir mikro enjektör kullanın. Şırıngayı ters çevirin.

Hava kabarcıklarını gidermek için kenara dikkatlice vurun ve pistonu aşağı itin. Ardından, tüpün ucuna uzun, konik bir cam mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin ve nanopartikül çözeltisi iğnenin ucuna ulaşana kadar pistonu aşağı itin. Kör bir iğne ektodermi delmeyecek, aşırı keskin ve ince bir iğne ise dokuya yerleştirildiğinde kırılacaktır.

Ardından, nanopartiküller enjekte edildikten hemen sonra görüntüleme yapılacak olan taraftan uzak bölgedeki embriyolara intravenöz olarak 30 ile 200 µL arasında nanopartikül enjekte edin. Bir sonraki bölümde açıklanan tümörler için işlem, embriyo görüntüleme ünitesinin hazırlanmasıyla başlar. İlk olarak, kapağın alt kısmındaki görüntüleme portunun çevresine ince bir tabaka vakum gresi sürün.

Ardından, porta 18 mm'lik bir cam lamelle kapatıcı yerleştirin. Şimdi, kapatıcı lamelle görüntüleme yapılacak istenen bölgenin üzerinde olacak şekilde embriyoyu üniteye yükleyin. Ünitenin kapağını, lamelle embriyoyla sadece temas edene kadar yavaşça indirin ve kapağı vidalayarak sabitleyin.

Şimdi, embriyo içeren kabı 37 °C su ile görüntüleme ünitesine doldurun. Bu ünite, embriyoyu döner disk konfokal floresan mikroskobu altındaki döner disk konfokal mikroskopta sabit tutacaktır. Çevresel odacığın 37 °C olduğunu kontrol edin.

Şimdi, lamelle penceresi doğrudan mikroskobun altında olacak şekilde görüntüleme ünitesini tablaya yerleştirin. Objektifi ayarlayın ve görüntüleme işlemine geçin. Enjeksiyondan hemen sonra ve saatlik aralıklarla tümörün ve çevre damar yapısının yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarını edinin.

Ardından, görüntüler tümör vaskülatüründe meydana gelen ayrıntılı yapısal değişiklikleri yansıtacaktır. Embriyo, su banyosunu değiştirme ihtiyacı olmadan 36 saate kadar sürekli olarak görüntülenebilir. Görüntülerden viral nanopartiküllerin alımını nicelleştirmek için velocity gibi bir yazılım paketi kullanın.

Öncelikle tümörü seçin ve onu çevreleyen stromadan ayırın. Seçim işlemi, tümörün floresan dekstrin ile işaretlenmesiyle kolaylaştırılır. Şimdi tümördeki ve bitişik stromanın temsili alanlarındaki nanopartiküllerden gelen ortalama floresan sinyalini hesaplayın.

Ardından, ortalama sinyal oranını hesaplayın. Tümör seçimini ortalama sinyale göre güçlendirin. Stromal seçimi güçlendirin.

Birden büyük bir oran, nanopartiküllerin tercihen tümörde yerleştiğini gösterir. HT 29 kolon kanseri hücreleri, dokuzuncu gün camı içerisine yaklaşık bir milimetre çapında bir bolus oluşturacak şekilde enjekte edildi. Yedi günlük inkübasyonun ardından tavuk embriyolarına, tümör vaskülarizasyonunu doğrulamak için intravenöz olarak düşük moleküler ağırlıklı bir dekstrin enjekte edildi.

CPMV LOR 6 47 veya pegillenmiş CPMV LOR 6 47 nanopartiküllerinin intravenöz uygulaması ve ardından yapılan yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı konfokal görüntüleme, hem CPMV hem de pegillenmiş CPMV nanopartiküllerinin tüm damar sistemini hızla etiketlediğini ortaya koymuştur. Enjeksiyondan sonraki 12 saat içinde, tümör bölgelerine kıyasla stroma bölgelerindeki floresan sinyalinin miktar tayini, pegillenmiş CPMV'nin tümör tarafından alınımının, CPMV'ye göre yaklaşık üç kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra; kuş embriyolarının hazırlanmasından tümör hücrelerinin xenograft edilmesine, nanopartiküllerin intravenöz enjeksiyonuna ve gerçek zamanlı intravital konfokal görüntüleme ile tümörlerdeki nanopartikül alımının değerlendirilmesine kadar, bir kuş embriyosu modelinde tümör xenograftlarında nanopartikül alımını değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.