CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farelerde taze hasat edilmiş dokuda doğrudan kırmızı hücre öncüllerini tanımlamaktır. Bu, bu farelerdeki eritropoietik sistemin değişime uğradığı zamanlarda moleküler özelliklerini incelememizi sağlar. Örneğin, embriyonik gelişim sırasında veya hipoksik strese yanıt sırasında, ilk hematopoietik doku, fare fetal karaciğerinden veya yetişkin dalağından veya kemik iliğinden izole edilir ve tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır.

Daha sonraki hücreler, hücre yüzeyi belirteçleri CD 71 ve TER one 19'a karşı antikorlarla etiketlenir ve örneğin hücre sağkalımını veya hücre döngüsü durumunu ölçmek için diğer ilgili belirteçlerle, etiketlenmiş hücre süspansiyonu daha sonra bir akış sitometrisi analizörü kullanılarak analiz edilir ve olgunlaşmanın farklı aşamalarında spesifik eritroblast alt kümeleri tanımlanır. Bu spesifik alt kümeler, hücre sıralama ile saflaştırılabilir. Daha sonra, her bir eritroblast olgunlaşma alt kümesi için hücresel ve moleküler analiz yapılabilir.

Eritroblastı belirli olgunlaşma aşamalarında doğrudan yeni izole edilmiş hematopoietik dokularda tanımlama yeteneği, bize fizyolojik korteksteki hücreleri inceleme fırsatı verir. Bu nedenle bu yöntem, farklı olgunlaşma aşamalarının yüksek eritroblastlarını incelememize, in vivo yanıt vermemize izin verir. Fareler uyaranlara maruz kaldıklarında eritropoietik sandığı hızlandırırlar.

Örneğin, yüksek irtifa veya eritropoietin hormonunun enjeksiyonunu taklit eden hipoksik durumlar. Karmaşık bir doku ortamındaki bir blats'ı tanımlamak ve aynı anda sinyal sağkalımlarını ve hücre döngüsü durumlarını incelemek için çok parametreli akış sitometrisi kullanıyoruz. Ayrıca eritroblastları spesifik olgunlaşma aşamalarını doğrudan taze dokudan sıralayabilir ve gen ekspresyon seviyelerini, kromatin durumlarını veya diğer moleküler işlevlerini keşfedebiliriz.

Fare kesin eritropoez, yetişkin farenin dalağında ve kemik iliğinde gerçekleşir. Bu nedenle, bu dokular ötenazi yapılmış bir fareden toplanacaktır. Fareye ötenazi yapıldıktan sonra, EDTA veya heparin kan alma tüplerine kardiyak ponksiyon yoluyla kan alındıktan sonra, bu kan daha sonra hematokrit sayımı, retikülosit sayımı veya CBC analizi için kullanılacaktır.

Hasat edilen dalak ve uyluk kemiğini soğuk boyama içeren ayrı tüplere yerleştirin. Arabellek. İsterseniz hasat edilen dokuları buz üzerinde tutun. Dalağı tartın.

Eritropoietik stres tepkisi geçiren farelerin dalak ağırlığında önemli bir artış göstermesi muhtemeldir. Daha sonra, dalak hücreleri ve kemik iliği hücreleri, daha önce fare embriyosunda gösterilen prosedürlerle hasat edilen dokulardan hazırlanır. Kesin eritropoez, fetal karaciğerde embriyonik 12.5 ve 15.5. günler arasında gerçekleşir.

Zamanlanmış gebe dişi fareler, gebeliğin 12.5 ila 14.5. günlerinde fetal karaciğer hücrelerini elde etmek için hazırlanır. Zamanlanmış hamile dişi farelere ötenazi yapılır ve uterus boynuzları buz içeren bir Petri kabına çıkarılır. Soğuk kültür ortamı veya boyama tamponu.

Rahimden embriyoları çıkarmak için embriyonik gün 12.5 veya daha genç fetal karaciğerin diseksiyonu için bir diseksiyon mikroskobu gereklidir. Önce her bir boncuğu boynuzdan ayırın. Daha sonra, amniyotik kesesi içindeki embriyoyu serbest bırakmak için uterusun duvarını nazikçe eksize edin.

Amniyotik zarı nazikçe soyun. Fetal karaciğer, çok daha küçük bir kalbin altında bulunan en büyük kırmızı karın dokusudur. Fetal karaciğeri incelemek için, karaciğerin her iki tarafındaki embriyoyu hareketsiz hale getirmek için forseps kullanın ve karaciğeri yavaşça karın dışına ortama itin.

Karaciğeri yavaşça taze boyama tamponu içeren bir tüpe aktarın. Sonuçta, fetal karaciğerler diseke edildi ve taze boyama içeren bir tüpe aktarıldı. Tampon, karaciğerleri pipetleme ile mekanik olarak ayrıştırır, daha sonra ayrışmış hücreleri 40 mikronluk bir naylon ağ elek yıkama hücresinden iki kez santrifüjleme ile süzün, süpernatanı atın ve boyama tamponunda tekrar süspanse edin.

İkinci yıkamadan sonra, hücreleri trian mavisi ile boyayın ve bir hemo sitometre kullanarak sayın. E 13.5'teki bir fetal karaciğerin yaklaşık 10 ila yedinci vardır. Hücreler, akış sitometrik analizi için hücreleri bir ila iki kez, 10 mikrolitre numune başına 200 ila altıncı hücrede yeniden süspanse eder.

Bu video protokolünün amaçları doğrultusunda, akış sitometrisi için antikor boyaması sadece fetal karaciğer hücrelerinde gösterilecektir. Bu prosedüre başlamak için, fare hücrelerinde FC reseptörlerini bloke etmek için aşağıdaki, saflaştırılmış tavşan IgG'yi içeren bir birincil antikor boyama premiksi hazırlayın: CD 71 FETR bir 19 PE ve hücre yüzey proteinine hızlı bir şekilde yönlendirilmiş bir antikor. Tüpü iki ila üç kez ters çevirerek antikor çözeltisini nazikçe karıştırın, önceden hazırlanmış fetal karaciğer hücresi örneğine önceden karıştırılmış 200 mikrolitre birincil antikor boyaması ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Ardından, bu altı kontrol hücresi örneğini hazırlayın. Hücrelerin arka plan otofloresansını sağlamak için hücrelerin boyama tamponunda bırakıldığı boyanmamış bir numune, her antikor için tek bir renk veya kanallar arasındaki spektral örtüşmeyi düzeltmek için protokolde kullanılan renk, bu deneyde TUR bir 19 PE CD 71 fz hızlı, biotin ve streptavidin A PC ve hızlı biyotin için yedi A A DA floresan eksi bir kontrol, Bu, hücrelerin hızlı biotin hariç protokoldeki tüm renkler veya antikorlarla boyandığı kanal için gerçek arka planı sağlar. Numuneyi ve ilgili kontrolleri birincil antikor boyasında karanlıkta 45 dakika ila bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, her bir numune tüpüne üç mililitre boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve dört santigrat derecede yerçekiminin yaklaşık 400 katı ile üç ila beş dakika döndürün. Daha sonra, strep avid'i bir PC'ye uygulayın ve tüpleri 30 ila 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun tamamlanmasında, hücreleri ilk antikor lekesi gibi yıkayın.

Son olarak, ölü hücreleri dışlamak için hücre geçirimsiz, DNA boyası yedi a d içeren boyama çözeltisinde hücreleri yeniden süspanse edin. Numuneler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır. Bu prosedürün en zor yönü, eritrop alt kümelerinin güvenilir bir şekilde tanımlanmasını sağlayan akış sitometrik olaylarının doğru geçit analizidir.

Tüm doğru kontrol numunelerinin dikkatli bir şekilde makine kurulumu, spektral örtüşme için dikkatli bir telafi ve ardından ölü hücreleri, agregaları ve çok küçük olayları hariç tutan geçitleme gerektirir. Veri analizinin başlangıcında. Boyanmamış numune ve tek renk kontrol numuneleri, her renk kombinasyonu için spektral örtüşme telafisini ayarlamak için kullanılır.

Bu örnekte, fit e floresansının PE kanalına nasıl döküldüğünü ve bu spektral örtüşmenin kompanzasyondan sonra nasıl düzeltildiğini göstereceğiz. İlk olarak, lekesiz kontrolü kullanarak, uygun bir E pozitif ve PE negatif bölge tanımlarız. Ardından, fit E tek renk kontrolünü kullanarak, PE kanalına spektral yayılmayı görselleştirebiliriz.

FlowJo yazılımı ile dijital kompanzasyonun ardından, PE kanalındaki yayılma uyumu E sinyali en aza indirilir. Telafi edildikten sonra ölü hücreler, agregalar ve küçük olaylar uzaklaştırılabilir. Toplamalar ve hücre çiftleri, ileri dağılım yüksekliğine karşı ileri dağılım alanı çizilerek ve dar bir çapraz geçit içindeki olaylar seçilerek kaldırılır.

Ölü hücreler, dapi A hücresi geçirimsiz DNA kalıbı için negatif olan hücreler seçilerek uzaklaştırılır. DAPI negatif canlı hücre kapısı ayrıca, çok düşük bir ileri saçılmaya sahip olan çekirdekler veya enkaz gibi çok küçük olayları da hariç tutar. Daha sonra, fetal karaciğer hücreleri için geçit stratejisini göstereceğiz.

Taze hasat edilmiş hücreler CD 71 TUR one 19 için etiketlendi ve eritroid olmayan soy belirteçlerine yönelik ZI etiketli antikorlardan oluşan bir kokteyl uygulandı. Bu örnekte, numuneler zaten spektral örtüşme için telafi edilmiş ve daha sonra agregaları, ölü hücreleri ve çok küçük olayları hariç tutmak için kapılanmıştır. Bir fitzy histogramı çizmek ve soy negatif hücre kapısını tanımlamak için soy pozitif fitzy boyası dışındaki tüm renkleri içeren FMO örneğini kullanıyoruz, daha sonra bu kapıyı ZI konjuge soy belirteçleri ile boyanmış fetal karaciğer hücresi örneğine uyguluyoruz.

Köken negatif hücreleri seçilir ve Y ekseninde CD 71 ve TER bir 19 ile çizilir. A ekseninde, hücreler artık S sıfırdan S beşe kadar olan alt kümelere bölünmeye hazırdır. Lin tükenmiş S sıfır alt kümesi, büyük ölçüde EPO bağımlılığının başlamasından önce CFUE potansiyeline sahip hücreleri içerir.

S bir alt kümesi, büyük ölçüde hücre döngüsünün S fazında EPO'ya bağımlı CFUE hücrelerini içerir. S iki alt küme hücresi koloni oluşturma potansiyelini kaybetmiştir ve hemoglobini eksprese etmeye başlamıştır, S3 alt küme hücreleri büyük ölçüde bazofiliktir Eritroblastlar S dört ve S beş alt kümeleri geç eritroblastlar içerir. Burada, CD 71 ve TER one 19'a yönelik antikorlarla işlenen ve etiketlenen dalak hücrelerinden veri toplamanın yanı sıra ölüm reseptörü hızlı histogramı ile ilgili analiz stratejisi gösterilmektedir.

Biri, diyagonal kapının, çiftler veya daha büyük agregalar hariç, tek hücre olması muhtemel olayları temsil ettiği tüm edinilmiş olayları gösterir. Bu kapıdaki hücreler, burada ikinci histogramda daha fazla analiz edilir. Çok küçük olaylar, muhtemelen çekirdekler veya döküntüler hariç tutulur.

Kapılı hücreler, muhtemelen membran geçirgen apoptotik hücreler olan DAPI pozitif hücrelerin daha fazla analizden çıkarıldığı histogram üç'te gösterilmiştir. Histogram dört, ortaya çıkan canlı dalak hücresi popülasyonunu gösterir. Pro eGate, CD 71 yüksek TER içerir, bir 19 Ara hücre veya R, 19 yüksek hücre, histogram beşte daha fazla analiz edilir.

Burada, CD 71 yüksek hücreleri, daha az olgun geniş alana, bir eritroblastlara ve daha küçük, daha olgun AB eritroblastlara bölünür. Hücre yüzey proteinlerinin ekspresyonu, bu alt kümelerin her biri için TER, R, one 19 ve CD 71 ile aynı anda ilgili antikorların eklenmesiyle aynı anda ölçülebilir. Boyama histogramı altı, ölüm reseptörünün hücre yüzey ekspresyonunu hızlı bir şekilde gösterir, özellikle alanda, bazal durumdaki farelerde ve tek bir doz E ppo enjekte edilen farelerde bir alt küme.

Sonuçlar, EPO'nun bölgedeki hızlı ekspresyonunu baskıladığını göstermektedir. Bir popülasyon in vivo hücre içi proteinlerin ekspresyonu veya hücre döngüsü durumu, her bir alt kümedeki hücreler için de ölçülebilir. Bu temsili hücre döngüsü analizinde, farelere BRDU ile intraperitoneal enjekte edildi ve kemik iliği 30 ila 60 dakika sonra toplandı.

CD 71 ve TER one 19 için boyanmaya ek olarak, hücreler, döngünün S fazında olan replikasyon yapan D-N-A-B-R-D-U pozitif hücrelerine BRDU dahil edilmek üzere boyandı. Arayüz hücreleri BRDU negatiftir ve G bir veya G iki M fazına çözülebilir. DNAD kullanılarak, yedi A, A, D hücresi, PRO, E alanı, A, A, B ve A EC alt kümelerinin her birinden sıralanabilir.

Burada, hücre boyutunun azalması, nükleer yoğunlaşma ve hemoglobin ekspresyonunu yansıtan kahverengi renklenmenin artması ile sıralı olgunlaşma gösteren sitozin preparatlarında gösterilirler. Son olarak, E 13.5 fetal karaciğerdeki S3 alt kümesinin temsili bir hücre döngüsü analizi burada gösterilmiştir. Hamile farelere BRDU enjekte edildi.

Fetal karaciğerler 30 ila 60 dakika sonra toplandı, sabit perme ve CD 71, TER one 19 ve BRDU'ya karşı antikorlarla boyandı. S3 hücrelerinin hücre döngüsü durumu, S-fazı hücrelerinin nerede olduğu analiz edilir. BRDU pozitif ve DNA içeriği, yedi A a d DNA boyası için boyama ile ölçülür.

Tanımladığımız sitometrik yaklaşım, hücre yüzey belirteçlerinin ve diğer proteinlerin ekspresyonu, fosso spesifik antikorlar kullanılarak hücre sağkalımı hücre sinyalizasyonu ve hücre döngüsü durumu gibi hücresel fonksiyonların eş zamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Bu nedenle, eritroblastların moleküler tepkilerini, çok çeşitli uyaranlara farklı bir olgunlaşma aşamasını veya genetik mutasyonların etkisini araştırmamıza izin verir. Akış sitometrik olgunlaşma alt kümelerinin hücre yüzeyi işaretleyici ifadesi ve ileri saçılma açısından tanımlandığına dikkat edilmelidir.

Genel olarak, her bir alt kümedeki hücrelerin, çok çeşitli fare modellerinde benzer morfolojik eritroblast aşamasına karşılık geldiğini bulduk. Ancak, yeni bir fare modelini incelerken bunu doğrulamanızı öneririz. Her bir alt kümeden hücreleri sıralayarak ve morfolojilerini inceleyerek, her alt kümeden hücreler ayrıca RNA veya transkriptom analizi için de sıralanabilir: sıralama deneyleri, hücreler üzerindeki büyük stresi en aza indirmek için düşük sıralama basınçları ve geniş burunlar kullanır.

Ayrıca, her sıralama deneyinden sonra hücre saflığını ve canlılığını kontrol etmenizi öneririz. Son olarak, belirli bir alt kümenin frekansındaki bir değişikliği tespit ederken, bunun o alt kümedeki hücre sayısındaki gerçek bir değişiklikten mi yoksa diğer alt kümelerdeki değişikliklerden mi kaynaklandığını belirlemek önemlidir. Bu nedenle, alt küme frekanslarını ölçmeye ek olarak, her bir alt kümedeki mutlak hücre sayısını da ölçmek her zaman gereklidir.