Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ekotropik lentivirüs kullanarak insan hücrelerine onkogenlerin veya diğer potansiyel olarak tehlikeli genlerin aktarılmasını sağlamaktır. Bu işlem, fare retrovirüs reseptörünü kodlayan pantropik lentivirüsün yanı sıra, ilgilenilen geni kodlayan ekotropik lentivirüs üretilerek gerçekleştirilir; hücreler, onları ekotropik virüsle transduksiyona duyarlı hale getiren fare retrovirüs reseptörü ile transdukse edilir. Ardından, onkogeni aktarmak amacıyla hücreler ekotropik virüs ile transdukse edilir; transduksiyonu artırmak için polibrein ve kondroitin sülfat ile polimer kompleksleme kullanılır. Floresan mikroskopi ve FACS'e dayalı olarak, insan hücrelerinin tropik lentivirüs ile seçici şekilde transdukse edildiğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin gama retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lentiviral partiküllerin kök hücreler gibi bölünmeyen hücreler dahil birçok hücre tipini daha etkili bir şekilde transdükse edebilmesidir. Bu yöntem, potansiyel onkogenlerin fonksiyonlarının anlaşılması gibi kanser ve kök hücre araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamadan önce kurumsal güvenlik sorumlunuza danışın ve önerilen güvenlik kılavuzlarını takip edin.

Bir doku kültürü kabininde çalışarak, sağlıklı ve hızlı büyüyen 2 9 3 T hücreleri kültürü ile başlayın. Aseptik koşullar altında, 5 × 10⁶ adet 2 9 3 T hücresini 10 mL antibiyotiksiz 2 9 3 T besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir doku kültürü plağına pipetleyin ve plağı bir doku kültürü inkübatöründe, 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, öğleden sonra geç saatlerde transfeksiyona başlayın. İlk olarak, Optum'dan bir alikot ile transfer paketleme ve zarf plazmidlerini toplayıp oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin; ardından bir mikro santrifüj tüpüne 375 µL Optum pipetleyin ve üzerine 25 µL FUgene HD transfeksiyon reaktifi ekleyin. FUgene reaktifinin doğrudan medyanın içine pipetlendiğinden ve tüpün kenarına temas etmediğinden emin olun.

Ardından, ikinci bir mikro santrifüj tüpünde, beş µg transfer plazmidi, 3,75 µg paketleme plazmidi ve 1,25 µg zarf plazmidini, toplam hacmi 100 µL'ye tamamlayacak miktarda optimum ile birleştirin. Daha sonra, plazmid karışımını içeren tüpe Optum Fuji ekleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun son birkaç dakikasında, 2 9 3 T hücrelerini içeren plakadaki medyumu çok nazikçe aspire edin ve yerine 10 mL taze antibiyotiksiz 2 9 3 T medyumu ekleyin.

Son olarak, FU gen plazmid karışımını 10 santimetrelik plağın besiyerine damla damla ekleyin. Plağı 37 °C ve %5 karbondioksite ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plaktaki besiyerini çok nazik bir şekilde aspire edin ve taze, antibiyotiksiz 2 9 3 T besiyeri ile değiştirin.

Ardından plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve iki gün daha inkübe edin; transfeksiyondan üç gün sonra plaktaki virüs içeren medyumu aspire edin ve 0,45 mikronluk düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanarak süzün. Virüsü filtreledikten sonra, taze antibiyotiksiz medyuma mililitre başına altı mikrogram polybrenan ekleyerek floresan kontrol virüsü ile seri dilüsyonlar hazırlayın ve bu dilüsyonları uygun hücre hattındaki hücreleri transdüse etmek için kullanın. Ertesi gün, 24 kuyucuklu plakadaki medyumu taze, antibiyotiksiz medyumuyla değiştirin ve hücrelerin floresan proteini eksprese etmesine olanak tanımak için inkübasyonu iki gün daha sürdürün.

Her viral dilüsyon için transduce edilmiş hücre oranını belirlemek için verileri kullanın. Ardından, çoklu transduksiyon olaylarını minimize etmek için %15'ten daha az transduksiyon sağlayan dilüsyonlara dayanarak, mililitredeki dönüştürücü birim cinsinden titreyi hesaplayın. Paralel olarak üretilen diğer floresan olmayan lentivirüslerin titrelerinin, floresan virüsünkine benzer olduğu varsayılır.

Hedef hücreleri transduse etmek için, çoğu hücrenin transduse olmasını sağlamak amacıyla iki'den büyük bir enfeksiyon çokluğu seçerek başlayın. İlk olarak, viral süpernatantı taze tam kültür ortamında gerekli enfeksiyon çokluğuna gelecek şekilde seyreltin. Mililitre başına altı mikrogram polybrene ekleyerek toplam hacmi bir mililitreye tamamlayın.

Hedef hücrelerin bulunduğu 35 milimetrelik bir kaptaki medyumu aspire edin ve bir mililitre seyreltilmiş viral süpernatant ekleyin. Arzu edilirse, SLC seven A one reseptörünün yeterli ekspresyonu için doku kültürü inkübatöründe 24 ila 48 saat inkübe edin. Yazılı prosedürdeki talimatlara uygun olarak, SLC seven A one eksprese eden stabil olarak transduce edilmiş hücreleri seçmek için blasteysin ile antibiyotik seçimi yapın.

Toksisite belirleme işlemine başlamak için, mililitre başına 20 miligram kondroitin sülfat stok çözeltisi ve mililitre başına 20 miligram Poly brain stok çözeltisi hazırlayın ve steril filtre ile süzün. Artan stok çözeltiler, ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklanabilir.

Ardından, polimer kompleks toksisitesini doğru şekilde belirlemek için gereken 96 kuyucuklu hücre kültürü sayısını belirleyin. MTT analizi kullanılarak, kondroitin sülfat ve poly green'in en az altı farklı konsantrasyonu üç paralel şeklinde test edilmelidir. Buna ek olarak, indirgenmemiş hücreler ve serumsuz ortamda büyütülen hücreler de dahil edilmelidir.

Sağlıklı hücreler için bir temel oluşturmak ve sırasıyla büyüme durmasını kontrol etmek amacıyla ortama besiyeri eklenmelidir. Gerekli kuyucuk sayısı belirlendikten sonra, bir 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 5.000 hedef hücre ekleyin; paralel olarak, her deneysel koşulda transdüksiyon verimliliğinin mikroskobik veya gerçeklere dayalı analizi için bir 24 kuyucuklu plakaya hücre ekimi yapın ve her iki hücre setinin de gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün ise kondroitin sülfat stok çözeltisinden bir alikot ve poly brain stok çözeltisinden bir alikot ekleyin.

Ardından, GFP kodlayan virüsü, mililitrede altı mikrogram poly-L-lizinin bulunduğu antibiyotiksiz besiyerinde, kuyuk başına hedef hücrelerin yaklaşık %10 ila %50'sini transduce etmeye yetecek bir enfeksiyon multiplisitesine seyrelterin. Her plaka üzerindeki kontrol kuyucukları dahil olmak üzere her test koşulu için yeterli miktarda seyreltilmiş virüs olduğundan emin olun. Tüp setlerini, test edilecek her bir kondroitin sülfat ve poly-L-lizin polimer konsantrasyonuna göre etiketleyin.

Ardından, her bir koşul için viral süspansiyondan üç tekrar olacak şekilde tüplere uygun miktarda paylaştırın. Sonraki adımda, test konsantrasyonlarını oluşturmak için gerekli hacimdeki kondroitin sülfat ve poly brain stok çözeltisini sırasıyla her bir tüpe pipetleyin. Kondroitin sülfat ve poly green ilavesinin hemen ardından, karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.

Virüs kondroitin sülfat poly green karışımlarının oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesini sağlayın. Viral presipitatlar oluştukça karışım bulanıklaşabilir. İnkübasyonun ardından, 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarındaki medyumları aspire edin.

Ardından, planlandığı üzere virüs kondroitin sülfat poli yeşil karışımını kuyucuklara ekleyin. Ayrıca, kontrol ve serumsuz medyumu uygun kuyucuklara pipetleyin. İşlemi 24 kuyucuklu plaka için tekrarlayın ve doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.

Ardından, plaklardaki virüs içeren medyumu aspire edin ve taze medyum ile değiştirin. Plakları 48 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. 48 saat sonra 24 kuyucuklu plağı çıkarın ve her bir kondroitin sülfat ve poly brain konsantrasyonunun transduksiyon verimliliğini analiz etmek için facts kullanın.

Ertesi gün. 96 kuyucuklu plakanın tüm kuyucuklarındaki besiyerini aspire edin ve yerine 100 µL MTT çözeltisi ekleyin; MTT'nin metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondrilerinde indirgenmesine izin vermek için nemlendirilmiş bir inkübatörde üç saat boyunca kültüre edin. Üç saat sonra, MTT çözeltisini aspire edin ve yerine 200 µL çözücü çözeltisi ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya tüm mor MTT oluşup çökelek çözünene kadar inkübe edin. Absorbansı bir mikroplaka okuyucuda 570 nanometrede okuyun ve 690 nanometredeki arka plan okumasını çıkarın. Optimal polimer konsantrasyonu, hdf'ler için MTT ile belirlenen metabolik aktivite üzerindeki etkisi minimum düzeyde kalacak şekilde, transdüksiyonun maksimum düzeyde artışını sağlayacaktır.

Mililitre başına 100 mikrogram kondroitin sülfat. Bu yöntemle belirlendiği üzere, poli beyin optimal polimer konsantrasyonudur. İlk olarak, SLC seven A one reseptörü eksprese eden HDF hücrelerinin bulunduğu gerekli sayıdaki 35 milimetrelik kaplara transdüksiyon yapmak için yeterli miktarda 100 mikrogram/ml kondroitin sülfat poli yeşil viral sup natant karışımı hazırlayın. Polimer komplekslerinin oluşması için karışımı beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından hedef hücreleri eksprese eden reseptördeki medyumu aspire edin ve viral karışım ile değiştirin; viral karışımı uzaklaştırdıktan sonra 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Viral komplekslerin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için hücre yüzeyini iki kez PBS ile yıkayın. Kalıntı polimer komplekslerinin hücre sağlığı üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi gözlemlenmediğinden, tamamen uzaklaştırılması gerekli değildir.

Bu floresan mikroskop görüntüsü, transdüksiyon verimliliğini izlemek için floresan kontrol vektörleri kullanıldığında, tropik virüs ile SLC seven A one'ı stabil şekilde eksprese eden insan sarkom hücrelerinin yeterli düzeyde transdükte edildiğini göstermektedir. FACS analizi kullanılarak yapılan floresan kantifikasyonu, %90'ın üzerinde bir transdüksiyon verimliliği olduğunu kanıtlamaktadır. Hücreler blastatize edilmediği ve reseptör ekspresyonu için seçilmediği için HDFS'nin transdüksiyon oranları genellikle daha düşüktür; S-L-C-H-S-C üzerinde ölçülen tropik lentivirüs titreleri genellikle VSV psödotiplenmiş virüslerin %10 ila %20'si kadardır. MTT canlılık testi, burada kondroitin sülfat konsantrasyonları ile birlikte virüs transdüksiyonunda görüldüğü üzere, hedef hücrelerdeki büyüme durmasının hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.

Mililitrede 800 mikrograma kadar poly brain, HDF metabolizması üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Virüs ve çeşitli konsantrasyonlarda kondroitin sülfat ile transdukte edilmiş HDF'lerin faks analizi gerçekleştirilmiştir. Poly green, tek başına poly green kullanımına kıyasla transdüksiyonda artış sağlamaktadır.

Maksimum artırım 100 µg/mL değerinde gerçekleşir. Kondroitin sülfat pol beyin, daha önce bildirilen değerlerden birkaç kat daha düşüktür. Bu nedenle, herhangi bir hücre tipinin kondroitin sülfat ile kompleksleşmesi için koşulların optimize edilmesi önemlidir.

Poly brain, S-L-C-H-S-C hücrelerinde gözlemlenen titreyi yaklaşık üç kat artırır. Pratikte bu durum, düşük virüs konsantrasyonlarında transdüksiyon verimliliği üzerinde, yüksek konsantrasyonlara kıyasla daha büyük bir etki sağlar; bu durum büyük olasılıkla yüksek virüs konsantrasyonlarındaki çoklu transdükse hücrelere ve reseptör saturasyonuna bağlıdır. Tropik virüs ile transdüksiyon, nöron retrovirüs reseptörü eksprese eden hücreler için spesifiktir.

Modifiye edilmemiş insan hücreleri tropik virüs ile transduksiyon edildiğinde, FACS analizi ve mikroskopik inceleme ile görüldüğü üzere, indirgenmemiş arka planın üzerinde bir floresans gözlenmemiştir. HDFS, reseptör yokluğunda transduksiyon göstermezken, reseptör ile ön transduksiyon floresan hücrelerle sonuçlanmıştır. Bu prosedür uygulanırken, virüsün modifiye edilmiş insan hücrelerini transduksiyon etmeyeceğinin doğrulanmasının önemli olduğu unutulmamalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, transduksiyonu artırmak için polimer komplekslemesi kullanımı da dahil olmak üzere, potansiyel olarak tehlikeli genleri insan hücrelerine aktarmak için tropik lentivirüsün nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.