Name: Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Öğrenin, ekotropik lentivirus ile insan hücrelerine onkogenleri güvenli şekilde aktarma yöntemini. Polimer kompleksasyonu kullanarak transdüksiyon verimliliğini artırın ve kanser araştırmalarında güvenli alternatif protokol geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

California Rejeneratif Tıp Enstitüsü tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.

1. Lentivirüs üretimi, hasadı ve dondurulması
<ol>
	<li>Bu protokole başlamadan önce kurumunuzun güvenlik sorumlusuna danışın ve önerdikleri güvenlik kılavuzlarını takip edin.</li>
	<li>1. Gün. Virüs üretmek için sağlıklı ve hızlı büyüyen 293T hücreleri ile başlayın. Hücreleri 5 x 106 
	10 cm'lik plak başına hücre sayısı. Virüs üretimi için antibiyotiksiz 293T medyumu (%10 FBS ve 4 mM L-glutamin içeren yüksek glikozlu DMEM) kullanın.</li>
	<li>2. Gün. Öğleden sonra geç saatlerde, 293T hücrelerini aşağıdaki şekilde transfekte edin (verilen sayılar bir adet 10 cm'lik plak içindir).
Tüm reaktiflerin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Pipetle... 375 μl bir mikrocentrifüj tüpüne OptiMEM ekleyin, ardından ekleyin 25 μl 
	Fugene HD. Seyreltilmemiş Fugene'in tüp yüzeyine temas etmesine izin vermeyin.</li>
	<li>Bir mikrosantrifüj tüpünde şunları karıştırın:
		<ul>
			<li>5 μg transfer plazmidi (Slc7a1, hedef vektör veya floresan kontrol vektörü)</li>
			<li>3.75 μg paketleme plazmidi (pCMV-dR8.91 veya psPax2)</li>
			<li>1.25 μg zarf plazmidi (pantropik için pMD2.G, ekotropik için pHCMV-EcoEnv)</li>
			<li>serumsuz OptiMEM'e 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>İki tübü birleştirin ve karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>293T hücrelerinin besiyerini 10 ml taze antibiyotiksiz 293T besiyeri ile değiştirin. Fugene/plazmit karışımını plağa damla damla ekleyin ve gece boyunca şu sıcaklıkta inkübe edin: 37°C, %5 CO22.</li>
	<li>3. Gün. 293T hücrelerinin ortamını, 10 ml taze antibiyotiksiz 293T ortamı ile değiştirin. 293T hücreleri yüzeye sadece gevşek bir şekilde tutunduğu ve ortamın monokatman üzerine çok güçlü pipetlenmesiyle yerinden kopabileceği için dikkatli olun. Virüs üretimi için nemlendirilmiş bir inkübatörde iki gün boyunca inkübe edin.</li>
	<li>5. Gün. Virüsü hasat edin ve 0,45 mm'lik düşük protein bağlama kapasiteli bir filtre ile filtreleyin. Hemen kullanın veya tek kullanımlık alikotlara bölerek -da dondurun.80°CDondurulmuş pantropik ve ekotropik virüslerin titresi, sırasıyla altı aylık ve bir aylık saklama sürelerinden sonra yeniden belirlenmelidir.</li>
	<li>Transdüksiyona nispeten uygun hücreler kullanarak virüs titrasyonunu şu şekilde gerçekleştirin. Hücreleri, taze besiyeri içerisinde seri dilüsyonlar (örneğin 1:10, 1:10, 1:10) kullanarak floresan kontrol virüsü ile gece boyunca transdükte edin. 6 μg/ml PB. Ertesi gün taze besiyeri ile değiştirin. Transdüksiyondan sonra hücrelerin floresan proteini eksprese etmeye başlaması için iki gün bekleyin, ardından FACS ile transdükse edilmiş hücrelerin oranını belirleyin. Belirli dilüsyonları temel alarak, ml başına transforme eden birim (TU) cinsinden titre değerini hesaplayın. &lt; Çoklu transdüksiyon olaylarını minimize etmek için %15 transdüksiyon. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Titre hesaplama formülü, virüs kantifikasyon denklemi, virolojide matematiksel analiz." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Denklem 1">
	</li>
</ol>
2. İnsan hedef hücrelerinin fare retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile transduksiyonu
<ol>
	<li>Çoğu hücrenin transduklandığından emin olmak için enfeksiyon çokluğu (MOI) = 2 seçin. HDF'ler gibi transduksiyona dirençli hedef hücreler için daha yüksek bir MOI gerekecektir; hücrelerin çoğunluğunun transduksiyonunu sağlamak için viral süpernatantı yalnızca 1:2 oranında seyreltiriz.</li>
	<li>Hedef hücreleri, virüs ile hedef hücre arasındaki elektrostatik etkileşimi artırarak transduksiyonu yükselten 6 μg/ml PB içeren taze kültür ortamında seyreltilmiş viral süpernatant ile gece boyunca transdukle edin.1 Difüzyon, transduksiyon verimliliğinde sınırlayıcı bir faktör olduğundan, ideal olarak 35 mm'lik bir plaka için 1 ml gibi minimum bir virüs hacmi kullanılmalıdır.</li>
	<li>Slc7a1 reseptörünün yeterli ekspresyonunu sağlamak amacıyla, ekotropik virüs ile transdukleme yapmadan önce virüsü uzaklaştırıp hücreleri en az 48 saat daha kültürleyin.</li>
	<li>(Opsiyonel) İsteğe bağlı olarak, Slc7a1 eksprese eden stabil transduklanmış hücreleri seçmek için blastisidin kullanılabilir. Transduklanmamış tüm hedef hücreleri 7 gün içinde öldüren en düşük etkili konsantrasyonu (genellikle 2 – 10 μg/ml arası) belirlemek için önceden bir blastisidin öldürme eğrisi oluşturulmalıdır. Slc7a1 virüsünün uzaklaştırılmasından yaklaşık 2 gün sonra, transduklanmış hücreleri blastisidin içeren ortama geçirin. Hücreleri blastisidin içeren ortamda 7 gün boyunca kültürleyin; bu noktada geriye kalan tüm hücreler retrovirüs reseptörünü stabil olarak eksprese edecektir; böylece bu hücreler hem ekotropik virüs ile transdukle edilebilir hem de stabil Slc7a1 eksprese eden bir hat olarak gelecekteki kullanımlar için bankalara saklanabilir.</li>
</ol>
3. Toksisiteyi belirlemek için polimer kompleks titrasyonu
<ol>
	<li>1. Gün. Hücreleri 96 kuyucuklu bir plakaya, her deneysel grup için en az üç tekrarlı kuyucuk bırakacak şekilde, kuyucuk başına 50 hücre olacak şekilde ekin. Sağlıklı hücreler için bir baz değer sağlamak amacıyla tam besiyerinde transdüksiyon yapılmamış hücreler ve kontrol olarak büyüme durmasını indüklemek için serumsuz besiyerindeki hücrelerden oluşan örnekler ekleyin. Paralel olarak, her deneysel koşuldaki transdüksiyon verimliliğinin mikroskobik veya FACS tabanlı analizi için hücreleri uygun bir formatta (örneğin 24 kuyucuklu plaka) ekin.</li>
	<li>2. Gün. Hem MTT hem de FACS analizleri için hazırlanan plakalardaki hücreleri, hedef hücrelerin yaklaşık %40'ını transdükte etmek için 0,5 MOI değerinde GFP kodlayan virüs ile transdükte edin. Optimal miktarları belirlemek için farklı CS/PB konsantrasyonlarını (örneğin her bir bileşenden 50, 100, 20, 40, 60 ve 800 mg/ml) ve ayrıca 6 μg/ml PB'yi test edin. Polimer komplekslerini aşağıdaki Bölüm 4'te açıklandığı şekilde oluşturun.</li>
	<li>3. Gün. Virüs içeren besiyerini uzaklaştırın ve taze besiyeri ile değiştirin. Plakaları nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	<li>5. Gün. Her polimer konsantrasyonu ile transdüksiyon verimliliğini belirlemek için FACS plakasını analiz edin.</li>
	<li>6. Gün. MTT plakasının tüm kuyucuklarındaki besiyerini uzaklaştırın ve 10 μl MTT çözeltisi (tam besiyerinde 1 mg/ml MTT) ile değiştirin. MTT'nin metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondrilerinde indirgenmesini sağlamak için nemlendirilmiş inkübatörde üç saat boyunca kültüre edin.</li>
	<li>MTT çözeltisini uzaklaştırın ve 20 ml MTT çözücüsü (izopropanol içinde 0,1 N HCl, %0,1 Igepal CA-630) ile değiştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında iki saat boyunca veya mor MTT formazan çökeleğinin tamamı çözülene kadar inkübe edin. Absorbansı bir mikroplaka okuyucuda 570 nm'de okuyun ve 690 nm'deki arka plan değerini çıkarın.</li>
	<li>FACS ile belirlenen maksimum transdüksiyon artışını sağlayan ve MTT ile belirlenen metabolik aktivite üzerinde minimum etkiye sahip olan optimal polimer konsantrasyonunu seçin. HDF'ler için, aşağıdaki Temsili Sonuçlarda gösterilen verilere dayanarak 10 μg/ml CS/PB seçtik.</li>
</ol>
4. Polimer komplekslemesi ile ekotropik transdüksiyon
<ol>
	<li>PB ve kondroitin sülfatın suda 20 mg/ml konsantrasyonda steril filtrelenmiş stok çözeltilerini hazırlayın. Alikotlayın ve -20°C'de saklayın.</li>
	<li>Viral supernatanı bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve taze kültür besiyeri ile istenen nihai konsantrasyona (örneğin 2 MOI) seyreltin. PB ve kondroitin sülfatın (konsantrasyonları yukarıdaki 3. adımda belirlenmiştir) eşit hacimlerini sırayla ekleyin ve her eklemeden sonra karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Çökeltiler oluştukça viral karışım anında bulanıklaşacaktır. Kompleks oluşumuna izin vermek için viral karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Reseptör eksprese eden hedef hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın, yerine viral karışımı ekleyin ve 37°C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin. Viral karışımı uzaklaştırdıktan sonra, viral komplekslerin temizlenmesine yardımcı olmak için hücre yüzeyini iki kez PBS ile yıkayın. Tamamen uzaklaştırmak gerekli değildir; kalıntı polimer komplekslerin hücre sağlığı üzerinde herhangi bir olumsuz etkisine rastlamadık.</li>
</ol>
5. Ekotropik transdüksiyon özgüllüğünün doğrulanması
<ol>
	<li>Ekotropik virüs ilk kez üretildiğinde, güvenlik açısından virüsün modifiye edilmemiş insan hücrelerini transdükte edemediğinin doğrulanması yerinde olacaktır. İnsan hücrelerini, nispeten yüksek konsantrasyondaki ekotropik lentivirüs ile (viral süpernatantın taze besiyerinde sadece 1 ila 2 kat seyreltilmesiyle) gece boyunca 6 μg/ml PB veya optimize edilmiş CS/PB konsantrasyonu kullanarak transdükte edin.</li>
	<li>Virüs içeren besiyerini uzaklaştırın ve taze besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 2 gün inkübe ettikten sonra, floresan vektörler kullanarak FACS ile ve/veya transgen-spesifik primerlerle RT-PCR yaparak transgen ekspresyonunu doğrulayın.</li>
</ol>
6. Temsili sonuçlar:
Şekil 1A lentivirüs üretim sürecini, Şekil 1B ise murin retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile ön transdüksiyonu da içeren ekotropik lentivirüs ile insan hücrelerinin transdüksiyonunu göstermektedir. Virüs titrasyonu için, Slc7a1 ile stabil olarak transdükse edilmiş bir insan rabdomiyosarkom hücre hattı (Slc-hRMS) kullanıyoruz. Transdüksiyon verimliliğini izlemek için floresan kontrol vektörleri kullanıldığında, Şekil 2A ve 2B'de gösterildiği gibi, ekotropik virüs ile Slc-hRMS hücrelerinde rutin olarak &gt; 90% transdüksiyon verimliliği elde ediyoruz. HDF'lerin transdüksiyon oranları, hücreler reseptör ekspresyonu için blastisidin ile seçilmediği için genellikle daha düşüktür (Şekil 2C). Ekotropik lentivirüs titreleri, Slc-hRMS üzerinde ölçüldüğünde genellikle VSV-psödotiplenmiş virüsün %10-20'si kadardır (Şekil 2D).
Bir dondur-çöz döngüsü, ekotropik virüsün titresini %3 - 16 oranında azaltır; bu değer, VSV-psödotiplenmiş virüsün tek bir dondur-çöz döngüsündeki titre kaybına eşittir (p &gt; 0,05). Önceki raporların aksine,2 kuru buzda şok dondurmanın virüs titresi üzerinde herhangi bir pozitif etkisini gözlemlemedik. Aksine, virüs tüplerini sadece -80°C dondurucu (veriler gösterilmemiştir). 
MTT canlılık testi, hedef hücrelerdeki büyüme duraksamasının hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Virüs ile birlikte 80 μg/ml'ye kadar olan CS/PB konsantrasyonları ile yapılan transdüksiyonun HDF metabolizması üzerinde herhangi bir etkisi yoktur (Şekil 3A). Hücrelerin virüs olmadan CS/PB'ye maruz kalmasının da toksik bir etkisi yoktur (veriler gösterilmemiştir). Virüs ve çeşitli CS/PB konsantrasyonları ile transdükte edilen HDF'lerin FACS analizi, tek başına PB ile karşılaştırıldığında transdüksiyonun arttığını göstermektedir (Şekil 3B). Maksimum artış, daha önce bildirilen değerlerden3 birkaç kat daha düşük olan 10 μg/ml CS/PB konsantrasyonunda gerçekleşmektedir (Şekil 3C). Bu nedenle, herhangi bir hedef hücre tipi için koşulların optimize edilmesi önemlidir.
CS/PB ile kompleksleşme, Slc-hRMS'de gözlemlenen titreyi yaklaşık 3 kat artır (Şek. 4A, p &lt; 0.01). Pratikte bu durum, düşük virüs konsantrasyonlarında transdüksiyon verimliliği üzerinde yüksek konsantrasyonlara göre daha büyük bir etki yaratır (Şek. 4B); bu durum büyük olasılıkla yüksek virüs konsantrasyonlarındaki çoklu transdükse hücrelerden ve reseptör doygunluğundan kaynaklanmaktadır.
Ekotropik virüs ile transdüksiyon, fare retrovirüs reseptörü eksprese eden hücreler için özgüdür. Şekil 5A'da gösterildiği üzere, modifiye edilmemiş insan hücrelerine ekotropik virüs ile transdüksiyon uygulandığında, PB veya CS/PB kullanımıyla fark etmeksizin, transdükse edilmemiş arka plan seviyesinden daha yüksek bir floresans gözlemlenmemiştir. Mikroskobik olarak, HDF'ler reseptör yokluğunda transdüksiyon göstermezken (Şekil 5B), reseptör ile ön transdüksiyon yapılması floresan hücreler ile sonuçlanmaktadır (Şekil 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="293T hücrelerinin transdüksiyonunu ve viral süpernatant aşamalarını gösteren lentivirüs üretim süreci diyagramı." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. ... şematik görünümü (A) virüs üretim süreci ve (B) insan hücrelerinin önce fare retrovirüs reseptörüyle, ardından ekotropik lentivirüsle transduksiyonu.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Akış sitometrisi grafikleri, GFP+ hücre yüzdesi analizi, floresan mikroskopi, virüs titrasyonu sütun grafiği." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. GFP kodlayan ekotropik lentivirüs ile insan hücrelerinin yüksek verimli transdüksiyonu. Hücreler, önceden fare retrovirüs reseptörü Slc7a1 ile transdükte edilmiştir. (A) Slc7a1 için blastisidin ile seçilmiş insan rabdomiyosarkom hücre hattı (Slc-hRMS), GFP ile transdukt edilmiş (mavi) veya transdukt edilmemiş (pembe). (B) Ekotropik olarak transdukt edilmiş Slc-hRMS'nin floresan mikrografı (4X). (C) ekotropik GFP lentivirüsü ile transdükte edilmiş (mavi) ve transdükte edilmemiş (pembe) HDF'ler; hücreler, ekotropik transdüksiyondan iki gün önce Slc7a1 ile transdükte edilmiştir. (D) Slc-hRMS üzerinde ölçülen VSV-G pseudotiplenmiş ve ekotropik lentivirüs titresi.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Polimer konsantrasyonunun GFP ekspresyonu üzerindeki etkileri; absorbans, akış sitometrisi ve GFP% grafikleri." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. İnsan dermal fibroblastlarında kondroitin sülfat/polibren (CS/PB) konsantrasyonlarının optimizasyonu. (A) Sadece PB varlığında veya farklı konsantrasyonlarda CS/PB ile transdüksiyon sonrası HDF'lerin canlılığının MTT analizi ile ölçümü. (B) FACS ile ölçülen, farklı CS/PB konsantrasyonları ile HDF'lerdeki transdüksiyon verimliliğinin artırılması. (C) Transdüksiyon artışının kantifikasyonu, maksimum transdüksiyonun şu noktada gerçekleştiğini göstermektedir: 100 μg/ml CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Gen transdüksiyon verimliliği ile titer analizi karşılaştırması, sütun grafiği ve saçılım grafiği, polybrene etkisi karşılaştırması." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 4"> 
Şekil 4. Etkisi 400 μg/ml ekotropik lentivirüs ile Slc-hRMS transdüksiyonu üzerine CS/PB. (A) Titre artırımı ve (B) ... ile karşılaştırıldığında transduksiyon hızındaki kat değişimi 6 μg/ml yalnızca polybrene.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="GFP+ hücre dağılımını gösteren floresan mikroskopi görüntüleri ile akış sitometrisi GFP yoğunluk grafiği." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Şekil 5"> 
Şekil 5. Murin retrovirüs reseptörü Slc7a1 yokluğunda HDF'lerin ekotropik transduksiyon eksikliği. (A) Reseptör Slc7a1'in yokluğunda, transdüksiyon yapılmamış (pembe) veya ekotropik GFP lentivirüsü ile transdüksiyon yapılmış (mavi) BJ insan fibroblastlarının FACS grafiği. Ekotropik GFP lentivirüsü ile transdüksiyon yapılmış BJ insan fibroblastları, ... olmadan (B) ve ile (C) reseptör Slc7a1 ile ön transdüksiyon (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
<li>Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-+to+large-scale+production+of+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Small- to large-scale production of lentivirus vectors.</a> Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).</li>
<li>Landazuri, N., LeDoux, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retroviruses+with+charged+polymers+enhances+gene+transfer+by+increasing+the+rate+that+viruses+are+delivered+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells.</a> J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).</li>
<li>Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).</li>
<li>Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EOS+lentiviral+vector+selection+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).</li>
<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+nondividing+cells+using+pseudotyped+defective+high-titer+HIV+type+1+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell.</a> Cell. 105, 697-700 (2001).</li>
<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
<li>Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+murine+ecotropic+envelope%3A+increased+biosafety+and+convenience+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research.</a> Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).</li>
<li>Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+embryonic+stem+cells+by+ecotropic+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+a+novel+human+gene+homologous+to+the+murine+ecotropic+retroviral+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor.</a> Virology. 185, 10-17 (1991).</li>
<li>Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+preparation+and+concentration+of+retrovirus+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).</li>
<li>Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retrovirus+with+cationic+and+anionic+polymers+increases+the+efficiency+of+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Moloney fare lösemi virüsü (MLV) ve onun reseptörü mSlc7a1 dayalı Rekombinant ecotropic gammaretrovirus iyi çalışılmış ve yaygın olarak kullanılabilir, fare hücreleri transgenlerin sunmak için 20 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Ecotropic gammaretrovirus insan hücrelerine onkogenler sunmak için de son zamanlarda daha çok olmuştur. Hücresel yeniden programlama bağlamında, mSlc7a1 kullanımı iyi kurulmuş amphotropic virüs barındıran insan onkogenler nesil önlemek için 4,5 Ancak, lentivirüs gammaretrovirus göre önemli avantajlar sağlar lentiviral ön-entegrasyon kompleksi sağlar çünkü refrakter hücre popülasyonlarının, sık sık yeniden programlama için arzu edilen hedeflere 6 dahil birincil hücreler, uyum olmayan bölünen hücreleri transdüksiyon 7 Lentiviruses MLV virüs tropizm, toksisite ve diğer özellikleri 8 MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs fare hücreleri, 9 uyum sağlamak olmuştur ama insan hücreleri üzerinde nadiren kullanılır olmuştur değiştirmek için bir çaba da dahil olmak üzere onlarca farklı pseudotypes, ile üretilmiştir 10 Bu nedenle, insan hücrelerinde hücresel yeniden programlama faktörler de dahil olmak üzere, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler, teslim etmek için güvenli, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir araç olarak MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs kullanımını öneriyoruz. Daha doğrusu, bu protokol, kanserle ilgili virüsleri ile self-aşılama potansiyel araştırmacılar, yalıtım, pantropic virüs onkogen (ler) ayırır; bu protokolü tamamen pantropic lentivirüs üretmek ve kullanmak gereksinimini ortadan kaldırmak olmadığını not etmek önemlidir. Protein mSlc7a1 ve insan homologu hSlc7a1 yayg amino asit taşıyıcıları bilinen Tümör Gelişimi veya alıcı hücreler üzerinde seçici bir büyüme avantajı tanımak yeteneği, 11 amphotropic virüs içine dahil edilmesi için nispeten düşük riskli verme mSlc7a1 ile ifade edilir. Bu adım, gerekli biyogüvenlik düzeyi adanmış virüs veya doku kültürü tesisleri eksik laboratuvarlarda özellikle yararlı olabilir. Bazı durumlarda pantropic virüsü hedef hücreleri doğrudan Slc7a1 plazmid transfecting kullanımı tamamen ortadan kaldırmak için mümkün olabilir, ancak bu tekniğin yararlı hedefler olacaktır birçok hücre transfeksiyon dirençli. Alternatif olarak, izole etme yeteneği blasticidin seçim hücreleri Slc7a1-transduced VSV-G pseudotyped lentivirüs ecotropic virüs bu hücrelerin çoğu için uyum sağlamak rutin olarak kullanılan bu tarihten sonra reseptör eksprese eden hücrelerin, bir stok oluşturmak için bir kez kullanılabileceği anlamına gelir deneyler. Araştırmacılar, her zaman tropizm ne olursa olsun, herhangi bir lentivirüs çalışan için kurumsal güvenlik yönergeleri takip etmelidir. Bu protokol ile elde ecotropic virüs titreleri orta önceki çalışmalar ile anlaşma genellikle VSV pseudotyped virüs, pantropic virüs titresi% 10-20 daha düşüktür. 9 Bu titreleri stably Slc7a1 ile transduced insan hücrelerinde ölçüldü, bu nedenle alt ecotropic virüs için gözlenen titresi hedef hücrelere reseptör geninin çeşitli ifade kısmen olabilir. Bununla birlikte, protokolde elde viral titreleri çoğu uygulama için yeterli olandan daha fazla ve bazı durumlarda, hücrelerin çoğunluğunun transdüksiyon yol&gt;% 90 hücre. Santrifüj tabanlı teknikler genellikle viral parçacıkların konsantre kullanılır. Ancak, santrifüj, birkaç saat gerektirir infeksiyöz aerosollerin üretir ve viral parçacıkların önemli bir kaybına neden olabilir. 12, CS / PB ile kompleks bir alternatif olarak viral tropizm değiştirmeden transdüksiyon geliştirmek için kullanılabilir. 3 Bu yöntem (5 dakika hızlıdır gözlenen titresi yaklaşık üç katına ise, (10 ml virüs başına $ 0.03)) ve ucuz. Hiçbir özel ekipman veya tescilli reaktifler ve gerekli diğer hücre hatları önceki çalışma ile anlaşma, CS / PB HDFS maruz kaldıktan sonra en az akut toksisite gözlenen bu protokol 13 Bir potansiyel dezavantajı bazı mikroskobik görünür polimer kompleksleri uymasını kültür hücreleri birkaç gün. Biz bu kompleksleri, hücrelere açıkça zehirli olmasa da, hücresel süreçleri daha ince etkileri olabileceği olasılığını ekarte edemez. Burada güvenli ve verimli bir şekilde onkojenik faktörleri ile insan hücrelerinin uyum için bir metodoloji tarif var. Bu yaklaşım, iPS hücreleri de dahil olmak üzere onkogenler ve kök hücre biyolojisi inceleyen araştırmacılar için harika bir yardımcı programdır olmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Murin MLV reseptör </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G zarf </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono laboratuar 14 </td><td></td><td> Ambalaj plazmid (eşdeğer plazmid psPax2 Addgene edinilebilir, Kedi Numarası 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Ecotropic zarf </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> Plazmid GFP kontrolü </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimethrine bromür (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Kondroitin sülfat sodyum tuzu köpekbalığı kıkırdağı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Balıkçı </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

biyogüvenlik geliştirilmiş polimer complexed ecotropic lentivirüs İnsan hücreleri, İletimi

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Kök ve tümör hücre biyolojisi çalışmaları genellikle laboratuvar personeli için önemli güvenlik sorunları yükselterek, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler insan hücrelerinde viral transdüksiyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan VSV-G pseudotype Pantropic lentiviruses, gen fonksiyonu olmayan bölünen hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri, transduce çünkü çalışmak için değerli bir araç. Ancak, araştırmacılar, üretim ve yüksek biyogüvenlik düzey sürüş gereksinimleri ve güvenlik sorunları nedeniyle onkogenler kodlama pantropic virüs santrifüj önlemek için isteyebilirsiniz. C-Myc ve SV40 büyük T antijeni dahil olmak üzere birçok güçlü onkogenler, bağlı pluripotent kök hücreleri (iPSC) üretimini artırmak için bilinmektedir. Tüm diğer iPSC indükleyici genetik değişiklikler (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 ve p53 kaybı) fonksiyonu da nispeten yüksek güvenlik endişesi de bunları yaparken, kanser bağlantılar var. Kanser ile ilgili bu virüsler hücresel yeniden programlama ve pluripotency eğitim yararlı olsa da, güvenli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu biyogüvenlik konuları ele almak için, düşük maliyet ve uygun taşıma hakkında ek vurgu ecotropic lentivirüs insan hücrelerinin transdüksiyon için bir yöntem göstermektedir. Biz% 90 daha fazla uyum sağlamak yeterince yüksek titreye sahip ecotropic lentivirüs reseptör ifade, bu yaklaşımın etkinliği doğrulayarak, virüse maruz kalan insan hücreleri. Lentivirüs genellikle Ultrasantrifügasyon yoğunlaşmıştır; Ancak, bu işlem birkaç saat sürer ve infeksiyöz aerosollerin insan biyomedikal araştırmacıların üretebilir. Daha güvenli bir alternatif, viral parçacıkların, kondroitin sülfat ve polybrene (CS / PB) kompleks hücrelerin üzerine tortulaşmış olabilir gibi. Bu teknik, fonksiyonel viral titresi stably önemsiz eklenen zaman ve maliyet, fare retrovirüs reseptör ifade hücreleri 3-kat artar. Insan dermal fibroblastlar (HDFS) İletimi maksimum bu polimer konsantrasyonu ilgi hedef hücre tipi için titre edilmelidir, kanser hücre hatları için daha önce rapor edilen en iyi değerden yaklaşık 4 kat daha düşük CS / PB konsantrasyonları kullanılarak geliştirilmiştir. Bu nedenle yeni bir hücre tipi polimer toksisite için tahlil methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) kullanımını tanımlamak. Biz, minimal akut toksisite gösteren viral transdüksiyon sonra polimer kompleksleşme veya polybrene (PB, 6 mg / ml) standart dozda ya HDFS eşdeğer canlılığı gözlemliyoruz. Bu protokol, biyogüvenlik riskleri azaltarak ve transdüksiyon hızını artırarak, insan hücrelerinde onkogenlerin aşırı ekspresyonu için ecotropic lentivirüs kullanımı açıklanmaktadır. Ayrıca viral parçacıkların aerosol oluşturan santrifüj kaçınarak transdüksiyon geliştirmek için polimer kompleksleşme kullanımını göstermek.

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Kök hücre ve tümör hücresi biyolojisi çalışmaları, sıklıkla insan hücrelerinin bilinen veya şüpheli onkogenlerle viral transdüksiyonla dönüştürülmesini gerektirir ve bu durum ... için ciddi güvenlik sorunlarına yol açar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ekotropik lentivirüs kullanarak insan hücrelerine onkogenlerin veya diğer potansiyel olarak tehlikeli genlerin aktarılmasını sağlamaktır. Bu işlem, fare retrovirüs reseptörünü kodlayan pantropik lentivirüsün yanı sıra, ilgilenilen geni kodlayan ekotropik lentivirüs üretilerek gerçekleştirilir; hücreler, onları ekotropik virüsle transduksiyona duyarlı hale getiren fare retrovirüs reseptörü ile transdukse edilir. Ardından, onkogeni aktarmak amacıyla hücreler ekotropik virüs ile transdukse edilir; transduksiyonu artırmak için polibrein ve kondroitin sülfat ile polimer kompleksleme kullanılır. Floresan mikroskopi ve FACS'e dayalı olarak, insan hücrelerinin tropik lentivirüs ile seçici şekilde transdukse edildiğini gösteren sonuçlar elde edilir.Bu tekniğin gama retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lentiviral partiküllerin kök hücreler gibi bölünmeyen hücreler dahil birçok hücre tipini daha etkili bir şekilde transdükse edebilmesidir. Bu yöntem, potansiyel onkogenlerin fonksiyonlarının anlaşılması gibi kanser ve kök hücre araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamadan önce kurumsal güvenlik sorumlunuza danışın ve önerilen güvenlik kılavuzlarını takip edin.Bir doku kültürü kabininde çalışarak, sağlıklı ve hızlı büyüyen 2 9 3 T hücreleri kültürü ile başlayın. Aseptik koşullar altında, 5 × 10⁶ adet 2 9 3 T hücresini 10 mL antibiyotiksiz 2 9 3 T besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir doku kültürü plağına pipetleyin ve plağı bir doku kültürü inkübatöründe, 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, öğleden sonra geç saatlerde transfeksiyona başlayın. İlk olarak, Optum'dan bir alikot ile transfer paketleme ve zarf plazmidlerini toplayıp oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin; ardından bir mikro santrifüj tüpüne 375 µL Optum pipetleyin ve üzerine 25 µL FUgene HD transfeksiyon reaktifi ekleyin. FUgene reaktifinin doğrudan medyanın içine pipetlendiğinden ve tüpün kenarına temas etmediğinden emin olun.Ardından, ikinci bir mikro santrifüj tüpünde, beş µg transfer plazmidi, 3,75 µg paketleme plazmidi ve 1,25 µg zarf plazmidini, toplam hacmi 100 µL'ye tamamlayacak miktarda optimum ile birleştirin. Daha sonra, plazmid karışımını içeren tüpe Optum Fuji ekleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun son birkaç dakikasında, 2 9 3 T hücrelerini içeren plakadaki medyumu çok nazikçe aspire edin ve yerine 10 mL taze antibiyotiksiz 2 9 3 T medyumu ekleyin.Son olarak, FU gen plazmid karışımını 10 santimetrelik plağın besiyerine damla damla ekleyin. Plağı 37 °C ve %5 karbondioksite ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plaktaki besiyerini çok nazik bir şekilde aspire edin ve taze, antibiyotiksiz 2 9 3 T besiyeri ile değiştirin.Ardından plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin ve iki gün daha inkübe edin; transfeksiyondan üç gün sonra plaktaki virüs içeren medyumu aspire edin ve 0,45 mikronluk düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanarak süzün. Virüsü filtreledikten sonra, taze antibiyotiksiz medyuma mililitre başına altı mikrogram polybrenan ekleyerek floresan kontrol virüsü ile seri dilüsyonlar hazırlayın ve bu dilüsyonları uygun hücre hattındaki hücreleri transdüse etmek için kullanın. Ertesi gün, 24 kuyucuklu plakadaki medyumu taze, antibiyotiksiz medyumuyla değiştirin ve hücrelerin floresan proteini eksprese etmesine olanak tanımak için inkübasyonu iki gün daha sürdürün.Her viral dilüsyon için transduce edilmiş hücre oranını belirlemek için verileri kullanın. Ardından, çoklu transduksiyon olaylarını minimize etmek için %15'ten daha az transduksiyon sağlayan dilüsyonlara dayanarak, mililitredeki dönüştürücü birim cinsinden titreyi hesaplayın. Paralel olarak üretilen diğer floresan olmayan lentivirüslerin titrelerinin, floresan virüsünkine benzer olduğu varsayılır.Hedef hücreleri transduse etmek için, çoğu hücrenin transduse olmasını sağlamak amacıyla iki'den büyük bir enfeksiyon çokluğu seçerek başlayın. İlk olarak, viral süpernatantı taze tam kültür ortamında gerekli enfeksiyon çokluğuna gelecek şekilde seyreltin. Mililitre başına altı mikrogram polybrene ekleyerek toplam hacmi bir mililitreye tamamlayın.Hedef hücrelerin bulunduğu 35 milimetrelik bir kaptaki medyumu aspire edin ve bir mililitre seyreltilmiş viral süpernatant ekleyin. Arzu edilirse, SLC seven A one reseptörünün yeterli ekspresyonu için doku kültürü inkübatöründe 24 ila 48 saat inkübe edin. Yazılı prosedürdeki talimatlara uygun olarak, SLC seven A one eksprese eden stabil olarak transduce edilmiş hücreleri seçmek için blasteysin ile antibiyotik seçimi yapın.Toksisite belirleme işlemine başlamak için, mililitre başına 20 miligram kondroitin sülfat stok çözeltisi ve mililitre başına 20 miligram Poly brain stok çözeltisi hazırlayın ve steril filtre ile süzün. Artan stok çözeltiler, ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklanabilir.Ardından, polimer kompleks toksisitesini doğru şekilde belirlemek için gereken 96 kuyucuklu hücre kültürü sayısını belirleyin. MTT analizi kullanılarak, kondroitin sülfat ve poly green'in en az altı farklı konsantrasyonu üç paralel şeklinde test edilmelidir. Buna ek olarak, indirgenmemiş hücreler ve serumsuz ortamda büyütülen hücreler de dahil edilmelidir.Sağlıklı hücreler için bir temel oluşturmak ve sırasıyla büyüme durmasını kontrol etmek amacıyla ortama besiyeri eklenmelidir. Gerekli kuyucuk sayısı belirlendikten sonra, bir 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 5.000 hedef hücre ekleyin; paralel olarak, her deneysel koşulda transdüksiyon verimliliğinin mikroskobik veya gerçeklere dayalı analizi için bir 24 kuyucuklu plakaya hücre ekimi yapın ve her iki hücre setinin de gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün ise kondroitin sülfat stok çözeltisinden bir alikot ve poly brain stok çözeltisinden bir alikot ekleyin.Ardından, GFP kodlayan virüsü, mililitrede altı mikrogram poly-L-lizinin bulunduğu antibiyotiksiz besiyerinde, kuyuk başına hedef hücrelerin yaklaşık %10 ila %50'sini transduce etmeye yetecek bir enfeksiyon multiplisitesine seyrelterin. Her plaka üzerindeki kontrol kuyucukları dahil olmak üzere her test koşulu için yeterli miktarda seyreltilmiş virüs olduğundan emin olun. Tüp setlerini, test edilecek her bir kondroitin sülfat ve poly-L-lizin polimer konsantrasyonuna göre etiketleyin.Ardından, her bir koşul için viral süspansiyondan üç tekrar olacak şekilde tüplere uygun miktarda paylaştırın. Sonraki adımda, test konsantrasyonlarını oluşturmak için gerekli hacimdeki kondroitin sülfat ve poly brain stok çözeltisini sırasıyla her bir tüpe pipetleyin. Kondroitin sülfat ve poly green ilavesinin hemen ardından, karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.Virüs kondroitin sülfat poly green karışımlarının oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesini sağlayın. Viral presipitatlar oluştukça karışım bulanıklaşabilir. İnkübasyonun ardından, 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarındaki medyumları aspire edin.Ardından, planlandığı üzere virüs kondroitin sülfat poli yeşil karışımını kuyucuklara ekleyin. Ayrıca, kontrol ve serumsuz medyumu uygun kuyucuklara pipetleyin. İşlemi 24 kuyucuklu plaka için tekrarlayın ve doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.Ardından, plaklardaki virüs içeren medyumu aspire edin ve taze medyum ile değiştirin. Plakları 48 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. 48 saat sonra 24 kuyucuklu plağı çıkarın ve her bir kondroitin sülfat ve poly brain konsantrasyonunun transduksiyon verimliliğini analiz etmek için facts kullanın.Ertesi gün. 96 kuyucuklu plakanın tüm kuyucuklarındaki besiyerini aspire edin ve yerine 100 µL MTT çözeltisi ekleyin; MTT'nin metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondrilerinde indirgenmesine izin vermek için nemlendirilmiş bir inkübatörde üç saat boyunca kültüre edin. Üç saat sonra, MTT çözeltisini aspire edin ve yerine 200 µL çözücü çözeltisi ekleyin.Plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya tüm mor MTT oluşup çökelek çözünene kadar inkübe edin. Absorbansı bir mikroplaka okuyucuda 570 nanometrede okuyun ve 690 nanometredeki arka plan okumasını çıkarın. Optimal polimer konsantrasyonu, hdf'ler için MTT ile belirlenen metabolik aktivite üzerindeki etkisi minimum düzeyde kalacak şekilde, transdüksiyonun maksimum düzeyde artışını sağlayacaktır.Mililitre başına 100 mikrogram kondroitin sülfat. Bu yöntemle belirlendiği üzere, poli beyin optimal polimer konsantrasyonudur. İlk olarak, SLC seven A one reseptörü eksprese eden HDF hücrelerinin bulunduğu gerekli sayıdaki 35 milimetrelik kaplara transdüksiyon yapmak için yeterli miktarda 100 mikrogram/ml kondroitin sülfat poli yeşil viral sup natant karışımı hazırlayın. Polimer komplekslerinin oluşması için karışımı beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından hedef hücreleri eksprese eden reseptördeki medyumu aspire edin ve viral karışım ile değiştirin; viral karışımı uzaklaştırdıktan sonra 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Viral komplekslerin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için hücre yüzeyini iki kez PBS ile yıkayın. Kalıntı polimer komplekslerinin hücre sağlığı üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi gözlemlenmediğinden, tamamen uzaklaştırılması gerekli değildir.Bu floresan mikroskop görüntüsü, transdüksiyon verimliliğini izlemek için floresan kontrol vektörleri kullanıldığında, tropik virüs ile SLC seven A one'ı stabil şekilde eksprese eden insan sarkom hücrelerinin yeterli düzeyde transdükte edildiğini göstermektedir. FACS analizi kullanılarak yapılan floresan kantifikasyonu, %90'ın üzerinde bir transdüksiyon verimliliği olduğunu kanıtlamaktadır. Hücreler blastatize edilmediği ve reseptör ekspresyonu için seçilmediği için HDFS'nin transdüksiyon oranları genellikle daha düşüktür; S-L-C-H-S-C üzerinde ölçülen tropik lentivirüs titreleri genellikle VSV psödotiplenmiş virüslerin %10 ila %20'si kadardır. MTT canlılık testi, burada kondroitin sülfat konsantrasyonları ile birlikte virüs transdüksiyonunda görüldüğü üzere, hedef hücrelerdeki büyüme durmasının hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar.Mililitrede 800 mikrograma kadar poly brain, HDF metabolizması üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Virüs ve çeşitli konsantrasyonlarda kondroitin sülfat ile transdukte edilmiş HDF'lerin faks analizi gerçekleştirilmiştir. Poly green, tek başına poly green kullanımına kıyasla transdüksiyonda artış sağlamaktadır.Maksimum artırım 100 µg/mL değerinde gerçekleşir. Kondroitin sülfat pol beyin, daha önce bildirilen değerlerden birkaç kat daha düşüktür. Bu nedenle, herhangi bir hücre tipinin kondroitin sülfat ile kompleksleşmesi için koşulların optimize edilmesi önemlidir.Poly brain, S-L-C-H-S-C hücrelerinde gözlemlenen titreyi yaklaşık üç kat artırır. Pratikte bu durum, düşük virüs konsantrasyonlarında transdüksiyon verimliliği üzerinde, yüksek konsantrasyonlara kıyasla daha büyük bir etki sağlar; bu durum büyük olasılıkla yüksek virüs konsantrasyonlarındaki çoklu transdükse hücrelere ve reseptör saturasyonuna bağlıdır. Tropik virüs ile transdüksiyon, nöron retrovirüs reseptörü eksprese eden hücreler için spesifiktir.Modifiye edilmemiş insan hücreleri tropik virüs ile transduksiyon edildiğinde, FACS analizi ve mikroskopik inceleme ile görüldüğü üzere, indirgenmemiş arka planın üzerinde bir floresans gözlenmemiştir. HDFS, reseptör yokluğunda transduksiyon göstermezken, reseptör ile ön transduksiyon floresan hücrelerle sonuçlanmıştır. Bu prosedür uygulanırken, virüsün modifiye edilmiş insan hücrelerini transduksiyon etmeyeceğinin doğrulanmasının önemli olduğu unutulmamalıdır.Bu videoyu izledikten sonra, transduksiyonu artırmak için polimer komplekslemesi kullanımı da dahil olmak üzere, potansiyel olarak tehlikeli genleri insan hücrelerine aktarmak için tropik lentivirüsün nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

transduction-human-cells-with-polymer-complexed-ecotropic-lentivirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.

Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları &amp; VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Bu genetik olarak non-viral kullanılarak bir transgen ile primer insan T-hücreleri değiştirmek için bir yöntem...

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Bulaşıcı Ebola virüsleri ile çalışmak biyogüvenlik düzeyi 4 laboratuarlar ile sınırlıdır. Tetracistronic Minigenom içeren parçacıklar gibi çoğaltma ve kopyalama-yetkin virüsü (trVLPs) bize güvenle Ebola virüsü bileşenleri üzerinde sadece güvenerek, biyogüvenlik düzeyi altında 2 koşullarını birden fazla bulaşıcı döngüleri modellemek için olanak sağlayan bir yaşam döngüsü modelleme sistemi temsil eder.

Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin transdüle edilmesi zordur. Bu protokol, lentivirüslerin üretimini ve konsantrasyonlarını ve ayrıca psödostratifiye bir epitele farklılaşma boyunca bu hücrelerde yüksek verimli transdüksiyonlar elde etmek için gerekli olan optimal kültür koşullarını tanımlar.

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Burada, sabit memeli hücrelerinde hücre tabanlı görselleştirme, hücre altı lokalizasyonu ve poli(ADP-riboz) (PAR) zenginleştirilmiş odakların nicel analizini tanımlıyoruz. Bu test, genotoksine maruz kalan hücrelerin çekirdeklerinde, baz eksizyon onarımı veya tek zincirli kırılma onarımı ile ilişkili DNA hasarı kaynaklı PARP aktivasyonunun noktalarının nicelendirilmesini sağlar.

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Öğrenin, ekotropik lentivirus ile insan hücrelerine onkogenleri güvenli şekilde aktarma yöntemini. Polimer kompleksasyonu kullanarak transdüksiyon verimliliğini artırın ve kanser araştırmalarında güvenli alternatif protokol geliştirin.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Daha fazla video keşfet