Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yankı tropik lentivirüs kullanarak insan hücrelerine onkogenleri veya diğer potansiyel olarak tehlikeli genleri sokmaktır. Bu, fare retrovirüs reseptörünü kodlayan pantropik lentivirüsün yanı sıra, ilgilenilen hücrelerin genini kodlayan eko tropik lentivirüsün üretilmesiyle elde edilir, bu da onları eko tropik virüs ile transdüksiyona duyarlı hale getirir. Daha sonra, hücreler, floresan mikroskobu ve gerçeklere dayalı olarak tropik lentivirüs ile insan hücrelerinin seçici transdüksiyonunu gösteren transdüksiyonu arttırmak için poli beyin ve kondroitin sülfat ile polimer kompleksasyonu kullanılarak onkogeni tanıtmak için eko tropik virüs ile transdüksiyon elde edilir.

Bu tekniğin gama retroviral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, lentiviral partiküllerin kök hücreler gibi bölünmeyen hücreler de dahil olmak üzere birçok hücre tipini daha etkili bir şekilde iletebilmesidir. Bu yöntem, potansiyel onkogenlerin işlevini anlamak gibi kanser ve kök hücre araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, kurumsal güvenlik yetkilinize danışın ve önerilen güvenlik yönergelerini izleyin.

Bir doku kültürü başlığında çalışan, sağlıklı, hızla büyüyen 2 9 3 T hücrelerinden oluşan bir kültürle başlayın. Aseptik koşullar altında, 10 mililitre antibiyotiksiz 2 9 3 T ortamında 6 2 9 3 T hücrelerinin 10'unu beş kez resuse eder. Hücre süspansiyonunu 10 santimetrelik bir doku kültürü plakasına pipetleyin ve plakayı gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Ertesi gün, öğleden sonra transfeksiyona başlayın. İlk olarak, bir Optum alikotu ve transfer ambalajı ve zarf plazmitleri toplayın ve bunların oda sıcaklığına ısınmasına izin verin, 375 mikrolitre optimumu bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve ardından 25 mikrolitre FU geni HD transfeksiyon reaktifi ekleyin. FU gen reaktifinin doğrudan ortama pipetlendiğinden ve tüpün yan tarafına temas etmediğinden emin olun.

Daha sonra, ikinci bir mikro santrifüj tüpünde, hacmi 100 mikrolitreye getirmek için beş mikrogram transfer plazmidini, 3.75 mikrogram ambalaj plazmidini ve 1.25 mikrogram zarf plazmitini gereken miktarda birleştirin. Daha sonra plazmid karışımını içeren tüpe karıştırılmış Optum Fuji'yi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun son birkaç dakikasında, 2 9 3 T hücrelerini içeren plakadan ortamı çok nazikçe aspire edin ve 10 mililitre taze antibiyotik içermeyen 2 9 3 T ortamı ile değiştirin.

Son olarak, FU gen plazmid karışımını 10 santimetrelik plakanın ortamına damla damla ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı plakadan çok nazikçe aspire edin ve yerine taze antibiyotik içermeyen 2 9 3 T besiyeri koyun.

Daha sonra plakayı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve transfeksiyondan üç gün sonra iki gün daha inkübe edin, virüsü içeren ortamı plakadan aspire edin ve 0.45 mikronluk düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanarak süzün. Virüsü daha sıkı virüse filtreledikten sonra, mililitre poli beyin başına altı mikrogram ile taze antibiyotik içermeyen bir ortamda bir floresan kontrol virüsünün seri seyreltmelerini yapın ve bu seyreltmeyi uygun hücre hattının hücrelerini dönüştürmek için kullanın. Ertesi gün 24 oyuklu bir plakada, ortamı taze, antibiyotik içermeyen ortamla değiştirin ve ardından hücrelerin floresan proteini ifade etmesine izin vermek için inkübasyona iki gün daha devam edin.

Her viral seyreltme için dönüştürülen hücrelerin fraksiyonunu belirlemek için gerçekleri kullanın. Ardından, çoklu iletim olaylarını en aza indirmek için %15'ten daha az iletim sağlayan seyreltmelere dayalı olarak mililitre başına dönüştürme birimlerinde titreyi hesaplayın. Paralel olarak üretilen diğer floresan olmayan lentivirüsün göğüslerinin, floresan virüsünkine benzer olduğu varsayılmaktadır.

Hedef hücreleri dönüştürmek için: Çoğu hücrenin transdüksiyon yapacağından emin olmak için ikiden büyük bir çarpımsal enfeksiyon seçerek başlayın. İlk olarak, viral süpernatanı taze tam kültür ortamında gerekli enfeksiyon çokluğuna seyreltin. Bir mililitrelik son hacme kadar mililitre poli beyin başına altı mikrogram ile desteklenir.

Ortamı 35 milimetrelik bir hedef hücre kabından aspire edin ve bir mililitre seyreltilmiş viral supinat ekleyin. İstenirse SLC yedi A bir reseptörünün yeterli ekspresyonunu sağlamak için doku kültürü inkübatörünün 24 ila 48 saat inkübe edilmesi. Yazılı prosedürdeki talimatlara göre SLC yedi A eksprese eden stabil transdüksiyonlu hücreleri seçmek için blaster sein ile antibiyotik seçimini kullanın.

Toksisite tayinine başlamak için, mililitre kondroitin sülfat başına 20 miligramlık bir stok çözeltisi ve mililitre başına 20 miligramlık bir stok çözeltisi hazırlayın. Suda ve steril filtrede poli beyin. Fazla stok çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Daha sonra, polimer kompleks toksisitesini doğru bir şekilde belirlemek için gereken 96 kuyu hücre kültürünün sayısını belirleyin. MTT tahlili kullanılarak, en az altı konsantrasyonda kondroitin sülfat ve poli yeşili üç nüsha halinde test edilmelidir. Ek olarak, indirgenmemiş hücreler ve serumsuz olarak büyüyen hücreler.

Sağlıklı hücreler için bir temel sağlamak ve sırasıyla büyümenin durmasını kontrol etmek için ortam dahil edilmelidir. Gerekli kuyucuk sayısı belirlendikten sonra, her deneysel koşulda transdüksiyon verimliliğinin mikroskobik veya gerçeklere dayalı analizi için 24 oyuklu bir plakada paralel plaka hücrelerinde 96 Kuyulu bir plakanın her bir oyuğunda 5.000 hedef hücre plakası, her iki hücre setinin de gece boyunca büyümesine izin verir. Ertesi gün, kondroitin sülfat stok çözeltisinin bir alikotu ve poli beyin stok çözeltisinin bir alikotu.

Daha sonra, mililitre poli beyin başına altı mikrogram içeren antibiyotik içermeyen ortamda, kuyu başına hedef hücrelerin yaklaşık% 10 ila 50'sini iletmeye yetecek kadar çok sayıda enfeksiyona kadar virüs kodlayan GFP'yi seyreltin. Her test koşulu için yeterli seyreltilmiş virüs ve her plakada kontrol kuyuları olduğundan emin olun. Test edilecek her kondroitin sülfat ve poli yeşil polimer konsantrasyonu ile bir dizi tüpü etiketleyin.

Daha sonra, her koşul için tüplere üç kopya halinde yeterince viral süspansiyon alın. Daha sonra, test konsantrasyonlarını art arda tüplerin her birine oluşturmak için gerekli hacimde kondroitin sülfat ve poli beyin stoğu çözeltisini pipetleyin. Kondroitin sülfat ve poli yeşili ilavesinden hemen sonra, karıştırmak için tüpü hafifçe vurun.

Virüs kondroitin sülfat poli yeşil karışımlarının oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmesine izin verin. Viral çökeltiler oluştukça karışım bulanıklaşabilir. İnkübasyonun ardından, ortamı 96 kuyulu plakanın kuyularından aspire edin.

Ve sonra virüs kondroitin sülfat poli yeşil karışımını planlandığı gibi kuyulara ekleyin. Ayrıca pipet kontrolü ve serum içermeyen ortamı uygun kuyucuklara boşaltın. 24 oyuklu plaka için işlemi tekrarlayın, doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.

Daha sonra, virüs içeren ortamı plakalardan aspire edin ve yeni ortamla değiştirin. Plakaları 48 saat sonra 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun. 24 oyuklu plakayı çıkarın ve her bir kondroitin sülfat ve poli beyin konsantrasyonunun transdüksiyon verimliliğini analiz etmek için gerçekleri kullanın.

Ertesi gün. Ortamı 96 oyuklu plakanın tüm kuyucuklarından aspire edin ve metabolik olarak aktif hücrelerin mitokondrilerinde MTT'nin azaltılmasına izin vermek için nemlendirilmiş bir inkübatörde üç saat boyunca 100 mikrolitre MTT çözelti kültürü ile değiştirin. Üç saat sonra, MTT çözeltisini aspire edin ve 200 mikrolitre çözücü çözeltisi ile değiştirin.

Plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca veya mor MTT'nin tamamı oluşana ve çökelti çözülene kadar inkübe edin. 570 nanometrede bir mikroplaka okuyucusunda absorbansı okuyun ve arka plan okumasını 690 nanometre olarak çıkarın. Optimal polimer konsantrasyonu, hdfs için MTT tarafından belirlendiği gibi metabolik aktivite üzerinde minimum etkiye sahip gerçekler tarafından belirlendiği gibi transdüksiyonun maksimum artışını üretecektir.

Mililitre kondroitin sülfat başına 100 mikrogram. Poli beyin, bu yöntemle belirlenen optimal polimer konsantrasyonudur. İlk olarak, HDF hücrelerini eksprese eden SLC yedi A bir reseptörün gerekli sayıda 35 milimetrelik tabağını dönüştürmek için mililitre kondroitin sülfat poli yeşil viral sodyum karışımı başına yeterli 100 mikrogram hazırlayın Polimer komplekslerinin oluşmasına izin vermek için karışımı beş dakika inkübe edin.

Daha sonra medyayı reseptör eksprese eden hedef hücrelerden aspire edin ve viral karışımı çıkardıktan sonra gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Viral komplekslerin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için hücrelerin yüzeyini PBS ile iki kez yıkayın. Kalıntı polimer komplekslerinden hücre sağlığı üzerinde herhangi bir olumsuz etki gözlenmediğinden tamamen çıkarılması gerekli değildir.

Bu floresan mikroskobu görüntüsü, transdüksiyon verimliliğini izlemek için floresan kontrol vektörleri kullanıldığında tropik virüslü SLC yedi A'yı kararlı bir şekilde ifade eden insan sarkom hücrelerinin yeterli transdüksiyonunu göstermektedir. Faks analizi kullanılarak floresansın ölçülmesi, %90'dan daha yüksek bir iletim verimliliğini gösterir HDFS'nin iletim oranları genellikle daha düşüktür, çünkü hücreler reseptör ekspresyonu için seçildiğinde bir kenara atılmamıştır, atropik lentivirüsün memeleri genellikle VSV'nin %10 ila %20'sidir. MTT canlılık testi, burada görüldüğü gibi hedef hücrelerde büyüme durmasının hassas bir şekilde tespit edilmesine, virüs ile transdüksiyona ve kondroitin sülfat konsantrasyonlarına izin verir.

Mililitrede 800 mikrograma kadar olan poli beynin HDF metabolizması üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Virüs ve çeşitli konsantrasyonlarda kondroitin sülfat ile transdüksiyona uğrayan HDFS'nin faks analizi. Poli yeşili, tek başına poli yeşile kıyasla iletimin arttığını gösterir.

Maksimum gelişme mililitre başına 100 mikrogramda gerçekleşir. Kondroitin sülfat poli beyin, daha önce bildirilen değerlerden birkaç kat daha düşüktür. Bu nedenle, kondroitin sülfat ile herhangi bir hücre tipi kompleksleşmesi için koşulları optimize etmek önemlidir.

Poli beyin, gözlenen titreyi S-L-C-H-S-C'de kabaca üç kat artırır. Pratikte, bu, düşük virüs konsantrasyonlarında iletim verimliliği üzerinde daha yüksek konsantrasyonlara göre daha büyük bir etki sağlar, bu da büyük olasılıkla çoklu transdüksiyon hücrelerine ve daha yüksek virüs konsantrasyonlarında reseptör doygunluğuna bağlıdır. Tropik virüs ile transdüksiyon, nöron retrovirüs reseptörünü eksprese eden hücreler için spesifiktir.

Tropik virüse sahip modifiye edilmemiş insan hücreleri dönüştürülürken, mikroskobik olarak faks analizinde görüldüğü gibi, indirgenmemiş arka plandan daha büyük floresan gözlenmemiştir. HDFS, reseptör yokluğunda transdüksiyon göstermezken, reseptör ile pret transdüksiyon floresan hücrelerle sonuçlanır. Bu prosedürü denerken, virüsün değiştirilmiş insan hücrelerine bulaşmayacağını doğrulamayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, transdüksiyonu geliştirmek için polimer kompleksleşmesinin kullanımı da dahil olmak üzere, insan hücrelerine potansiyel olarak tehlikeli genler iletmek için tropik lentivirüsün nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.