Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

Bu prosedürün genel amacı, yabani tip ve mutant farelerde meme bezi gelişimini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle meme bezlerini açığa çıkarmak için farenin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, meme bezleri uygun şekilde toplanır ve cam lamlar üzerine yayılır, calm lum.

Ardından, epitel gelişiminin derecesini analiz etmek için boyama uygulanır. Son olarak, oksitosin maruziyeti sonrası miyoepitelyal kasılmalar analiz edilir, INEA J. Nihayetinde, elde edilen sonuçlar meme bezi kanallarının ve alveollerin uygun şekilde oluşup oluşmadığını ve miyoepitelin oksitosin maruziyeti ile kasılıp süt salgısını boşaltmaya teşvik edilip edilemeyeceğini ortaya koyacaktır. Bu yöntem, gen mutasyonunun veya nakavt işleminin meme bezi morfolojisi ve fonksiyonu üzerindeki etkisi gibi meme bezi gelişimi ve farklılaşmasıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, hem delik montajının hem de oksitosin tabanlı deneyin iyi hazırlanmış meme bezleri gerektirmesi nedeniyle, meme bezinin doğru şekilde disseksiyonunu sağlar. Bezle ilgili hatalı disseksiyonlar, bazı epitel kanalların eksikliğine veya deri ya da kas dokusu gibi yabancı dokuların varlığına yol açabilir. Disseksiyondan en az bir gün önce, 1 gram CalMin ve 2,5 gram alüminyum potasyum sülfatı 500 mililitre distile su içerisinde çözerek CalMin şap çözeltisini hazırlayın.

Çözeltiyi bir litrelik bir balonda 20 dakika boyunca kaynatın, son hacmi su ile 500 mililitreye tamamlayın. Çözeltiyi bir Watman kağıdıyla filtreleyin ve koruyucu olarak birkaç tane tiyol ekleyin. Ardından, boyama işleminden sonra çözeltiyi buzdolabında saklayın.

Karbon şap çözeltisi stok şişesine geri dökülebilir ve birkaç hafta boyunca defalarca yeniden kullanılabilir. Renk solmaya başladığında taze bir çözelti hazırlayın. Hafıza bezi diseksiyonuna başlamak için, bir fareyi karbondioksit inhalasyonuyla sakrifiye edin.

Boyun bölgesindeki ana kan damarlarına zarar verebileceği ve meme bezi çevresinde kan birikimine yol açabileceği için, mümkünse servikal dislokasyondan kaçının. Birincisi, bu durum folyoya sarılı polistiren köpük üzerindeki diseksiyon işlemini daha zor hale getirir. Fareyi sırt üstü yerleştirin ve dört uzvunu açın.

16 ila 20 gauge iğneler kullanarak dört uzvu da sıkıca sabitleyin. Penset yardımıyla fareye bolca %70 ethanol püskürtün. Karın derisini orta hattan yukarıya doğru çekin ve kesi noktasından başlayarak keskin bir makasla küçük bir insizyon yapın.

Abdominal veya torasik boşlukları delmemeye dikkat ederek, hayvanın derisini boyna kadar kesin. Ön bacaklardaki deriyi, orta hat kesisine kadar keserek Y şeklinde bir görünüm oluşturun. Arka üyelerdeki deriyi de aynı şekilde kesin.

Hemostatik forseps kullanarak, gerekirse farenin abdominal ve torasik derisini nazikçe yana doğru soyun. Bağ dokusunu nazikçe kesin.

Cildi, cildin alt kısmına bağlı meme bezlerini açığa çıkaracak şekilde 16 ila 20 gauge iğneler kullanarak polistiren köpüğe sabitleyin. Her seferinde bir bezi penset yardımıyla disseke edin. İlgili meme bezini nazikçe kaldırın ve küçük keskin makaslarla, dış kısımdan başlayarak hayvanın omurgasına doğru, bez ile cilt arasından kesin.

Bez üzerinde deri veya kas parçası kalmaması için dikkatlice kestiğinizden emin olun. Bu protokol kullanılarak tüm meme bezleri çıkarılabilir, ancak dördüncü abdominal meme bezleri bütün montaj (whole mounting) işlemi için en uygundur. Meme bezini fareden çıkardıktan sonra, doğrudan bir lam üzerine yayın.

Mümkün olduğunca düzleştirmeye çalışın. Orijinal in situ şekli korunduğunda, bez lam üzerine güzelce yapışacaktır. Çeker ocuk altında uygun şekilde gerildiğinde, lamı karnoy çözeltisi dolu bir kavanoza daldırarak bezi sabitleyin.

Oda sıcaklığında dört saat boyunca fiksatifte bekletin. Alternatif olarak, bezi dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca fikse edin. Ardından, dokuyu 15 dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın.

Ardından, kavanozdaki etanol çözeltisinin yarısını boşaltıp yerine çift distile su ekleyerek numuneyi suda kademeli olarak rehidre edin. Beş dakika inkübe edin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın, ardından beş dakika boyunca distile su ile durulayın.

Ardından, ertesi gün oda sıcaklığında gece boyunca karbon alüminyum ile bezi boyayın, tekrar kullanmak üzere karbon alüminyum boyasını çıkarın ve boyanmış dokuyu beşer dakikalık ardışık etanol banyoları aracılığıyla kademeli olarak dehidre edin. Daha sonra dokuyu gece boyunca ksilen içinde şeffaflaştırın; şeffaflaştırma işleminden sonra, görüntüler alınmaya hazır olana kadar metil salisilatı bir çeker ocak içinde tutarak meme bezini metil salisilata daldırın. Meme bezi gelişimi, kanalların bölümleri boyunca dallanma veya yan dalların sayısını sayarak nicelendirilebilir veya primer kanalların uzunluğu ya da epitel doku ile yağ dokusu alanının oranı değerlendirilebilir.

Meme bezi gelişimini ve işlevini değerlendirmek için kullanılan ikinci bir deney, bezin oksitosine maruz bırakılmasını ve epitel kanallara süt boşalımının değerlendirilmesini içerir. Bu deneyi gerçekleştirmek için, yeni beslenmiş yavrular anneden ayrılmalı ve anne bir saat boyunca izolasyonda tutulmalıdır. Ardından, anne sakrifiye edilmeli ve meme bezleri, meme bezi diseksiyonu için açıklandığı şekilde ortaya çıkarılmalıdır.

Ancak bunları hayvanın içinde bırakın. Bir transfer pipeti kullanarak, üç ila beş mililitre PBS veya oksitocin çözeltisini doğrudan ilgili meme bezinin üzerine eşit şekilde damlatarak analize başlayın. Bu prosedür için, bir tarafı kontrol olarak ve diğer tarafı ise süt atılımını test etmek için kullanarak torasik bezlerin kullanılması önerilir.

Bezleri bir dakika boyunca inkübe edin ve çözeltileri bir transfer pipeti ile dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın; kanalara süt girişini video kaydıyla veya PBS ya da oksitosin maruziyeti öncesi ve sonrası görüntüler alarak izleyin. Burada fare bellek örnekleri yer almaktadır. Düzgünce yayılmış tam bir meme bezinde, oklarla belirtilen epitel kanallar ve ok ucuyla işaretlenen lenf nodu kolayca gözlemlenebilir.

Yetersiz şekilde yayılmış bir meme bezi, lamdan ayrılabilir ve büzülerek kullanılamaz hale gelebilir. Uygun şekilde eksize edilmemiş bir meme bezinde ya bazı kısımlar eksik olabilir ya da kas veya deri parçaları kalmış olabilir. Oksitosin maruziyetini takiben, epitelyum ördeklerinde oksitosin kaynaklı süt boşalması gözlemlenebilir.

Buna karşın, yavruların son emzirmesinden sonraki latent dönemin uygunsuz şekilde uzun olması nedeniyle kanalların deney başlangıcında zaten sütle dolmuş olması durumunda, oksitosin maruziyeti sonrası kanallarda meydana gelen ek süt birikimini gözlemlemek güçtür. Alternatif olarak, yavruların emzirmesinden sonraki kısa bir latent dönem, meme bezlerinin diseksiyonu sonrası oksitosin maruziyetiyle kanallarda uygun şekilde gözlemlenebilecek kadar sütün alveollerde birikmesini engelleyecektir. Meme bezlerinin bütün halde monte edilmesi veya oksitosinle tetiklenen süt boşalımının değerlendirilmesi yerine; meme bezleri dondurulabilir, kriyoseksiyonları alınabilir ve meme bezlerindeki herhangi bir sayıda yerleşik protein için immün etiketleme yapılabilir.

Alternatif olarak, bezler lize edilebilir ve western blotting için hazırlanabilir. Bu iki değerlendirme yöntemi birlikte kullanılarak, temel genlerin eksik olduğu veya arbor gen mutasyonlarının bulunduğu çok sayıda fare modelinde bez gelişimi, farklılaşması ve fonksiyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanması sağlanmıştır.