Periferik Kan Bakteriyel Mikroflorası Sıralama: HIV ile enfekte olan hastalar ile bizim Deneyimi

Periferik kanda transloke olan bakteriyel mikrofloranın sekanslanması. HIV enfekte hastalarda edindiğimiz deneyimler; ben junior Marti, İtalya'daki Milano Üniversitesi'nin Bulaşıcı Hastalıklar ve Tropikal Tıp Kliniğinde yardımcı profesör olarak görev yapmaktayım. Şimdi sizlere, HIV enfekte hastaların periferik kanından bakteriyel DNA'nın nasıl tespit edileceği ve sekanslanacağına dair deneyleri göstereceğiz.

Sağlıklı gastrointestinal traktus, humoral ve hücresel bağışıklık sisteminin gelişimini etkileyen çok çeşitli kommensal mikroplar tarafından kolonize edilir. Mikrobiyota, güçlü bir mukozal bariyer aracılığıyla bağışıklık sisteminden korunur; ancak enfeksiyonlar, antibiyotik tedavisi, postoperatif komplikasyonların yanı sıra karsinom, pankreatit ve malnütrisyonu olan hastalarda olduğu gibi çeşitli klinik durumların ardından gastrointestinal traktusta bir değişim meydana gelir.

HIV enfeksiyonu, mukozal bağışıklığın aşamalı kaybı ve lipopolisakkarit ile bakteriyel DNA fragmanları gibi bakteriyel biyoproduktlerin sistemik dolaşıma sızmasıyla birlikte gastrointestinal bariyerin bozulmasına neden olur; bu durum sistemik immün aktivasyona katkıda bulunur. Bu çalışma, bakteriyel DNA'nın tespiti ve sekanslanmasının deneysel aşamalarını göstermektedir. HIV enfekte hastaların periferik kanında bu çalışmayı gerçekleştirecek olanlar; Milano Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Tropikal Tıp Kliniği'nde görev yapan enfeksiyon hastalıkları uzmanlık öğrencisi Camilla ti, doktora öğrencisi Esther ve doktora sonrası araştırmacı ju MariaI'dir. Deneyimiz, HIV enfekte hastalardan alınan periferik kan örneklerindeki bakteriyel türleri tanımlamayı amaçlamaktadır.

Sağlıklı bireylerin normal bağırsak homeostazı sergilediği göz önünde bulundurularak, hem HIV enfeksiyonlu hem de sağlıklı deneklerden tam kan kullanacağız. Bu hastalarda transloke olan mikroflora görmeyi beklemiyoruz. Hastalardan tam kan toplanacak ve ardından plazma ayrımı yapılacaktır.

PCIC 16 s ribozomal gen için geniş kapsamlı bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek amacıyla DNA ekstraksiyonu yapılacaktır. PCR ürününü takiben saflaştırma, klonlama ve sekanslama analizleri gerçekleştirilecektir. Deneyimizin ilk adımı venipunksiyon yoluyla kan toplama ve ardından plazma ayırmadır.

EDTA içeren tüplere yaklaşık dokuz ml tam kan alınır. Tüpler, 2000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur. Oda sıcaklığındaki santrifüj işlemi plazma ayrımını sağlar.

Şimdi plazma örneklerimizden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilecektir. Sterilitenin garanti edilmesi için kabini, pipetleri ve deney için gerekli malzemeleri uygun şekilde dezenfekte edin; tüm malzemeleri en az 30 dakika boyunca UV ışıkları altında tutun. UV ışıklarını kapatın, eldivenleri bir dezenfektan ile silin, birkaç kağıt havluyu etanolda ıslatın ve her uç atıldığında bunları kabinin altına yerleştirin. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında, pipeti ıslak kağıt havlularla silin.

Artık DNA ekstraksiyonu için hazırsınız. DNA, üretici talimatları takip edilerek ticari bir kit kullanılarak ekstre edilir. Kısaca, 2 mL'lik bir eppendorf tüpüne 350 µL plazma yerleştirilir.

Negatif kontrol olarak ultra saf su kullanılır. Örneklere, final konsantrasyonu 1 mg/mL olacak şekilde 10 µL lizozim eklenir. Ardından örnekler 30 dakika boyunca inkübe edilir.

Santrifüj işleminin ardından, talimatlara uygun olarak 37 °C'de örneklere çözelti A, kloroform ve çözelti B eklenir. Üç belirgin faz oluşacaktır. Süpernatant toplanır ve DNA çöktürmesi için etanolle karıştırılır, ardından DNA konsantrasyonu bir spektrofotometre ile okunur.

Bir sonraki adım, PRIC 16 s ribozomal gen için geniş kapsamlı bir PCR amplifikasyon reaksiyonudur ve PCR işlemi özel bir odada gerçekleştirilir. Bu reaktifler kullanılarak bir PCR karışımı hazırlanır. Bakteriyel Taq polimeraz kaynaklı olası kontaminasyonları önlemek için PCR karışımı, 4 °C'de, 500 G'de 30 dakika boyunca santrifüj edilir.

PCR karışımı daha sonra, amplifiye edilmesi gereken numune sayısına göre alikotlara bölünür. Negatif ve pozitif reaksiyon kontrolleri için alikotları dikkate almayı unutmayın.

TERMOSİKLÜS işlemi şu koşullar altında programlanır: beş dakika boyunca 94 °C; ardından 40 döngü boyunca 94 °C, 55 °C ve bir dakika boyunca 72 °C; son olarak 10 dakika boyunca 72 °C. Ortalama süre üç saattir.

PCR ürünleri %2'lik AGROS jelinde görselleştirilir. Bu, PCR ürünlerini gösteren %2'lik bir agros jelidir. İlk şerit 100 baz çiftlik bir marka (ladder) içermektedir.

İkinci şerit, bir PCR pozitif kontrolüdür. Üçüncü şerit negatif bir PCR kontrolü içerir. Dördüncü şerit HIV pozitif bir hastadan alınan örnekleri göstermekte ve beşinci şerit su şeridini içermektedir.

Altıncı şerit sağlıklı bir bireyden alınan örnekleri ve negatif bir PCR reaksiyonunu göstermektedir. Yedinci şerit su içermektedir. Bir sonraki adım PCR doğrulama işlemidir.

PCR ürünleri, üretici talimatları takip edilerek ticari bir kit kullanılarak saflaştırılır. Bu adım için filtre içeren birçok kolon kullanılır. PCR sonuçları bir çalışma sayfasına kaydedilir.

Şimdi, mavi-beyaz tarama yöntemini kullanarak klonlama işlemine geçeceğiz. Bu yöntem, bir vektöre başarılı DNA ligasyonunun tespit edilmesini sağlayan moleküler bir tekniktir. Vektör, kompetan hücrelere (bakterilere) transforme edilir.

Kompetan hücreler xal varlığında büyütülür. Eğer ligasyon başarılı olursa, bakteri kolonisi beyaz olur. Başarılı olmazsa koloni mavi olacaktır.

X-gal, bir hücrenin beta galaktosidaz enzimini eksprese edip etmediğini belirtmek ve E. coli kolonilerinin transformasyonunu görselleştirmek için kullanılır; IPTG ise beta galaktosidaz ekspresyonunu indükler. X-gal ve IPTG, ampisilin içeren plakalara dökülerek yayılır. PCR ürünleri, SALT ve bir klonlama vektörü içeren klonlama karışımı, üretici talimatlarına uygun olarak hazırlanır.

E coli hücreleri buz üzerinde çözdürülür. Ardından hücrelere klonlama karışımı eklenir; termal şok uygulamasının ardından plaklar 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından plaklarda beyaz ve mavi koloniler gelişir.

Beyaz koloniler PCR ürünleri için pozitiftir. İnserte ve mavi koloniler PCR ürünü inserte işlemi için negatiftir. 10 beyaz koloni ve bir mavi koloni seçilir.

Her bir koloni, iki mL sıvı LB büyüme ortamına yerleştirilir. Ampisilin ilave edilmiş ortamdaki koloniler, 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, gece boyunca büyütülmüş koloniler ticari bir mini prep kiti kullanılarak plazmit ekstraksiyonu için kullanılır.

Filtre içeren mini kolonlar bu aşama için kullanılır. Plazmid ekstraksiyonunun ardından plazmidler %0,7 AROS jel üzerinde görüntülenir. Bu, mini prep ürünlerini gösteren %0,7 AROS jeldir. İlk şerit bir kilo baz merdiven içerir.

İkinci şerit mavi kontrol kolonisini içerir. Üçüncü şeritten 12. şeride kadar olan kısımlar beyaz kolonileri içerir. Sonuçlar bir çalışma sayfasına kaydedilir, ardından sekanslama adımını takiben plazmidler amplifiye edilir.

Bu reaktifler kullanılarak bir karışım hazırlanır. PCR karışımı, amplifiye edilmesi gereken örnek sayısına göre alikotlara bölünür. Termodöngü şu koşullarda programlanır: bir dakika boyunca 96 °C, 10 saniye boyunca 96 °C, beş saniye boyunca 50 °C, dört dakika boyunca 60 °C.

25 döngü boyunca uygulanır. Ortalama süre yaklaşık bir saattir. Amplifikasyonun ardından, PCR ürünleri filtre içeren kolonlar kullanılarak saflaştırılır.

Saflaştırılmış ürünler bir plakaya yüklenir ve ardından plaka bir sekanslayıcıya yerleştirilir. Sekanslama işlemi tamamlanıp dizi elde edildikten sonra, bu dizi BLAST programında çalıştırılır ve her kolonideki bakteri türleri tanımlanır. %98 ile %100 arasında homoloji dizisi gösteren koloniler pozitif olarak kabul edilir.

Bu, HIV pozitif bir bireyin plazmasındaki bakteriyel sekanslamaya dair bir örnektir. Sonuçlarımız, HIV hastalığındaki mikrobiyal translokasyonun polimikrobiyal bir florayı içerdiğini göstermektedir. Böylelikle, HIV enfekte hastaların sistemik dolaşımda yüksek polimikrobiyal mikrobik mikroflora sergilediğini göstermiş olduk.

HIV negatif sağlıklı bireylerimizde periferik kandaki bakteriyel DNA, muhtemelen gastrointestinal sistemin bütünlüğünü yansıtacak şekilde saptama sınırının altındaydı. Araştırmamız şu anda, periferik kandaki mikrofloranın HIV immünopatogenezini koşullandırmadaki ve muhtemelen tedaviye verilen yanıttaki olası rolünü anlamaya ve araştırmaya odaklanmıştır.