Name: Periferik Kan Bakteriyel Mikroflorası Sıralama: HIV ile enfekte olan hastalar ile bizim Deneyimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Keşfedin periferik kan bakteriyel mikroflora dizileme yöntemini HIV enfeksiyonlu hastalarda. Bu teknik, bakteri translokasyonunu ve immün sistem etkileşimlerini araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gianni Scimone video yapma ile mükemmel destek için minnettar.

HIV ile enfekte kan örneklerinin taşınması için bazı önemli tavsiyeler gerektirir. Tüm kan örnekleri sağlam sızdırmaz kaplarda taşınmalıdır. Konteyner dış ve numune ile birlikte herhangi bir evrak kirlenmesini önlemek için numune toplarken dikkatli olmalıdır. Enfekte kan işleme tüm kişilerin eldiven giymelidir. Eldiven değişti ve ellerini örnek işlem tamamlandıktan sonra yıkanmış olmalıdır. HIV virüslü kan örnekleri İşleme sınıf II biohazard kabin kaput yapılmalıdır. Mekanik pipetleme yardımcıları kullanılmalıdır. Iğne veya diğer kavuz (cam, örneğin pipetler veya kılcal tüpleri dahil) herhangi bir alternatif var olduğu durumlar ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar yüzeyler kan dökmek sonra uygun bir kimyasal dezenfektan ile dekontamine edilmeli ve iş faaliyetleri tamamlanmıştır. Kullanılan kontamine malzeme, tekrar kullanmadan önce dekontamine edilmelidir ya da klinik atık yolla doğru atılmalıdır. Müdahalelerin etkili olabilmesi için derhal başlatılmalıdır olarak potansiyel bulaşıcı kan veya sıvıları (yani, bu gerektiren evrensel önlemler) mesleki maruziyet Her olay bir tıbbi acil olarak tedavi edilmelidir. Protokol, tamamlanması için 5 gün gerektirir. Zaman diliminde Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. Şekil 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak bakteri türlerinin tespit edilir. 1. Örnek Toplama <ol><li> 9 ml tam kan EDTA içeren tüplere içine çekilir. </li><li> Tüpler plazma elde etmek için oda sıcaklığında 10 dakika 2000 rpm'de santrifüj. </li><li> Plazma 2 ml steril Eppendorf-tüp içinde toplanır. </li></ol> 2. Plazma Örnekleri DNA Ekstraksiyon <ol><li> Kaput, pipetler ve deney için gerekli malzeme sterilite garanti altına almak için yeterince dezenfekte edin. </li><li> UV ışıkları altında en az 30 dakika için tüm malzemeleri yerleştirin. </li><li> Bir dezenfektan ile eldiven silin. </li><li> Etanol içinde ıslatın ve birkaç kağıt havlu başlık altında koyun. Her zaman bir ipucu, ıslak kağıt havlu üzerine pipet silin atılır. </li></ol> DNA, üreticinin talimatlarına (Easy-DNA Takımı, Invitrogen, Carlsbad CA, ABD) ticari kiti kullanılarak elde edilir. <ol start="5"><li> Plazma 350 mcL steril bir 2ml Eppendorf tüp yerleştirilir. </li><li> 350 mcL süzülmüş ultra saf su negatif kontrol olarak kullanılmıştır. </li><li> Örnekleri lizozim (1mg/ml) 10 mcL ekleyin. </li><li> 37 az 30 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> 500 mcL Lizis Çözüm örnekleri ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 65 yaşında 7 dakika inkübe ° C </li><li> Örnekleri kloroform 900 mcL ekleyin. </li><li> Numunelerin düzgün viskoz kadar kuvvetlice karıştırın. </li><li> Yağış Çözüm ve şiddetle vorteks 200 mcL ekleyin. </li><li> Fazlar ayrı ve arayüz oluşturmak için oda sıcaklığında 10 dakika 10.500 rpm'de örnekleri santrifüjleyin. </li><li> Üst sulu faz 1 ml% 100 etanol içeren taze mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 4 10500 rpm'de 10 dakika boyunca örnek Santrifüj ° C </li><li> Etanol çıkarın. </li><li> % 70 etanol, 1 ml ekleyin. </li><li> 4 10 dakika boyunca maksimum hızda örnekleri Santrifüj ° C </li><li> Etanol çıkarın. Bir pipettator kalan etanol ile temizlenmesi gerekir. </li><li> 50 mcL ultra saf su pelletini tekrar. </li><li> Spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu okuyun. </li></ol> 3. 16S rRNA gen PCR PCR 9 Daha önce açıklandığı gibi yapılır. <ol><li> 10X PCR tampon, 5 mcL 25 mM MgCl2, 5 mcL 2 mM toplam dNTP, 50 mcM astar RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT) 1 mcL, 50 mcM astar DG74 1 mcL 10 mcL oluşan 100 mcL reaksiyon karışımının DNA Amplify (AGGAGGTGATCCAACCGCA), H20 34 mcL ve Taq polimeraz (AmpliTaq Gold, Uygulamalı Biosystem, Foster City, CA, USA) 0.5 mcL. </li><li> Bakteriyel Taq polimeraz ile olası kontaminasyonu önlemek amacıyla filtreler PCR karışımı aktarın. </li><li> 4 500 RCF az 30 dakika santrifüj filtreleri (Microcon, Millipore, Billerica, MA, ABD) ° C </li><li> (Pozitif ve negatif PCR denetimleri, örnekler ve çıkarılan su) yükseltilecek gereken örnekleri sayısına göre kısım PCR karışımı. </li><li> Aşağıdaki termal cycler koşulları: 94 ° C 10 dakika boyunca, her zaman için 1 dakika 40 kez 94 ° C, 55 ° C ve 72 ° C ve 72 ° C'de 10 dakika </li><li> PCR ürünü% 2 agaroz jel üzerinde gözünüzde canlandırın. 100 bp DNA merdiven kullanın. PCR ürününün boyutu 360 bp (Şekil 3) hakkında. </li></ol> 4. PCR Ürün Arıtma Sadece PCR pozitif örnekler arındırılmalıdır. Arıtma kullanılarak yapılırticari kit aşağıdaki üreticinin talimatlarına (PCR PureLink microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Izopropanol içeren PCR ürünü 1 hacim başına 4 cilt Cilt Tampon ekleyin. </li><li> Bir sütun bağlama Tampon PCR ürünü aktarın. </li><li> RT 10000 RCF 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Yıkama Tamponu etanol içeren sütun yıkayın. </li><li> RT 10000 RCF 1 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Silika membran kuru ve etanol ile herhangi bir kalıntı Yıkama Tamponu kaldırmak için RT 1 dakika maksimum hızda santrifüjleyin. </li><li> 10 mcL ultra saf su ekleyin. </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Saflaştırılmış DNA toplamak için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. </li></ol> 5. Klonlama Lysogeny Broth (LB) Levha Hazırlık <ol><li> LB karışımı yaklaşık 800 ml su 25 gr eritin. </li><li> Son hacmi 1 L'ye getirin </li><li> Bactoagar, 15 gr. </li><li> 20 dakika için Otoklav. </li><li> Otoklav sonrası şiddetle girdap balonuna çözüm erimiş agar karıştırmak için. </li><li> 50 ° C'ye kadar çözüm soğutun </li><li> Ampisilin (50 mg / ml) ve girdap eriyene kadar ekleyin. </li><li> Yaklaşık 3mm derinliğe kadar plakaları dökün. </li><li> Plakaları oda sıcaklığında bekletin. </li><li> 37 her LB plaka ve inkübe yayıldı X-Gal (40mg/ml) ve IPTG (100 mM) ° C kullanıma hazır olana kadar. </li></ol> Yetkili Hücreler Dönüşüm Dönüşüm ticari kit aşağıdaki üreticinin talimatlarına (Topo TA klonlama kiti, Invitrogen, Carlsbad CA, USA) kullanılarak yapılır. <ol><li> Klonlama reaksiyon karışımı (1-4 mcL taze PCR ürünü, tuz solüsyonu 1 mcL, vektör ve gerekirse su 1 mcL) hazırlayın. </li><li> Reaksiyon hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin. </li><li> Buz üzerinde reaksiyon yerleştirin. </li><li> Yetkili hücrelerinin bir şişe içine klonlama reaksiyon 2 mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 42 az 30 saniye için ısı-şok hücreleri ° C </li><li> Hemen buz tüp transferi. </li><li> Orta 250 mcL ekleyin. </li><li> Tighly tüp Cap ve 37 tüp yatay sallamak ° C 1 saat. </li><li> Prewarmed seçici bir plaka üzerinde her dönüşümü 50 mcL sürün. </li><li> 37 o gece inkübe ° C </li></ol> Takiben kuluçka plakalar, beyaz ve mavi koloniler gelişir. Beyaz koloniler PCR ürününün yerleştirilmesi için pozitif ve mavi koloniler PCR ürününün yerleştirilmesi için negatif. 6. Sıralama Analizi Sıralama Reaksiyon <ol><li> 2,5 ul DNA, 1 ul astar (ul / 5pmol) 1,1 ul BigDye (Uygulamalı Biosystem, Foster City, CA, USA): bir karışımı bu reaktifler kullanılarak yapılır. </li><li> Termal cycler koşulları: 96 ° C 1 dakika, 4 dakika 15 saniye ve 60 ° C için 10 saniye, 55 ° C 96 ° C için 25 kez. </li></ol> Sütun Arıtma <ol><li> Her reaksiyon için, bir MicroSpin Sütun (Qiagen, Milano, İtalya) hazırlar. </li><li> Reçine karışımı sütun ve vorteks tersine çevirin. </li><li> Snap, sütunun alt = kapağı gevşetin açın ve bir mikrosantrifüj tüp içinde yer sütun. </li><li> 1 dakika için 3200 rpm santrifüjleyin. </li><li> Sütun temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Dikkatle pipetlemeyin sütun merkezi haline tüm PCR sıralama tepki. </li><li> 1 dakika için 3200 rpm santrifüjleyin. </li><li> Arıtılmış DNA tüp (ultra saf su 20 ul) içine eluite. </li></ol> Sıralama Analizi <ol><li> 96-multiwell plaka arıtılmış örnek (20 ul) yükleyin. </li><li> Sequencer plaka yükleyin. Otomatik DNA Sekans sıralama vadede sonuçlarını gösteren bir dört renk kromatogram üretir. </li><li> Kamu dizisi veritabanlarına karşı bir sorgu olarak nükleotid dizisi Girdi. Temel Yerel Hizalama Tarama Aracı (BLAST) arama, NCBI veritabanları ve sunucular üzerinde yapılır. </li><li> 98-100% benzerliklerin sadece bakterileri ele alalım. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 prosedürü Timeline. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 tüm bakteri tanımlama prosedürü akış şemaları. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 gösteren geniş 16S rRNA geni PCR ürünleri% 2 agaroz jel. Lane 1 100bp DNA merdiveni içerir, şerit 2 PCR pozitif denetimi içeren, şerit 3 PCR negatif kontrol gösterir. Lane 4 HIV-pozitif hasta örnekleri gösterir ve şeritli 5 su içerir. Lane 6 shsağlıklı bir birey ve bir negatif PCR reaksiyonu insanı örnekleri; şeritli 7 su içerir. Sadece HIV pozitif hastalarda pozitif bir PCR görüntüler. Ultra Saf su çıkarma adımı sırasında bir negatif kontrol olarak kullanılan herhangi bir kirlenme meydana geldiğini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Plazmid gösteren Şekil 4.% 0.7 agaroz jel miniprep prosedürü ile ayıklanır. Lane 1, 1 kilobaz DNA merdiveni içerir, 2 şeritli mavi kontrol kolonisi, 12 üzerinden 3 beyaz koloniler içerir şeritleri içerir. Mavi koloni plazmid PCR ürün eklemek içermez. Tüm 10 beyaz koloniler doğru eklemek plazmid içerir. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5, HIV-pozitif bir kişiden plazma bakteri sıralama analiz bir örnek gösterir. Çalışmamızın sonuçları, HIV hastalığı mikrobiyal translokasyon bakterilerin translokasyonu kontrol bağırsak bağışıklığın önemli yetmezliği düşündüren HIV-negatif kişilerde görülür bir polimicrobic flora, içerdiğini göstermektedir.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Biz, burada, HIV ile enfekte bireylerin periferik kan bakteri translokasyonu karakterize bir PCR / sıralama protokol göstermektedir.</p&gt;<p class="jove_content"EDTA içeren tüplere toplanan plazma kullanırken&gt; En güvenilir sonuçlar elde edilir. Kan örneklemesi sonra, plazma hemoliz ve DNA parçası bozulması önlemek için, 2 / 3 saat içinde santrifüj ile ayrılmış olmalıdır. Örnekler -80 sonra yaklaşık 5 gün ve ° C -20 ° C&#39;de saklanır Birden fazla donma ve çözülme döngüleri bakteriyel DNA kaybına neden olabilir k...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Easty-DNA Seti </td><td> Invitrogen </td><td> K 180.001 </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> Ultrapure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lizozim </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 mcg / mL distile su </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Uygulamalı Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR primerleri </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> DNA merdiveni </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR mikro kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> LB Agar, toz </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> Distile su içinde 10 mg / ml </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> DMF içinde 40mg/mL </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> Distile su içinde 100 mM </td></tr><tr><td> Topo TA klonlama kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink Hızlı Plazmid Miniprep kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük boya </td><td> Uygulamalı Biosystem </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2.0 dönmeye kiti </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

periferik kan bakteriyel mikroflorası sıralama: hiv ile enfekte olan hastalar ile bizim deneyimi

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

Sağlıklı bir gastrointestinal sistem, humoral ve hücresel mukozal bağışıklık sistemi 1,2 gelişimini etkileyen komensal mikropların çok çeşitli fizyolojik tarafından kolonize. Mikrobiyota bağışıklık sistemini güçlü bir mukozal bariyeri ile karşı korumalıdır. Enfeksiyonlar ve antibiyotikler normal gastrointestinal sistem bariyer ve yerleşik bakteri kompozisyonu, olası bağışıklık anormallikleri 3 sonuç değiştirmek için bilinmektedir. HIV, sistemik immün aktivasyon 4-7 katkıda lipopolisakkarid ve bakteriyel DNA parçaları gibi bakteriyel bioproducts, sistemik dolaşıma mukozal bağışıklık ve kaçak ilerici yetmezliği olan gastrointestinal bariyer ihlali neden olur . Mikrobiyal translokasyon, HIV / AIDS immünopatogenezi ve tedavisi 4,8 yanıt alakalıdır . Biz, HIV ile enfekte olan hastaların periferik kan translocating bakteriler bileşimi karakterize etmek amaçlanmıştır. Amacımız takip etmek, bir sıralama analizi ile takip panbacteric 16S ribosomial gen için PCR kurdu. Kısaca, hem de HIV ile enfekte ve sağlıklı kişilerde tam kan kullanılır. Sağlıklı bireyler normal bağırsak homeostazı mevcut olduğu göz önüne alındığında, bu hastalarda mikroflora hiçbir translokasyon bekleniyor. Venipunktür ve plazma ayırma ile tam kan toplama, DNA plazmasından elde edilen ve gen 9 ribosomial panbacteric 16S için geniş bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için kullanılır. Takiben PCR ürün arıtma, klonlama ve sıralama analizleri yapılmaktadır.

Bizim deney HIV pozitif hastaların periferik kan translocating bakteri türlerinin bir sıralama analizi gerçekleştirmek için nasıl gösterecektir.

Periferik Kan Bakteriyel Mikroflorası Sıralama: HIV ile enfekte olan hastalar ile bizim Deneyimi

Sağlıklı gastrointestinal traktus, humoral gelişimi etkileyen çok çeşitli kommensal mikroplar tarafından fizyolojik olarak kolonize edilmiştir...

Periferik kanda transloke olan bakteriyel mikrofloranın sekanslanması. HIV enfekte hastalarda edindiğimiz deneyimler; ben junior Marti, İtalya'daki Milano Üniversitesi'nin Bulaşıcı Hastalıklar ve Tropikal Tıp Kliniğinde yardımcı profesör olarak görev yapmaktayım. Şimdi sizlere, HIV enfekte hastaların periferik kanından bakteriyel DNA'nın nasıl tespit edileceği ve sekanslanacağına dair deneyleri göstereceğiz.Sağlıklı gastrointestinal traktus, humoral ve hücresel bağışıklık sisteminin gelişimini etkileyen çok çeşitli kommensal mikroplar tarafından kolonize edilir. Mikrobiyota, güçlü bir mukozal bariyer aracılığıyla bağışıklık sisteminden korunur; ancak enfeksiyonlar, antibiyotik tedavisi, postoperatif komplikasyonların yanı sıra karsinom, pankreatit ve malnütrisyonu olan hastalarda olduğu gibi çeşitli klinik durumların ardından gastrointestinal traktusta bir değişim meydana gelir.HIV enfeksiyonu, mukozal bağışıklığın aşamalı kaybı ve lipopolisakkarit ile bakteriyel DNA fragmanları gibi bakteriyel biyoproduktlerin sistemik dolaşıma sızmasıyla birlikte gastrointestinal bariyerin bozulmasına neden olur; bu durum sistemik immün aktivasyona katkıda bulunur. Bu çalışma, bakteriyel DNA'nın tespiti ve sekanslanmasının deneysel aşamalarını göstermektedir. HIV enfekte hastaların periferik kanında bu çalışmayı gerçekleştirecek olanlar; Milano Üniversitesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Tropikal Tıp Kliniği'nde görev yapan enfeksiyon hastalıkları uzmanlık öğrencisi Camilla ti, doktora öğrencisi Esther ve doktora sonrası araştırmacı ju MariaI'dir. Deneyimiz, HIV enfekte hastalardan alınan periferik kan örneklerindeki bakteriyel türleri tanımlamayı amaçlamaktadır.Sağlıklı bireylerin normal bağırsak homeostazı sergilediği göz önünde bulundurularak, hem HIV enfeksiyonlu hem de sağlıklı deneklerden tam kan kullanacağız. Bu hastalarda transloke olan mikroflora görmeyi beklemiyoruz. Hastalardan tam kan toplanacak ve ardından plazma ayrımı yapılacaktır.PCIC 16 s ribozomal gen için geniş kapsamlı bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek amacıyla DNA ekstraksiyonu yapılacaktır. PCR ürününü takiben saflaştırma, klonlama ve sekanslama analizleri gerçekleştirilecektir. Deneyimizin ilk adımı venipunksiyon yoluyla kan toplama ve ardından plazma ayırmadır.EDTA içeren tüplere yaklaşık dokuz ml tam kan alınır. Tüpler, 2000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur. Oda sıcaklığındaki santrifüj işlemi plazma ayrımını sağlar.Şimdi plazma örneklerimizden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilecektir. Sterilitenin garanti edilmesi için kabini, pipetleri ve deney için gerekli malzemeleri uygun şekilde dezenfekte edin; tüm malzemeleri en az 30 dakika boyunca UV ışıkları altında tutun. UV ışıklarını kapatın, eldivenleri bir dezenfektan ile silin, birkaç kağıt havluyu etanolda ıslatın ve her uç atıldığında bunları kabinin altına yerleştirin. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında, pipeti ıslak kağıt havlularla silin.Artık DNA ekstraksiyonu için hazırsınız. DNA, üretici talimatları takip edilerek ticari bir kit kullanılarak ekstre edilir. Kısaca, 2 mL'lik bir eppendorf tüpüne 350 µL plazma yerleştirilir.Negatif kontrol olarak ultra saf su kullanılır. Örneklere, final konsantrasyonu 1 mg/mL olacak şekilde 10 µL lizozim eklenir. Ardından örnekler 30 dakika boyunca inkübe edilir.Santrifüj işleminin ardından, talimatlara uygun olarak 37 °C'de örneklere çözelti A, kloroform ve çözelti B eklenir. Üç belirgin faz oluşacaktır. Süpernatant toplanır ve DNA çöktürmesi için etanolle karıştırılır, ardından DNA konsantrasyonu bir spektrofotometre ile okunur.Bir sonraki adım, PRIC 16 s ribozomal gen için geniş kapsamlı bir PCR amplifikasyon reaksiyonudur ve PCR işlemi özel bir odada gerçekleştirilir. Bu reaktifler kullanılarak bir PCR karışımı hazırlanır. Bakteriyel Taq polimeraz kaynaklı olası kontaminasyonları önlemek için PCR karışımı, 4 °C'de, 500 G'de 30 dakika boyunca santrifüj edilir.PCR karışımı daha sonra, amplifiye edilmesi gereken numune sayısına göre alikotlara bölünür. Negatif ve pozitif reaksiyon kontrolleri için alikotları dikkate almayı unutmayın.TERMOSİKLÜS işlemi şu koşullar altında programlanır: beş dakika boyunca 94 °C; ardından 40 döngü boyunca 94 °C, 55 °C ve bir dakika boyunca 72 °C; son olarak 10 dakika boyunca 72 °C. Ortalama süre üç saattir.PCR ürünleri %2'lik AGROS jelinde görselleştirilir. Bu, PCR ürünlerini gösteren %2'lik bir agros jelidir. İlk şerit 100 baz çiftlik bir marka (ladder) içermektedir.İkinci şerit, bir PCR pozitif kontrolüdür. Üçüncü şerit negatif bir PCR kontrolü içerir. Dördüncü şerit HIV pozitif bir hastadan alınan örnekleri göstermekte ve beşinci şerit su şeridini içermektedir.Altıncı şerit sağlıklı bir bireyden alınan örnekleri ve negatif bir PCR reaksiyonunu göstermektedir. Yedinci şerit su içermektedir. Bir sonraki adım PCR doğrulama işlemidir.PCR ürünleri, üretici talimatları takip edilerek ticari bir kit kullanılarak saflaştırılır. Bu adım için filtre içeren birçok kolon kullanılır. PCR sonuçları bir çalışma sayfasına kaydedilir.Şimdi, mavi-beyaz tarama yöntemini kullanarak klonlama işlemine geçeceğiz. Bu yöntem, bir vektöre başarılı DNA ligasyonunun tespit edilmesini sağlayan moleküler bir tekniktir. Vektör, kompetan hücrelere (bakterilere) transforme edilir.Kompetan hücreler xal varlığında büyütülür. Eğer ligasyon başarılı olursa, bakteri kolonisi beyaz olur. Başarılı olmazsa koloni mavi olacaktır.X-gal, bir hücrenin beta galaktosidaz enzimini eksprese edip etmediğini belirtmek ve E. coli kolonilerinin transformasyonunu görselleştirmek için kullanılır; IPTG ise beta galaktosidaz ekspresyonunu indükler. X-gal ve IPTG, ampisilin içeren plakalara dökülerek yayılır. PCR ürünleri, SALT ve bir klonlama vektörü içeren klonlama karışımı, üretici talimatlarına uygun olarak hazırlanır.E coli hücreleri buz üzerinde çözdürülür. Ardından hücrelere klonlama karışımı eklenir; termal şok uygulamasının ardından plaklar 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından plaklarda beyaz ve mavi koloniler gelişir.Beyaz koloniler PCR ürünleri için pozitiftir. İnserte ve mavi koloniler PCR ürünü inserte işlemi için negatiftir. 10 beyaz koloni ve bir mavi koloni seçilir.Her bir koloni, iki mL sıvı LB büyüme ortamına yerleştirilir. Ampisilin ilave edilmiş ortamdaki koloniler, 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, gece boyunca büyütülmüş koloniler ticari bir mini prep kiti kullanılarak plazmit ekstraksiyonu için kullanılır.Filtre içeren mini kolonlar bu aşama için kullanılır. Plazmid ekstraksiyonunun ardından plazmidler %0,7 AROS jel üzerinde görüntülenir. Bu, mini prep ürünlerini gösteren %0,7 AROS jeldir. İlk şerit bir kilo baz merdiven içerir.İkinci şerit mavi kontrol kolonisini içerir. Üçüncü şeritten 12. şeride kadar olan kısımlar beyaz kolonileri içerir. Sonuçlar bir çalışma sayfasına kaydedilir, ardından sekanslama adımını takiben plazmidler amplifiye edilir.Bu reaktifler kullanılarak bir karışım hazırlanır. PCR karışımı, amplifiye edilmesi gereken örnek sayısına göre alikotlara bölünür. Termodöngü şu koşullarda programlanır: bir dakika boyunca 96 °C, 10 saniye boyunca 96 °C, beş saniye boyunca 50 °C, dört dakika boyunca 60 °C.25 döngü boyunca uygulanır. Ortalama süre yaklaşık bir saattir. Amplifikasyonun ardından, PCR ürünleri filtre içeren kolonlar kullanılarak saflaştırılır.Saflaştırılmış ürünler bir plakaya yüklenir ve ardından plaka bir sekanslayıcıya yerleştirilir. Sekanslama işlemi tamamlanıp dizi elde edildikten sonra, bu dizi BLAST programında çalıştırılır ve her kolonideki bakteri türleri tanımlanır. %98 ile %100 arasında homoloji dizisi gösteren koloniler pozitif olarak kabul edilir.Bu, HIV pozitif bir bireyin plazmasındaki bakteriyel sekanslamaya dair bir örnektir. Sonuçlarımız, HIV hastalığındaki mikrobiyal translokasyonun polimikrobiyal bir florayı içerdiğini göstermektedir. Böylelikle, HIV enfekte hastaların sistemik dolaşımda yüksek polimikrobiyal mikrobik mikroflora sergilediğini göstermiş olduk.HIV negatif sağlıklı bireylerimizde periferik kandaki bakteriyel DNA, muhtemelen gastrointestinal sistemin bütünlüğünü yansıtacak şekilde saptama sınırının altındaydı. Araştırmamız şu anda, periferik kandaki mikrofloranın HIV immünopatogenezini koşullandırmadaki ve muhtemelen tedaviye verilen yanıttaki olası rolünü anlamaya ve araştırmaya odaklanmıştır.

sequencing-bacterial-microflora-peripheral-blood-our-experience-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

HIV tropizm viral zarf V3 bölge anlaşılmaktadır. V3 PCR, iç içe geçmiş RT-PCR, sıralı kullanarak üç nüsha olarak amplifiye ve biyoinformatik yazılımı kullanılarak yorumlanır. Örnekleri dizisi G2P puanları düşük olan 1 veya daha fazla (ler) ile non-R5 virüsü olarak sınıflandırılır.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

İnsan ko-enfeksiyonunun in vitro olarak çoğaltılması zordur. Bununla birlikte, insan sıtma parazitleri, doğal olarak HIV ile enfekte olmuş taze izole edilmiş insan periferik kan mononükleer hücreleri gibi, in vitro olarak kolayca kültürlenebilir. Bu, HIV ko-enfeksiyonu bağlamında sıtma parazitlerine karşı erken bağışıklık tepkilerini incelemek için mükemmel bir model sağlar.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Burada sunulan izole etmek için optimize edilmiş bir protokoldür, culturing, transfecting, ve HIV enfekte bireyler ve sağlıklı kontroller insan birincil monositayırt.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Keşfedin periferik kan bakteriyel mikroflora dizileme yöntemini HIV enfeksiyonlu hastalarda. Bu teknik, bakteri translokasyonunu ve immün sistem etkileşimlerini araştırmak için kullanılır.

Periferik Kan Bakteriyel Mikroflorası Sıralama: HIV ile enfekte olan hastalar ile bizim Deneyimi

Daha fazla video keşfet