Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Aşağıdaki deneyin temel amacı, aortik ve adventisiyonel sızan lökositlerin bileşimini ve fenotipini akım sitometrisi ile karakterize etmektir. Bu, ilk olarak ikinci adım olarak bir aterosklerotik aortun izole edilmesiyle elde edilir. Çevreleyen adventitia aorttan izole edilir ve her iki dokudan tek hücreli süspansiyonlar hazırlanır.

Daha sonra, lökositlerin spesifik alt kümelerini advent dokusundan ayırt etmek için floresan olarak işaretlenmiş tek hücreli süspansiyonlar ve aort duvarı sonuçları, aterogenez sırasında aort infiltre eden lökositlerin çeşitliliğini ve tek hücreli süspansiyonların akış sitometrik analizine dayalı olarak aort advent dokusu lökositlerini izole etmenin fizibilitesini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, lökositlerin tek bir aorttan birden fazla belirteç kullanılarak incelenebilmesi ve fenotiplendirilebilmesidir. Bu yöntem, ateroskleroz ve diğer vasküler inflamatuar bozuklukların patogenezinde inflamasyonun hücresel mediatörleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Aort lökositlerinin tanımlanması ve mevcut ve yeni inflamasyon mediatörlerinin fenotipik karakterizasyonu, ateroskleroz mekanizmalarının yenmesine yardımcı olacaktır. Kan için boş bir toplama tüpü ve buz üzerine PBS içeren bir toplama tüpü yerleştirin. Toplanacak her aort için, ötenazi yapılmış bir fareyi% 70 etanol ile kısaca ıslatın ve fareyi laboratuvar bandı kullanarak bir diseksiyon aşamasına sabitleyin.

Daha sonra heparinize bir şırınga kullanarak, kardiyak ponksiyon yoluyla fareden kan alın. Karın ve göğüs boşluklarını bir çift diseksiyon makası ile açın, 25 gauge iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak% 2 heparin içeren PBS ile damar sistemini tamamen perfüze edin. Daha sonra, iç organları, genital idrar organlarını, diyaframı ve dalağı inceleyin ve çıkarın, böbreğin kalbini ve aortunu sağlam bırakın.

Aort dokularında kan olmadığından emin olun. Yağ dokularını ve para aortik lenf düğümlerini aorttan dikkatlice inceleyin, aort ve adventitia'yı sağlam bırakın. Daha sonra aort kemeri ve inen, inen torasik ve abdominal kısımlar dahil olmak üzere tüm aortu toplayın.

İzole aortu PBS'li bir toplama tüpüne yerleştirin. PBS'yi aort içeren toplama tüpünden çıkarın. Aorta 2.5 mililitre bir kez aortik adventitia sindirim enzimi çözeltisi ekleyin.

Daha sonra aortu enzim çözeltisi ile 10 ila 20 dakika inkübe edin. 37 santigrat derecede. Kuluçka sırasında bir Petri kabına PBS ekleyin.

Kuluçka dönemini takiben. Kısmen sindirilmiş aortu enzim çözeltisinden PBS ile Petri kabına çok dikkatli bir şekilde aktarın. İki çift kavisli forseps kullanarak, advent doku tabakasını aorttan tek bir ünite olarak soyun.

Adventitia tamamen çıkarıldığında, adventitia'yı ve aortu ayrı faks tüplerine aktarın. Daha sonra aort ve adventitiye 2.5 mililitre bir kez aort ayrışma enzimi çözeltisi ekleyin. Aort daha küçük parçalar halinde kesilebilir.

Enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için, aort ve adventitia'yı 37 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin. Bu inkübasyonu takiben, aort ve advent doku tüplerini buz üzerine yerleştirin. Kalan dokuyu ayırmak için 70 mikron hücreli süzgeçler ve şırınga pistonları kullanarak aort ve adventitiden tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın.

Hücre süspansiyonlarını beş mililitrelik polipropilen Faks tüplerine aktarın. Hücreleri, dört santigrat derecede yerçekiminin 400 katı ile beş dakika santrifüjleme ile peletleyin. Reese, hücreleri bir mililitre faks tamponunda büktü ve hücreleri saymak için trian mavisi ve bir hemo sitometre kullandı.

Enzim muamelesi yüzey antijenlerinin ekspresyonunu etkileyebileceğinden. Enzim kokteyli olsun ya da olmasın küçük dalak parçalarını bir saat sonra 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Akış sitometrisi ile deneysel yüzey antijen ekspresyonu üzerindeki etki eksikliğini onaylayın.

Uygun sayıda yeni deney ve kontrol faks tüpünü etiketleyin. İstenen hücre dışı antijenler için deneysel ve kontrol antikor kokteyllerini ayrı bir etiketli tüp setine ekleyin. Kokteyl tüplerini buzun üzerine yerleştirin ve floroforları ışıktan korumak için üzerlerini örtün.

Daha sonra, beş aort ve adventis hücresine beş ila sekiz çarpı 10'luk bir alikotu karşılık gelen önceden etiketlenmiş faks tüplerine aktarın. Her tüpe bir mililitre faks tamponu ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapmak için boşaltarak peletlenmiş hücrelerden supan natantı çıkarın.

Önce canlı ölü, sabitlenebilir bir ölü hücre boyama kiti kullanılabilir, bir mililitre PBS ve karıştırmak için girdapta bir mikrolitre yeniden çözünmüş canlı ölü boya ekleyerek bir kez canlı ölü çözelti oluşturabilir. Daha sonra, deney ve kontrol numune tüplerine 100 ila 200 mikrolitre bir kez canlı ölü boya ekleyin. Daha sonra numuneleri karanlıkta 10 dakika boyunca diyet odası sıcaklığında inkübe edin.

Hücreleri ısı şoku ile öldürmek için karanlıkta 56 santigrat derecede canlı ölüler için tek kontrol tüpünü 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Ardından, her tüpe bir mililitre faks tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.

Tüpleri karıştırmak için girdaplamak ve ardından hücreleri santrifüjleme ile peletlemek. Süpinatı boşaltarak hücrelerden çıkarın. 100 mikrolitre FC blokajı ekleyin.

Tüm tüplere tampon fakslayın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpleri hafifçe girdaplayın. Numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın.

SUP natum'u boşaltarak hücrelerden çıkarın. Karşılık gelen tüplerine 100 mikrolitre uygun antikor kokteyli ekleyin. Canlandırmak için yavaşça girdap.

Peleti askıya alın ve tüm tüpleri 20 ila 30 dakikalık hücre dışı lekeyi takiben karanlıkta oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez yıkayın, süpernatanı boşaltın ve peletlenmiş hücreleri 300 mikrolitre% 2 Para formaldehit içinde yeniden süspanse edin, numuneleri bir akış sitometresi boyaması üzerinde çalıştırın. TER bir 19, periferik kanda dolaşmayan sindirilmiş damarların, aort hücresi süspansiyonunda analiz edilen lökositlerin çoğunun kaynağı olduğunu göstermektedir.

TER 1 1 9 pozitif kırmızı kan hücreleri, bu temsili aort hücresi süspansiyonundaki hücrelerin %18'ini oluşturur. Bu, aort ayrışma enzimi kokteylinin sit yüzey antijenleri üzerindeki etkilerinden türetilen kanın aort hücre süspansiyonlarından izole edilen hücrelerin %0.02'sinden daha azının değerlendirildiğini göstermektedir. Enzim kokteylinin, burada görüldüğü gibi CD 45 veya CD 19'un ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktur, ayrıca CD üç TCR, alfa beta TCR Gama deltası ve bu şekilde gösterilmeyen diğer birkaç yüzey antijeni üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Sonraki birkaç şekilde, canlı aortik CD 45 pozitif lökositler, iki genç APO lipoprotein e eksikliği olan farenin havuz aortu içindeki interferon gama pozitif T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için kapılı hale getirildi. Burada, temsili bir APOE aortunun ileri ve iç saçılma profilleri, lökositleri analiz etmek için gösterilmiştir, burada görüldüğü gibi aort lökositleri üzerinde yürümek için sadece ortak lökosit antijeni CD 45 kullanılmıştır. Bu şekilde görülen aort lökositlerinin ön ve yan saçılma profilindeki yan saçılma ekseni boyunca küçük granüler popülasyon, bu hücreleri çıkarmak için lökosit yürüyüşümüzde nekrotik hücrelerin bulunduğunu düşündürmektedir

CD 45 pozitif canlı ölü negatif ileri ve yan saçılma profilinde küçük granüler olmayan hücrelerin varlığı, CD 45 pozitif canlı ölü negatif yürüyüşte hücresel fragmanların hala mevcut olduğunu düşündürmektedir. Burada görüldüğü gibi analize yalnızca daha büyük canlı hücreleri dahil etmek için poligonal bir ön taraf saçılma kapısı çizildi. TCR Alfa Beta ve interferon gama için CD 45 pozitif canlı ölü negatif ileri yan saçılma popülasyonunun incelenmesi, canlı aort lökositlerinin %6'sının TCR alfa beta pozitif interferon gama pozitif T yardımcı hücreleri olduğunu, önceki şekil serilerinde olduğu gibi benzer bir geçit şeması kullandığını, CD 68 pozitif CD 11 B pozitif makrofajlar ve interferon gama pozitif TCR alfa beta pozitif hücreler için temsili hücre içi boyama verileri olduğunu ortaya koymaktadır. 12 hafta boyunca Western diyetiyle beslenen iki A P OE boş fare, bu şekilde görüldüğü gibi beklendiği gibi aşağıdaki şekillerde görülebilir.

Batı diyetinin aortu APOE boş fareyi besledi. Aort içindeki lökositlerin büyük çoğunluğu %40 oranında CD 68 ve CD 11 B çift pozitifliği olan makrofajlardır. Diğer CD 11 B pozitif miyeloid hücreler, APOE boş fare ile beslenen aynı Western diyetinin dalağı içindeki aort lökosit popülasyonlarının% 15'ini temsil eder.

Canlı SP sitlerin %7'si CD 11 B pozitif, CD 68 pozitif makrofaj ve %10'u diğer CD 11 B pozitif miyeloid hücrelerdi. Temsili bir şeklin bu şeklinin aksine, benzer şekilde boyanmış izotip kontrol numunesi, canlı APOE boş sitlerinin sadece% 0.01'i izotip için yanlış pozitiftir. Ek olarak, batı diyetinde 12 hafta içinde APOE ile beslenen boş fareler, TCR alfa, beta pozitif interferon gama negatif T yardımcı hücreleri ve interferon gama üreten TH hücreleri aort infiltre eden ve dalak yerleşik T hücresi popülasyonlarının önemli bir bölümünü oluşturur.

Bu şekilde aov incelemesinde görüldüğü gibi, bir izotip kontrolü ile boyanmış hiçbir sit, TCR alfa beta pozitif interferon gama pozitif hücrelerin sadece% 0.5'inin interferon gama için yanlış pozitif olduğunu düşündürmektedir Burada akış sitometrisi boyaması için aort adventitisini izole etmenin fizibilitesini göstermek için, aort ve advent doku hücresi süspansiyonları için temsili CD 45 pozitif lökosit boyaması gösterilmiştir. İnfiltre olan CD 45 pozitif lökositler, adventisyel hücre süspansiyonunun yaklaşık %18'ini ve aort hücre süspansiyonunun %11'ini temsil ediyordu. Bu prosedürü denerken, aksi belirtilmedikçe bu reaktifleri ve hücreleri buz üzerinde ve karanlıkta tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, aort ve aort adventitisinden tek hücreli süspansiyonların nasıl izole edileceğini ve hazırlanacağını veya akış sitometrisi deneylerinde nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.