Name: Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: Öğrenin, ateroskleroz araştırmalarında aort ve adventisya dokularından lökosit izolasyonu ve akış sitometrisi analizi yöntemini. Bu teknik, vasküler inflamasyondaki hücresel mekanizmaları anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PO1 HL55798 (KL) ve Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0525532U (EG): Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fare aorta izolasyonu Prosedürü Kurumsal IACUC komite onayı fare ile çalışmak gereklidir. <ol><li> Heparinzed PBS heparin sodyum 1000 adet 50 ml PBS ve karıştırmak için tersini tüp ekleyerek hazırlayın. Kan ve tahsil edilecek her aort PBS içeren bir toplama tüpü boş bir toplama tüpü hazırlayın. Tüm tüpler buz tutun. </li><li> Heparinize çizim kan (1000 U / ml Heparin sodyum 0.1ml) için bir şırınga, cerrahi aletler (iki çift kavisli bir forseps, diseksiyon makas bir çift ve bir çift microshears) ve diseksiyon için bir diseksiyon sahne hazırlar. </li><li> NIH ve kemirgen ötenazi ile ilgili kurumsal IACUC komite politikalar izleyerek onaylanmış bir odasında karbon dioksit kullanarak bir fare Euthanize. Diseksiyon aşamasına fare aktarmadan önce etkinliği için kontrol edin. </li><li> Kısaca,% 70 etanol ile fare ıslatın ve diseksiyon aşamasına fare sıkın. Kalp ponksiyonu ile fare kan çizin. </li><li> Karın ve göğüs boşluklarında açın. 25 g bir iğne ile 10 ml enjektör kullanılarak, tamamen PBS tamamen, kalp ponksiyon tarafından damarlarının kan kaldırmak için% 2 heparin içeren damarsal serpmek. Aort dokular içinde hiç kan olduğundan emin olun. Perfüzyon damar duvarındaki tüm plaklar sağlam kalmasını sağlamak için küçük bir basınç ile yavaş yavaş yapılmalıdır. </li><li> Visseral organlar, genitoüriner organlar, diyafram ve dalak, böbrekler, kalp, aort zedelemeden inceleyin ve çıkarın. </li><li> Dikkatle aort ve adventisya zedelemeden, adipoz doku ve para-aortik lenf nodlarının disseke aorta uzak. Arkus aorta dahil olmak üzere tüm aorta toplayın artan, göğüs ve karın kısımları azalan. PBS ile bir toplama tüpüne izole aort yerleştirin. Izolasyon prosedürü sırasında, geminin nemli tutmaya çalışın. </li></ol> 2. Tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması <ol><li> 1X Aort Ayrılma Enzim stok Çözümü (ADES) (125 U / ml kollajenaz tip XI, 60 U / ml Hyaluronidase tip 1-s, 60 U / ml DNaz I, 450 U / ml kollajenaz tip I, 2.5 ml PBS, Galkina ark güncellenmiştir 7). Tüm enzimler Sigma-Aldrich. Buz üzerinde stok enzim çözeltisi koyun. </li><li> PBS aort içeren toplama tüpünden çıkarın. Her aort 1X ADES 2.5 ml ekleyin. Enzimatik sindirimi kolaylaştırmak veya tüm aorta dokunmadığınızdan aorta küçük parçalar halinde kesin. 1 saat 37 1X enzim solüsyonu ile aorta ° C'de (yavaş sallayarak isteğe bağlıdır). </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, aorta ayrı kesme ve onları 5ml polipropilen FACS tüpleri (BD Falcon), 70 mikron hücre süzgecinden geçen sindirilmiş aort tek hücre süspansiyonları hazırlamak. Pelet santrifüj hücreleri tarafından (400xg, 5 dakika, 4 ° C). </li><li> FACS tamponu (PBS,% 1 BSA ve% 0.05 NaN 3 ile desteklenmiş) 1ml hücrelerin yeniden süspanse ve tripan mavi, bir hemasitometre ve ışık mikroskobu kullanılarak aort hücre süspansiyonu kaç hücreleri belirlemek . Sindirim sonra elde edilen hücrelerin toplam sayısı fare yaş ve diyet veya ateroskleroz şiddeti bağlıdır. </li></ol> 3. Flow sitometri boyama <ol><li> Yeni FACS tüpleri uygun bir numarası etiketi. Genel olarak, akış sitometri deneyler, tek renk tüpleri, uygun floresan-eksi denetimleri (FMO) 8, uygun izotip kontrolleri ve bir dizi deney tüpleri olmayan bir lekeli bir kontrol tüpü, olmalıdır. Izole edilebilir aort lökositlerin sınırlı sayıda olduğundan, dalak lökosit tek kontrol boyama gerçekleştirmek için kullanılabilir. </li><li> Aort hücre süspansiyonları leke standart bir flow sitometri protokolünü kullanır. Kısaca, bir kısım FACS tüp (ler) içine bir aort hücre süspansiyonu 0.5-1x10 6 hücre transferi. Santrifüj yoluyla hücreler FACS tampon ve pelet 1 ml ekleyin. Şişeden pelet hücrelerden süpernatantı. </li><li> Fc blok çözüm ve antikor kokteyller, deney tüpleri, eksi bir floresan tüpler ve izotip tüpleri hazırlayın. 100μl, tüm boru ve parmak hareketiyle veya hücrelerin tekrar süspansiyon yavaşça girdap Fc FACS tampon bloğu (14.2μg/ml, klon 2.4G2) ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edin. </li><li> Antikor boyama, izotipi boyama ya da FMO kontrol boyama kokteyller hazırlayın. Ön titrasyon deneylerinde antikor konsantrasyonu optimal belirleyin. Fc bloğun varlığı, numune tüpleri antikor kokteyller (100ul/0.5-1.0x10 6 hücreli) ekleyin. 20-30 dakika süreyle 4 ° C'de karanlıkta. </li><li> Her tüpe 1 ml FACS tampon ekleyin, girdap santrifüj yoluyla hücrelerin karışımı, ve pelet için. Prosedürü bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Supernatant ve tekrar süspansiyon Durusu% 2 PFA 300μl pelet hücreleri. Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın. <ul><li> Not: Genelde anti-CD45 antikor (yaygın lökosit antijen marker) + lökosit sonra kapı CD45 için tüm örneklerin eklenir 7 Buna ek olarak, CD45 FMO ve izotipi kontrolleri CD45 + lökosit kapısı olarak yerleştirmek için başlangıçta kullanılan olmalıdır. CD45 ifade lökosit arasında değişebilir. </li><li> Not: düşük yoğunluklu yüzey antijenlerini ifade ya da düşük olay antijenleri saptamak için, Ar-Fikoeritrin (PE) veya Allophycocyanin (APC) gibi "parlak fluorochromes" kullanın. Buna ek olarak, birlikte birkaç eşleştirilmiş aorta havuzu nadir olaylar tespit edilebilir; ancak, bir milyondan fazla hücre kullanılması durumunda, test başına kullanılan antikorların miktarı orantılı artmıştır edilmelidir. </li><li> Not: izole aorta minimal kan Bulaşmayı olmadığından emin olmak için ve dolayısıyla aort hücre süspansiyonu, bazı deneyler TER-119, 7 kırmızı kan hücreleri (RBC) tarafından ifade edilen bir antijen için ek boyama yapıldı . Kandaki beyaz kan hücreleri (WBC), eritrosit sayısı, yaklaşık 10x10 6 hücre / ml 8x10 3 hücre / ml. TER-119 aort örnekleri ifade dayanarak, örnek kan elde edilen beyaz kan hücrelerinin yüzdesi hesaplanır. Genelde biz aort örneklerinde% 0.02 daha az kan elde edilen WBC (Şekil 1 ) </li><li> Not: enzim tedavisi yüzey antijenlerini ifade etkileyebilir, enzim sindirimi direnç ilgi antijenler için tespit edilmelidir. Kısaca, periferik lenf nodu (PLN) veya dalak küçük parçalar 37 ° C veya enzim kokteyl olmadan 1 saat süreyle inkübe. 1 saat sonra, antijenlerin ifade flow sitometri ile belirlenir. Enzim kokteyli, birden fazla yüzey antijenleri (Şekil 2) 7 üzerinde herhangi bir etkisi vardır . Diğer bazı durumlarda, enzim tedavisi antijen ekspresyonunun önemli bir kayıp sonuçlandı. Bu sorun, alternatif hücre belirteçleri kullanarak atlatılabilmişlerdir olabilir. </li><li> Not: Canlı / ölü hücre canlılığı boyama, istenirse adım 4'te sonra yapılabilir. Genellikle Live / Dead fixable Ölü Hücre Leke kiti (Invitrogen, Moleküler Problar) kullanın. Live / Dead boya hücreleri leke için, yeniden çözünmüş ölü / canlı boya karıştırmak için 1 ml PBS ve vorteks 1μl ekleyerek 1x Live / Dead çözüm oluşturmak. 1x Live / Dead boya 100-200 ul ölü / canlı tek, kokteyl, FMO ve izotip kontrol örnekleri ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta boya ile inkübe edin. Için tek bir kontrol tüpü Dead / Canlı 56 inkübe edilmelidir ° C ısı şok hücrelerini öldürmek için 10 dakika karanlık. 1 ml santrifüj yoluyla PBS ve pelet hücreleri hücrelerin yıkayın. 5. adımı protokol devam edin. </li><li> Not: Hücre içi boyama, hücre içi antijenleri ve sitokinler için bu protokol ile uyumlu. - Kısaca ilgi antijenleri bağlı olarak, hücre içi boyama eBioscience BD Pharmingen, ya da Caltag laboratuvarlar hücre sabitleme / permeabilization reaktifler kullanarak olabilir. Düzeltmek ve intraselüler boyanması için hücreler permeabilize için, ekstrasellüler boyama adım sonra (bölüm 3 adım 5), üreticinin talimatları izleyerek, tespiti / permeabilization adım gerçekleştirmek. Hücre içi yıkama adım adım 6 (bölüm 3 adım 6) protokol devam. </li></ul></li></ol> 4. Izole çevresindeki adventisya ve damar duvarında Flow sitometri analizi Lökosit flow sitometri adventisyal ve aort lökosit incelemek için aort adventisya aort duvarının içindeki aterosklerotik plakların yanı sıra göç gibi bu iki anatomik sitelerinde flow sitometri izole etmek ve gerçekleştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. 9 Kısaca, tüm aorta önce ADES (Bölüm 2, adım 2) aort adventisya kısmen sindirilmiş ve geminin geri kalanı kaldırılır sindirilir. Adventisya kaldırıldı ve bir kenara koyun sonra geri kalanı, aort damar duvarında lökosit kurtarmak için ADES sindirilir. <ul><li> Aort adventisya İzolasyon Protokolü </li></ul><ol><li> 1X ADES (bölüm 2 Adım 1) hazırlanmasını takiben, 2.5 ml / 1X Aort adventisya sindirim enzim çözeltisi (AADES) (781,25 U kollajenaz II ve 2.5mls PBS (Worthington biyokimyasal Corp, Lakewood, NJ 14,0625 U elastaz aort hazırlamak kullanana kadar buz üzerinde)). 9 Place stok solüsyonu. </li><li> PBS aort içeren toplama tüpünden çıkarın. Her aort 1X AADES 2.5 ml ekleyin. Aorta küçük parçalar halinde kesmeyin. 10-20 dakika boyunca 37 ° 1X adventisya enzim solüsyonu ile aorta inkübe ° C </li><li> , 10-20 dakika sindirim sonra, taze PBS ile bir petri 1X AADES kısmen sindirilmiş aort dışarı aktarmak. Çok dikkatlice uzakta fr adventisyal tabakası kabuğu, iki çift kavisli bir forseps kullanarakom tek bir birim olarak aort. <ul><li> Not: Daha uzun sindirimi kolay adventisya kaldırmak için; Ancak, adventisya fazla sindirilir eğer gözyaşı olacak. </li></ul></li><li> Adventisya tamamen kaldırıldı, adventisya ve ayrı FACS tüplere aort aktarın. Adventisya tüp PBS 1ml ekleyin ve buz tüpü. Aorta tüp 2.5 ml 1X aort disosiasyon enzim çözeltisi ekleyin ve aort 40 dakika inkübe 37 ° C <ul><li> Not: enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için, bu noktada küçük parçalar halinde aort kadar bölünmüş olabilir. </li></ul></li><li> , 40 dakika sindirim sonra, buz aorta tüp yeri ve dışında aorta ve adventisya kesme ve 5ml polipropilen FACS tüpleri (BD Falcon), 70 mikron hücre süzgecinden geçerek aort ve adventisya tek hücre süspansiyonları hazırlamak. Pelet santrifüj hücreleri tarafından (400xg, 5 dakika, 4 ° C). Bölüm 2 4. adıma dönün ve protokol devam. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Burada bütün aorta bağışıklık bileşimi, aort damar duvarı ve çevre aort adventisya analiz etmek için boyama flow sitometri gösteren rakamlar bir dizi sunuyoruz. İlk olarak, tam kan ve izole aort hücre süspansiyonu (Şekil 1) TER-119 boyanma gösteren temsili bir FACS arsa göstermektedir. TER-119 pozitif kırmızı kan hücreleri aort hücre süspansiyonları izole hücrelerinin sadece% 0,014 kan kaynaklı olduğunu gösteren aort hücre süspansiyonu, hücrelerin% 18 oluşturmaktadır. Bu sindirilir damarları açıkça gösteren önemli bir kontrol deneyi, ancak aort hücre süspansiyonu analiz lökositlerin en için periferik kan dolaşan kaynağıdır. Buna ek olarak, yöntem doğrulamak için, biz splenocyte yüzey antijenlerini aort disosiasyon enzim kokteyli (Şekil 2) etkileri değerlendirildi. Enzim kokteyli dahil olmak üzere, çeşitli antijenler CD45, CD19, CD3, TCRαβ TCRγδ ve diğer bazı yüzey antijenlerini 7 ifadesi üzerinde herhangi bir etkileri vardır. Dead / Canlı canlılığı boya ve uygun izotip kontrolleri ile birlikte CD45 boyanma tespit ve ilgi alt kapısı büyük bir nüfus ve analizi sırasında hücresel enkaz dışlamak için kullanılır. Şekil 3, canlı aort CD45 + lökosit IFN yüzdesini belirlemek için kapı vardı Υ iki genç ApoE toplanmış aorta içinde + T hücreleri - / - fareler. Şekil 3 sunulan yolluk düzeni kullanarak, bu yöntemin çok yönlülüğünü vurgulamak için, Şekil 4 iki ApoE CD68 + CD11b + makrofajlar ve IFNγ + TCRαβ + hücreler için temsili hücre içi boyama bulunan 12 - / - farelerde beslenen batı diyet hafta. / - Batı diyet beslenen ApoE beklenmektedir. Aorta, aort içinde lökosit çoğunluğu makrofajlar (40% CD68 + CD11b +) veya diğer miyeloid hücrelerin (CD11b + düşük CD68 ve CD11b + CD68-) Buna ek olarak, Th1 hücreleri TCRαβ T hücreleri (Şekil 4) infiltre aort önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Aort lökositler ve lökosit alt kümelerini toplam yüzdesi, fare ve ateroskleroz şiddeti yaşına bağlı olarak değişir, ilgi büyük popülasyonlar için optimal yolluk strateji ampirik olarak tespit edilmelidir Flow sitometri boyama için aort adventisya izole fizibilite göstermek için, biz temsilcisi CD45 mevcut + aort ve adventisyal hücre süspansiyonları lökosit boyama (Şekil 5). Kısaca, üç yaşlı apoE - / - fare aorta sindirilir ve yukarıda açıklandığı gibi (Bölüm 2 ve 4) bir araya toplanmış. CD45 + lökosit İnfiltratif adventisya hücre süspansiyonu (% 18) ve kalan aort hücre süspansiyonu (% 11) tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 sindirilir aort hücre süspansiyonu TER-119 boyanmasının. Aort PBS% 2 heparin içeren kardiyak ponksiyon ile perfüze edildi. Sonra aort 37 ° C 1 saat için enzim kokteyli ile sindirilir. Aort hücreleri süspansiyon ve kan örneği (Pozitif kontrol olarak) anti-TER-119-PE Abs ile boyanmış ve flow sitometri ile analiz edildi. % 18, aorta izole bütün lökositlerin sadece% 0,014, kan kökenli lökosit olması muhtemel olduğunu belirten aort hücre süspansiyonu tüm hücreler için TER-119-pozitif kırmızı kan hücreleri hesabı. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Enzim-CD45 (üst) veya CD19 (alt) lenfositlerin ifade kokteyl tedavi etkileri vardır. + / CD19 + lenfosit yüzdeleri temsil eder. Profiller CD45 + lökosit kapılı. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 aort lökosit analizi için Ayırıcı strateji aterosklerotik eğilimli ApoE iki aorta izole toplandı. / - Yukarıda açıklandığı gibi, fareler ve aort hücre süspansiyonları hazırlandı . Hücre süspansiyonları CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), ve Ölü / Live Aqua boyanmış, ve BD FACS Calibur yükseltilmiş bir Cytek DXP 8 Renk kullanılarak analiz edildi. Kısaca, CD45 + lökosit kapılı (B) ve daha fazla (CF) analiz. Ölü hücreleri Dead / Canlı Aqua boyama (D) ve FSC araziler (E) dayalı analiz çıkarıldı. Canlı aort lökosit TCRαβ ve IFNγ ifade (F) incelendi. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Açıklandığı gibi aorta ve dalak - / - Şekil 4, hücre içi antijenleri ve sitokinler için intrasellüler boyama Hücre süspansiyonları bir bütün ApoE hazırlanmıştır . Aort (A) ve (B, C) dalak hücre süspansiyonları, CD11b, CD45 ve CD68 veya BD Cytofix / Cytoperm ™ Kiti (BD Biosciences) kullanarak bir izotip kontrol için boyandı. Hücreler CD45 + lökosit kapılanan ve enkaz ileri ve yan dağılım profilleri çıkarılmıştır. Intrasellüler IFNγ boyama için, aort ve dalak hücre süspansiyonları daha önce açıklandığı gibi, Golgi durdurma, PMA, ve Ionomycin C ile desteklenmiş RPMI 1640 yılında beş saat için kültüre edildi. 9 hücre süspansiyonları tek aort (D) ve dalak (E, F) Uyarılmış veya izotip (IgG1-eF450, F); sonradan CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC Cy7) ile boyandı, Live Ölü Aqua ve IFNγ (E eFluor 450). T hücreleri (DF) kapılı canlı CD45 + CD3 + lökosit (CD45 + Dead / Canlı Aqua-) ve TCRαβ ve IFNγ incelenir. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> / - Fareler Şekil 5 izole fare aort adventisya ve aort damar duvarında Temsilcisi görüntü Temsilcisi flow sitometri karşı komplo varlığı CD45 + yaşlı ApoE adventisya ve aort duvarının T hücreleri gösterir. SSC-yan dağılım. Enkaz ve nekrotik doku otofloresans ortadan kaldırmak için, araziler FSC&gt; 750 kapılı. Kapıları da FSC &lt;3500, SSC &lt;3500 olarak belirlendi çiftlerin ek otofloresans önlemek için. Yüzdeleri kapıları CD45 + hücreler gösterir.

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

Burada, fare aorta bağışıklık hücre kompozisyon, soruşturma için bir akış sitometri tabanlı bir yöntem mevcut. Bu yöntemin en büyük avantajı, tek bir hücrenin düzeyde aort bağışıklık hücrelerinin analiz etmek ve aort lökositlerin aktivasyonu durumunu karakterize etmek için yeteneğidir. Bu yöntem, fare aorta sınırlı ve (yayınlanmamış veri) ve diğerleri 10 internal meme arter, aort kapakları ve koroner arterler olarak insan örnekleri analiz etmek için bu yaklaşım değildir . Bu yöntemin bir sınırlama tek aorta k...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme </td><td> Katalog Numarası </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> Kollajenaz XI. </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNaz I, tip 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Kollajenaz I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Kollajenaz II. </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biyokimyasal Şirketi </td></tr><tr><td> Elastaz </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biyokimyasal Şirketi </td></tr></tbody></table>

bağışıklık hücreleri murin aorta içinde sitometrisi analizi

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Ateroskleroz, orta ve büyük boy damarların köpük hücreleri, bağışıklık hücreleri, damar endotel ve düz kas hücreleri, trombositler, ekstrasellüler matriks ve geniş nekroz ile zengin bir lipid çekirdek oluşan plakların oluşumu ile karakterizedir ve kronik inflamatuar süreç çevre dokulara fibrozis. aterosklerozun başlaması, geliştirme ve sebat 1 doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ve adaptif silah olarak katılıyor. 2, 3 Orada önemli bir kanıt gibi makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri, farklı alt dendritik hücreler, T ve B lenfositleri, sağlıklı ve ateroskleroz eğilimli fareleri 4 aorta içinde mevcut. Ayrıca, bağışıklık hücrelerini çevreleyen aort adventisya aterogenezde bu doku önemli bir rol öneren bulunur. 2 Bir süredir, bağışıklık hücreleri, kendi aktivasyon durumu ve aort duvarının içinde hücresel bileşimi farklı türde kantitatif tespit ateroskleroz çalışması için RT-PCR ve immünhistokimyasal yöntemler ile sınırlıdır. Birkaç denemeden insan aorta kullanılarak flow sitometri gerçekleştirmek için yapılmıştır ve böyle yüksek bir otofloresans gibi bir dizi sorunlar, 5,6 bildirilmiştir. İnsan aterosklerotik plakların kollajenaz 1 ile sindirilir ve boş hücreleri CD14 için toplanan ve boyandı + / CD11c + türevi makrofaj köpük hücreleri vurgulamak için. Bu çalışmada, bir &quot;alay&quot; kanal yanlış pozitif boyanma önlemek için kullanılır oldu. Aort örneklerinde yüksek otofloresans üretir enkaz büyük miktarda artış, sindirim işlemi sırasında biriken 6 Nekrotik malzeme vermek . Bu sorunu gidermek için, negatif ve pozitif kontroller bir panel teklif oldu, fakat bu örnekler sadece çift boyama uygulanan olabilir. Biz bağışıklık hücre kompozisyon analiz ve aktivasyon, çoğalması, bağışıklık hücrelerinin sağlıklı ve ateroskleroz eğilimli aort farklılaşma karakterize etmek için yeni bir akım sitometri tabanlı bir yöntem 7 geliştirdik. Bu yöntem, aort duvarının bağışıklık hücre kompozisyon soruşturma sağlar ve bu hastalık bağışıklık yönlerini araştırmalar için geniş bir yelpazede immünolojik yöntemler kullanmak için imkanlar açılır.

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Ateroskleroz, köpük hücrelerinden oluşan plakların oluşumu ile karakterize, orta ve büyük ölçekli damarların kronik inflamatuar bir sürecidir...

Aşağıdaki deneyin temel amacı, aortik ve adventisyal infiltre lökositlerin kompozisyonunu ve fenotipini akış sitometrisi ile karakterize etmektir. Bu işlem, ilk olarak aterosklerotik bir aortun izole edilmesiyle, ikinci adımda ise çevreleyen adventisyumun aorttan ayrılmasıyla ve her iki dokudan tek hücre süspansiyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.Ardından, lökositlerin spesifik alt kümelerini adventisya dokusundan ve aort duvarından ayırt etmek için floresanla işaretlenmiş tek hücre süspansiyonları elde edilir; bu sonuçlar, aterojenez sırasında aorta infiltre olan lökositlerin çeşitliliğini ve tek hücre süspansiyonlarının akış sitometrik analizine dayanarak aort adventisya dokusu lökositlerini izole etmenin uygulanabilirliğini gösterir. Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek bir aorttan çoklu markörler kullanılarak lökositlerin incelenebilmesi ve fenotiplendirilebilmesidir. Bu yöntem, aterosklerozun patogenezindeki ve diğer vasküler inflamatuar bozukluklardaki inflamasyonun hücresel mediyatörlerine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Aortik lökositlerin tanımlanması ile mevcut ve yeni inflamasyon mediyatörlerinin fenotipik karakterizasyonu, ateroskleroz mekanizmalarının aydınlatılmasına yardımcı olacaktır. Kan için boş bir toplama tüpü ve buz üzerinde PBS içeren bir toplama tüpü hazırlayın. Toplanacak her aorta için, ötenazi uygulanmış fareyi kısaca %70 ethanol ile ıslatın ve fareyi laboratuvar bandı kullanarak bir diseksiyon tablasına sabitleyin.Ardından, heparinli bir şırınga kullanarak kardiyak ponksiyon yoluyla fareden kan alın. Karın ve göğüs boşluklarını bir diseksiyon makasıyla açın ve 25 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak vasküler sistemi %2 heparin içeren PBS ile tamamen perfüze edin. Sonrasında; böbrekleri, kalbi ve aortu sağlam bırakarak visseral organları, genital üriner organları, diyaframı ve dalağı diseke edip çıkarın.Aort dokularının içinde kan kalmadığından emin olun. Aortu ve adventisyayı sağlam bırakacak şekilde, adipoz dokuları ve para-aortik lenf nodlarını aorttan dikkatlice diseke edin. Ardından, aort arkı ile torasik ve abdominal inen kısımlar da dahil olmak üzere aortun tamamını toplayın.İzole edilen aortu PBS içeren bir toplama tüpüne yerleştirin. Aortun bulunduğu toplama tüpünden PBS'yi uzaklaştırın. Aorta 2,5 milliliters bir katı aort adventisya sindirim enzimi çözeltisi ekleyin.Ardından aortu enzim çözeltisi ile 37 °C'de 10 ila 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında bir Petri kabına PBS ekleyin.İnkübasyonun ardından, kısmen sindirilmiş aortu enzim solüsyonundan PBS içeren Petri kabına çok dikkatli bir şekilde aktarın. İki çift kavisli pens kullanarak, adventisya doku tabakasını aorttan tek bir parça halinde soyarak ayırın.Adventisya tamamen uzaklaştırıldığında, adventisya ve aortu ayrı faks tüplerine aktarın. Ardından aort ve adventisyaya 2,5 milliliters bir katı aort disosiyasyon enzim çözeltisi ekleyin. Aort daha küçük parçalara bölünebilir.Enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için aortu ve adventisyayı 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, aort ve adventisya doku tüplerini buza yerleştirin. Kalan dokuları parçalamak için 70 µm hücre süzgeçleri ve şırınga pistonları kullanarak aort ve adventisyadan tek hücre süspansiyonları hazırlayın.Hücre süspansiyonlarını beş mililitrelik polipropilen Fax tüplerine aktarın. Hücreleri 4 °C'de, 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Hücreleri bir mililitre fax tamponu ile yeniden süspande edin ve hücreleri saymak için trypan mavisi ve bir hemositometre kullanın.Enzim işlemi yüzey antijenlerinin ekspresyonunu etkileyebileceğinden, dalağın küçük parçalarını enzim kokteyli ile veya kokteyl olmadan 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Deneysel yüzey antijen ekspresyonu üzerindeki etkisizliği akış sitometrisi ile doğrulayın.Uygun sayıda yeni deneysel ve kontrol faks tüpünü etiketleyin. İstenen hücre dışı antijenler için deneysel ve kontrol antikor kokteyllerini ayrı bir etiketli tüp setine ekleyin. Kokteyl tüplerini buz üzerine yerleştirin ve floroforları ışıktan korumak için üzerlerini kapatın.Ardından, 5 ila 8 × 10⁵ aort ve adventis hücresinden oluşan bir alikotu, önceden etiketlenmiş ilgili FACS tüplerine aktarın. Her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyin ve hücreleri santrifüj ederek çöktürün. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için, çöktürülen hücrelerin üzerindeki süpernatantı dekantasyon yoluyla uzaklaştırın.Öncelikle canlı/ölü ve fikse edilebilir ölü hücre boyama kiti kullanılabilir; 1 mL PBS içerisine 1 µL yeniden çözünmüş canlı/ölü boyası ekleyerek ve karıştırmak için vorteksleyerek 1x canlı/ölü çözeltisi hazırlayın. Ardından, deneysel ve kontrol örnek tüplerine 100 ila 200 µL 1x canlı/ölü boyası ekleyin. Daha sonra örnekleri boya ile birlikte oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.Hücreleri ısı şokuyla öldürmek için, canlı-ölü tayini için kullanılan tek kontrol tüpünü 56 °C'de karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüm hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve santrifüj ederek hücreleri çöktürün. Ardından, her tüpe 1 mL fax tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.Tüpler karışana kadar vortekslenir ve ardından hücreler santrifüj ile çöktürülür. Üst faz, dekantasyon yoluyla hücrelerden uzaklaştırılır. 100 µL FC bloklama eklenir.Tüm tüplere Fax tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden süspand etmek için tüpleri hafifçe vorteksleyin. Örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri daha önce yapıldığı gibi yıkayın.Dekantasyon yoluyla hücrelerden SUP natum'u uzaklaştırın. İlgili tüplere 100 µL uygun antikor kokteyli ekleyin. Resüspansiyon için hafifçe vorteksleyin.20 ila 30 dakikalık hücre dışı boyamanın ardından, pellet'i süspande edin ve tüm tüpleri oda sıcaklığında, karanlıkta 20 ila 30 dakika inkübe edin. Hücreleri daha önce olduğu gibi iki kez yıkayın, süpernatantı dökün ve pelletlenmiş hücreleri 300 µL %2 Paraformaldehit içinde yeniden süspande edin; ardından örnekleri bir akış sitometresinde analiz edin. TER one 19, aortik hücre süspansiyonunda analiz edilen lökositlerin çoğunun kaynağının, dolaşan periferik kan değil, sindirilmiş damarlar olduğunu göstermektedir.Bu temsili aort hücre süspansiyonundaki hücrelerin %18'ini TER 1 1 9 pozitif kırmızı kan hücreleri oluşturmaktadır. Bu durum, aort hücre süspansiyonlarından izole edilen hücrelerin %0,02'sinden daha azının kandan türediğini göstermektedir; aort disosiyasyon enzim kokteylinin hücre yüzey antijenleri üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. Burada görüldüğü üzere enzim kokteylinin CD 45 veya CD 19 ekspresyonunun yanı sıra CD üç TCR, alfa beta TCR Gamma delta ve bu şekilde gösterilmeyen diğer birçok yüzey antijeni üzerinde hiçbir etkisi yoktur.Sonraki birkaç şekilde, iki genç APO lipoprotein e eksik farelerin aort havuzundaki interferon gamma pozitif T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için canlı aortik CD 45 pozitif lökositler kapılandı. Burada, lökositleri analiz etmek için temsili bir APOE aortunun ileri ve yan saçılım profilleri gösterilmiştir; aortik lökositleri kapılandırmak için burada görüldüğü gibi yalnızca ortak lökosit antijeni CD 45 kullanılmıştır. Bu şekildeki aortik lökositlerin ileri ve yan saçılım profilinde, yan saçılım ekseni boyunca görülen küçük granüler popülasyon, lökosit kapımızda nekrotik hücrelerin mevcut olduğunu göstermektedir; bu hücreleri uzaklaştırmak için canlı lökositleri kapılandırmak amacıyla live dead aqua kullanılmış ve bu, bu şekilde görülen temsili popülasyonun %30'unu oluşturmuştur.CD 45 pozitif canlı ölü negatif ileri ve yan saçılım profilinde küçük granülsüz hücrelerin bulunması, CD 45 pozitif canlı ölü negatif kapısında halen hücresel fragmanların mevcut olduğunu göstermektedir. Burada görüldüğü gibi, analize yalnızca daha büyük canlı hücreleri dahil etmek için poligonal bir ileri yan saçılım kapısı çizilmiştir. CD 45 pozitif canlı ölü negatif ileri yan saçılım popülasyonunun TCR Alfa Beta ve interferon gamma açısından incelenmesi, önceki şekil serilerindekine benzer bir kapılama şeması kullanıldığında, canlı aortik lökositlerin %6'sının TCR alfa beta pozitif interferon gamma pozitif T yardımcı bir hücreleri olduğunu ortaya koymaktadır. 12 hafta boyunca Batı diyeti ile beslenen iki A P OE null fareden elde edilen CD 68 pozitif CD 11 B pozitif makrofajlar ve interferon gamma pozitif TCR alfa beta pozitif hücreler için temsili hücre içi boyama verileri, bu şekilde görüldüğü üzere beklendiği gibi sonraki şekillerde görülebilir.Batı tipi diyetle beslenen APOE null bir farenin aortu. Aort içindeki lökositlerin çoğunluğu, %40 oranında CD 68 ve CD 11 B çift pozitifliği gösteren makrofajlardır. Diğer CD 11 B pozitif miyeloid hücreler, aynı Batı tipi diyetle beslenen APOE null farenin dalağındaki aortik lökosit popülasyonunun %15'ini oluşturmaktadır.Canlı SP hücrelerinin %7'si CD 11 B pozitif CD 68 pozitif makrofajlar ve %10'u diğer CD 11 B pozitif myeloid hücrelerdi. Buna karşılık, benzer şekilde boyanmış temsili bir izotip kontrol örneğinin bu figüründe, canlı APOE null hücrelerin sadece %0,01'i izotip için yanlış pozitif çıkmıştır. Ek olarak, batı diyetiyle beslenen APOE null farelerde 12 hafta içinde, TCR alfa, beta pozitif interferon gama negatif T yardımcı hücreleri ve interferon gama üreten TH bir hücreleri, aorta infiltre olan ve dalakta yerleşik T-hücresi popülasyonlarının büyük bir kısmını oluşturmaktadır.Bu şekildeki aov incelemesinde görüldüğü üzere, izotip kontrolü ile boyanan hücrelerde, TCR alfa beta pozitif interferon gama pozitif hücrelerin yalnızca %0,5'inin interferon gama için yanlış pozitif olduğu görülmektedir. Akış sitometrisi boyaması için aortik adventisya izolasyonunun uygulanabilirliğini göstermek amacıyla, burada aortik ve advent doku hücre süspansiyonları için temsili CD 45 pozitif lökosit boyamaları gösterilmiştir. İnfiltre olan CD 45 pozitif lökositler, adventisyal hücre süspansiyonunun yaklaşık %18'ini ve aortik hücre süspansiyonunun %11'ini oluşturmuştur. Bu prosedür uygulanırken, aksi belirtilmedikçe reaktiflerin ve hücrelerin buz üzerinde ve karanlıkta tutulması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, akış sitometrisi deneylerinde kullanmak üzere aort ve aort adventisya'dan tek hücre süspansiyonlarının nasıl izole edileceği ve hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

flow-cytometry-analysis-of-immune-cells-within-murine-aortas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Bu iletişim kuralı izole, tanımlamak ve kararlı duruma veya enflamasyon sırasında fareler Miyokardiyum içinde ikamet eden bağışıklık hücreleri ölçmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyor. Protokol enzimatik ve mekanik sindirim daha fazla akış sitometresi tarafından analiz edilecek bir tek hücre süspansiyon nesil için birleştirir.

Yalıtım ve kalp Extravascular bağışıklık hücreleri tanımlaması

Biz hayvan diseksiyon, doku gömme, kesit, Boyama, ve brachiocephalic arterler analizini sistematik yöntemleri de dahil olmak üzere son aşama fare aterosklerotik lezyonları hücresel bileşimi karakterize etmek için standart bir protokol öneriyoruz atheroprone düz kas hücre soy izleme fare.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.

Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

Burada, murine dalak, kemik iliği, lenf düğümleri ve sinovyal doku içinde hem ekstra hem de hücre içi boyama tahlilleri kullanarak monosit/makrofaj ve T hücrealt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir akış sitometri protokolünü tanımladık ve murine osteoartritin yerleşik bir cerrahi modelini kullanıyoruz.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

Öğrenin, ateroskleroz araştırmalarında aort ve adventisya dokularından lökosit izolasyonu ve akış sitometrisi analizi yöntemini. Bu teknik, vasküler inflamasyondaki hücresel mekanizmaları anlamak için güçlü bir araç sunar.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Daha fazla video keşfet