Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Bu prosedürün genel amacı, deneysel manipülasyon sonrası metafaz iki evresindeki yumurtaların ploidisini değerlendirmektir. Öncelikle, cinsel olarak olgunlaşmış ve primerlanmış dişi farelerden tam gelişmiş oositler toplayarak başlayın. Ardından, ilgili proteini bozmak için seçtiğiniz materyalleri oositlere mikroenjeksiyon yoluyla aktarın ve oositleri in vitro ortamda mayoz ikiye metafaz evresine kadar olgunlaştırın. Sonrasında, monopolar iğcik oluşumuyla sonuçlanan mantrol tedavisi uygulayarak yumurtada kromozom yayılımını uyarın.

Nihayetinde bu sonuçlar, immünofloresan ve konfokal mikroskopi aracılığıyla yumurtanın ploidi durumunu betimleyebilir. Bu yöntem, akışkanlığa yol açan moleküler mekanizmaları anlamak gibi üreme biyolojisi ve kromozom ayrımı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikroenjeksiyon tekniğinin öğrenilmesi zor olduğundan ve birçok adımın yazı ile aktarılması güç olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Her fareden izole edilen antral folikül sayısını maksimize etmek için, cinsel açıdan olgun dişi farelere intraperitonal yolla 5 IU gebe kısrak serum gonadotropini enjekte edin.

PMSG priminginden yaklaşık 48 saat sonra, fare başına üç mililitre toplama ortamını 37 °C'de ısıtın ve en az bir saat boyunca bir mililitre kültür ortamı ile dengeleyin. Bir Petri kabına bunlardan mikro damlalar hazırlayın ve üzerini mineral yağ ile kaplayın.

Şimdi kültür ortamı kabını inkübatöre, toplama ortamı kabını ise bir lam ısıtıcıya yerleştirin. Fareyi sakrifiye edin, yumurtalıkları diseke edin ve önceden ısıtılmış toplama ortamı içeren bir saat camına yerleştirin.

Bir mililitrelik insülin şırıngası kullanarak yumurtalıkları kaba sabitleyin ve birbirine bağlanmış 27 gauge iğnelerle birkaç kez delerek antral folikülleri serbest bırakın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, ağızla çalıştırılan cam bir pipet kullanarak cumulus hücre komplekslerini toplayın. Sadece büyük antral folikülleri toplayın; daha küçük preantral folikülleri veya çıplak oositleri toplamayın.

Kompleksleri, oosit çapından biraz daha geniş bir küçük pipet yardımıyla hazırlanmış toplama ortamının bir mikro damlasına aktarın. Kumulus hücrelerini komplekslerden ayırın. Çıplak oositleri, daha geniş bir pipetle kültür ortamının bir mikro damlasına aktarın.

Oositlerin manipülasyondan önce inkübatörde en az bir saat boyunca dinlenmesine izin verin. Mekanik bir çekici kullanarak borosilikat cam kapiler tüpleri çekerek enjeksiyon pipetlerini hazırlayın. Tek kuyucuklu oda slaytından medya odasını çıkarın.

Bir mikroenjeksiyon platformu oluşturmak için, toplama ortamından beş µL'lik bir damlayı, SIR N-A-C-R-N-A veya morfino oligonükleotid enjeksiyon materyalinin 0.5 µL'lik damlasına mümkün olduğunca yakın bir konuma yerleştirin, üzerini mineral yağ ile kapatın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Enjeksiyon ve tutma pipetlerini tutuculara yerleştirin ve toplama ortamı damlasının içine konumlandırın. Piko enjektöre ve titreşim önleyici masaya bağlı olan azot tanklarını açın.

Medium ile doldururken, enjeksiyon pipetinin ucunu tutucu pipete hafifçe vurarak açın. İnkübatörden beş ila 10 adet oocyte'i platform üzerindeki toplama medium damlasına aktarın. Şimdi, clear düğmesine basarken piko enjektörün parametrelerini beş ila 10 picoliterlik bir enjeksiyon hacmi için ayarlayın.

Enjeksiyon iğnesini materyal damlasına taşıyın ve doldurun. İğneyi tekrar besiyeri damlasına geri getirin. Bir oosit yakalamak için tutucu pipeti kullanın ve enjeksiyon iğnesini, oositi ve tutucu pipeti x ekseni boyunca hizalayın.

Daha yüksek büyütme altında, çekirdeğe zarar vermemeye dikkat ederek enjeksiyon pipetini oositin içinden ilerletin. Plazma membranı delindikten sonra enjekte butonuna basın; enjeksiyon sonrası iğneyi geri çekin, oositi serbest bırakın ve işlemi tekrarlayın. Tüm oositler enjekte edildiğinde, onları genellikle 12 ila 24 saat arasında değişen istenen süre boyunca kültür ortamında tutmak üzere inkübatöre geri yerleştirin.

Ardından hücreleri birkaç damla CZB ile yıkayın, yağ altındaki bir CZB mikro damlasına aktarın ve mayoz iki metafaz aşamasına olgunlaşmalarını tamamlamaları için 16 saat inkübe edin. Dış halkasında su bulunan bir organ kültürü kabının kuyucuğuna 100 µM Mastri içeren 750 µL CZB yerleştirin. Şimdi yumurtaları birkaç damla CZB artı mastri ile yıkayın ve ardından organ kültürü kabına aktarıp bir saat boyunca inkübe edin.

Yumurtaları, PBS içinde %2 paraformaldehit içeren bir saat camında, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fiksasyon işlemine tabi tutun. Ardından, yumurtaları bloklama solüsyonuna aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca geçirgenleştirme işlemi uygulanana kadar 4 °C'de saklayın. Son olarak, birkaç kez büyük hacimli bloklama solüsyonu ile durulayın.

Prosedürün geri kalanını, ışıktan korunan nemlendirilmiş bir bölme içindeki 96 kuyucuklu plaka kapağı üzerinde gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, yumurtaları 15 dakika boyunca 25 µL'lik bloklama çözeltisi damlacıklarına aktarın. Ardından, sentromerleri işaretlemek için yumurtaları, 1/40 dilüsyonda Crest Antiserum içeren bir bloklama çözeltisi damlacığına aktarın ve en az bir saat inkübe edin.

Ardından, her birinde 15 dakika inkübe ederek üç damla bloklama çözeltisiyle yıkayın. Yumurtaları, fluoro four konjuge antikor içeren bir damla bloklama çözeltisine aktarın ve bir saat boyunca inkübe edin. Kromozomları tespit etmek için iki kez yıkayıp bloklama çözeltisi uygulayın.

Örnekleri 1/5.000 oranında seyreltilmiş cytx green ve bloklama çözeltisi içinde inkübe edin ve 5 µL vector shield ile kapatın. Yumurtaların ezilmesini önlemek için lamel köşelerinin yerleştirileceği noktalara dört küçük miktar vazelin sürün. Lameli yerleştirip oje ile mühürleyin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme aşamasına kadar 4 °C'de bir lam kitinde saklayın. 100x objektif ile görüntüleme yaparken, Z düzleminde 0,4 µm adımlarla çekim yapın ve NIH'den Image J gibi bir görüntüleme yazılımı kullanarak metafaz bölgesinin tamamını görüntüleyip sentromerleri sayın. Euploid fare yumurtaları 20 kinetokor çifti içerir, bu da euploid bir metafaz II yumurtasının bu Z projeksiyonunda toplam 40 nokta sağlar; DNA yeşil, kinetokorlar ise kırmızı renktedir.

Oklar, mikroenjeksiyon prosedürünü takiben, 17 ve 18 numaralı kinetokorlarda örtüşme olduğunu gösteren iki farklı kromatid koluna işaret etmektedir. İlgilendiğiniz proteinin pertürbasyonunun miyotik olgunlaşmayı ve gelişim potansiyelini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla Western blotting, gerçek zamanlı PCR, iğne konfigürasyonu ve kromozom hizalanma değerlendirmeleri ile in vitro fertilizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, oositlerin nasıl manipüle edileceği ve metafaz II oositlerin PLO durumunun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.