Name: Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin fare oosit mikroenjeksiyonu ve ploidi değerlendirmesi yöntemlerini. Bu teknik, üreme biyolojisi ve kromozom ayrışması alanlarındaki moleküler mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Richard M. Schultz &#39;un laboratuvarında gerçekleştirildi. Yazarlar ayrıca sentromer sayma tahlil ve onun konfokal mikroskop erişim kavramsallaştırma Michael Lampson kabul etmek istiyorum. Teresa Çan ve Francesca Duncan sentromer sayma tahlil optimize etmede yardımcı oldu. Paula Stein HD022681 tarafından desteklenen (RMS) ve Karen Schindler HD055822 tarafından desteklenmektedir.

1. Fare oosit toplama <ol><li> Her fare izole antral folikül sayısını en üst düzeye çıkarmak için, intraperitoneal 5 IU gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) ile cinsel olgun dişi fareler enjekte (Harlan 6 haftalık CF-1 fareler). </li><li> 2.5 mcM milrinon ekleyerek toplama orta (MEM / PVP) (3 ml / fare) hazırlayın ve 37 sıcak ° C Milrinon oosit folikülleri çıkarılır kez mayotik tutuklama sağlayan bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. Alternatif olarak, 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) (0.2 mM) veya dibutyryl siklik adenozin monofosfat (dbcAMP) (100 mg / ml) kullanılabilir. Glutamin (1 mM) ve milrinon (2.5 mcM), CZB 1 ml ekleyerek kültür ortamı hazırlayın ve en az bir saat için inkübatör gelmesini sağlayınız. Mineral yağ ile bir Petri kabı ve bindirme her microdrops ayarlayın. MEM / PVP çanak sıcak bir slayt dışında kalırken CZB çanak kuvöz içine yerleştirilir. (Özel ortam veya Sigma M2 ve M16) piyasada bulunan diğer toplama ve kültür ortamı, aynı zamanda düzenli olarak kullanılıyor. </li><li> Emişli PMSG Yaklaşık 48 saat sonra, CO 2 sedasyon servikal dislokasyon kullanarak fare kurban, yumurtalıkların incelemek ve önceden ısıtılmış MEM / PVP + milrinon (MEM / PVP + M) içeren bir Dürbün içine yerleştirin. </li><li> 1 ml insülin şırınga kullanarak, çanak yumurtalıkların çapa ve 27 gauge (veya dikiş) birbirine bağlanmış iğneler ile birkaç kez delinmesiyle antral foliküller bırakın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, ağız çalışan cam pipet kullanarak cumulus-oosit kompleksleri toplamak. Mikroskop kontrast çok yararlı olur. Alternatif olarak, doku ve hücreler içeren orta, bir plastik Petri kabı bir kapak pipetlenir olabilir. Sadece büyük antral foliküller ve küçük pre-antral folikülleri veya arındırılır oosit toplamak. Bir kez toplanan, sıcak slayt ve yağ altında MEM / PVP + M microdrop kompleksleri aktarın. </li><li> Küçük bir pipet kullanarak (oosit çapı biraz daha büyük) kompleksleri, kümülüs hücreleri ayırmak için pipet ve aşağı yukarı. Daha büyük bir CZB + milrinon (CZB + M) microdrop içine bir pipet ve inkübatör yer ile arındırılır oosit transfer. </li><li> Oosit manipülasyona inkübatör en az 1 saat önce kurtarmak için izin verin. </li></ol> 2. Oosit mikroenjeksiyon <ol><li> Mekanik bir çektirmenin borosilikat cam kapiller tüp çekerek enjeksiyon pipetler olun. P = 500, Isı = 300, çekin = 150, Vel = 100, Zaman = 150: Biz aşağıdaki ayarları ile Flaming-Brown mikropipet çektirmesi (Model P-97) kullanın. </li><li> 1-iyi bir odasına slayt seçim enjeksiyon malzemesi 0.5 ul damla (örneğin siRNA, Crna, morfolino oligonükleotid, vb) mümkün olduğunca yakın, MEM / PVP + M 5 ul damlatılarak mikroenjeksiyon platformu hazırlayın medya odası kaldırdı. Mineral yağ ve mikroskop sahnede yer (Şekil 1) ile kaplayın. </li><li> MEM / PVP + M. düşüş içine sahipleri ve pozisyon içine yerleştirin enjeksiyon ve tutma pipetler Picoinjector ve anti-vibrasyon masa bağlı nitrojen tankları açın. Orta ile doldururken holding pipet karşı hafifçe dokunarak enjeksiyon pipet ucu açın. Açılması çok büyükse, orta hızlı ve dışarı hareket edecek ve iğne hücre öldürecek. Çok küçük bir açılış ile Pipetler kolaylıkla tıkar. </li><li> Platform üzerinde MEM / PVP + M damla inkübatör transfer oosit (5-10). Enjekte önce picoinjector kurulum. PBal = 2.5-3.5 psi, PInj = 7.8 psi, PClear = 10-12 psi, zaman = 3s: Biz bizim picoinjector (Model PLI-100 Harvard Apparatus) aşağıdaki parametreleri kullanın. Bu sonuçlar bir enjeksiyon hacmi 5-10 pL. </li><li> Temiz basarken, malzeme düşmesi, bir iğne taşımak ve dolgu. Orta damlasına kadar dönün. </li><li> Bir oosit yakalama ve x-ekseni boyunca enjeksiyon iğnesi, oosit ve pipet tutan hizalamak için holding pipet kullanın. </li><li> Yüksek büyütme altında, çekirdeğin önlemek için dikkatli olmak oosit yoluyla enjeksiyon pipet ilerlemek. Plazma zarı delinir sonra, ENJEKTE basın. Enjeksiyondan sonra iğne geri çekin. Oosit ve tekrar bırakın. Bir kez tüm oosit enjekte edilir, inkübatör dönün. Zaman istenilen miktarda CZB + M tutun; bu kez deneysel amacı (yani siRNA ve morfolino demonte (24 saat), aşırı ekspresyonu (3-12 saat)) bağlıdır. Lütfen 24 saat daha uzun inkubasyon mayotik olgunlaşma tehlikeye dikkat. </li></ol> 3. Oosit olgunlaşma <ol><li> Inkübasyon CZB birkaç damla (olgunlaşma orta) ile oosit yıkayın ve inkübatör petrol ve yer altında olgunlaşması orta microdrop transferinden sonra. </li><li> 16 saat tam olgunlaşma t için izin ver o mayoz II metafaz. </li></ol> 4. Ploidi analizi <ol><li> CZB + monastrol (100 mcM) yeri ve dış halka su olan bir organ kültürü çanağı kuyuya 750 ul hazırlayın. </li><li> Yumurta, CZB + monastrol birkaç damla ile yıkayın ve organ kültürü çanak içine aktarabilirsiniz. 1 saat kuvöz koyun </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle PBS içinde% 2 paraformaldehid içeren bir Dürbün içine aktararak yumurta sabitleyin. Çözümü engelleme başka bir Dürbün içine aktarın. Bu yemek, işlenmiş ° C ye kadar 4 saklanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir Dürbün permeabilization solüsyonu (PBS +% 0.3 BSA +% 0.1 TritonX-100 +% 0.02 NaN 3) aktarın. Çözümü engelleme birkaç geniş hacimli ile durulayın (PBS +% 0.3 BSA + 0.01 Tween 20 +% 0.02 NaN 3). </li><li> Prosedürün geri kalan kısmı, oda sıcaklığında, ışıktan korumalı nemlendirilmiş bir odasında bir 96 plaka kapağı yapılır. Damla (~ 25 ul) dairesel girintileri içinde yerleştirilir. 15 dakika boyunca çözüm engelleme yumurta transferi. </li><li> Etiket sentromerlere, 01:40 anti-serum CREST içeren engelleme çözümünün bir damla transfer yumurta. En az 1 saat inkübe , Her biri 15 dakika inkübe engelleme çözümünün 3 damla ile yıkayın. </li><li> Cy5 veya Alexa-flor-594-konjuge anti-insan IgG (1:200) ve 1s inkübe içeren engelleme çözümünün bir damla yumurta transferi. Son adım dışında yukarıdaki adımları yıkama tekrarlayın, kromozom tespit etmek için engelleme çözümü Sytox Yeşil (1:5,000) içerir. Mount Vectashield 5 ul. Yumurta kırma önlemek için vazelin lamel nerede olacak köşelerinde 4 küçük noktalar koyun. Üst ve tırnak cilası ile mühür lamel yerleştirin. 4 slayt kutusunda saklayın ° C konfokal mikroskobi ile işleme kadar. </li><li> 100X amacı ile görüntüleme iken, Z-düzlem ve görüntü metafaz mili tüm bölgenin 0.4 mikron adımları yakalamak. Resim J (NIH) gibi görüntüleme yazılımı kullanarak sentromerlere güvenin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2, Z-euploid bir yumurtadan bir projeksiyon. MII, metafaz, euploid fare yumurtaları 20 çift kromozom içerir ve bu nedenle 40 sentromerlere var. Bazen kromozom monastrol tedaviye rağmen yaymak için başarısız olur. Bu durum zor güvenilir sentromerlere saymak ve bu nedenle analizlerde bu yumurta içermez yapar. Bazen, bir CREST immunoreaktif "spot" 1 ya da 2 sentromerlere olup olmadığını belirlemek için zor olabilir. Kromozom yönünü dikkatle not ise biri her Z-kesit analiz, çünkü Görüntü J gibi programları kullanarak yararlı, bir "nokta" tespit edildiği bölümler ve piksel yoğunluğu "noktalar" var. Mayotik mili kutup vücudun göre konumlandırılmış bağlı olarak, DNA bölgeleri üst üste ve bu numuneler analize dahil edilmemelidir. Unmanipulated anöploidi oranının düşük (~% 1-2), üreme genç farelerde in vivo ovulasyon yumurta var. Ancak, nedenleri anlaşılamamıştır, mikroenjeksiyon ve in vitro olgunlaşma prosedürler bu oranı yukarı% 10 artırabilir . Bu nedenle, herhangi bir mikroenjeksiyon çalışma kontrolü enjekte oosit dahil olduğu kritik öneme sahiptir. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Mikroenjeksiyon çanak kurmak. Sadece enjeksiyon çözüm 0.5μl damla üzerinde MEM / PVP + M 5 ul damla odasına doğru kaydırın. Mineral yağ ile kaplayın. Bu örnekte 3, 3 farklı enjeksiyon çözümler için damla ve slayt mikroskop sahnede oturan vardır. Mikroenjeksiyon iğne ve sağa sola tutarak pipet. Iğnelikler bir yansıması olduğunu unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Ploidi sonuçları. Euploid metafaz II yumurta A dan Z ye projeksiyon. DNA yeşil renkli ve eski haline döner, kırmızı renklidir. Oklar ki eski haline döner (# 17 ve # 18) örtüşme gösteren 2 ayrı kromatid silah. Euploid fare yumurtaları kinetochore 20 çift (toplam 40 "noktalar") içerir. Anöploid yumurta bu sayı üzerinde herhangi bir değişiklik içerir. Bu yordamı metafaz MI oosit yapılmış olsaydı, 40 kinetochore çift (toplam 80 "noktalar") olmazdı. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1. Reçete toplama ve mikroenjeksiyon orta için (MEM / PVP + M). Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tablo 2 "/&gt; Tablo 2. CZB orta Tarif. Tüm malzemeler embriyo kültür notu ve Sigma-Aldrich. 4 0.22μm PVDF filtreleri (biz Milipore Stericups) ve mağaza ° C ile sterilize Filtre

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
<li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li>
<li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).</li>
<li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li>
<li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li>
<li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li>
<li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li>
</ol>

Mikroenjeksiyon oositlerin mayotik olgunlaşma 10,11, 12, 13 düzenleyen mekanizmalar çalışmak için güçlü bir yöntemdir . Bu yöntem ve hedefli transgenik fare modelleri, gelişmekte olan büyük bir yatırım yapmadan önce, hipotezleri test etmek için ekonomik bir yol sağlar. Oosit toplama ve mikroenjeksiyon teknikleri tipik hücre biyolojisi prosedürleri daha master için daha fazla zaman gerektirir. Koleksiyonu ile Özel engeller genellikle koleksiyonu için uygun büyüklükte cam pipet çekerek ve somatik hücre sıyırma ve oosit inkübatör dışında olduğu zaman en aza indirmek için toplama hızını artırarak, ağız pipet kontrol içerir. Biz deneyler yapmak için önce pek çok kez pratik tavsiye ederiz. Aynı sayıda hücre korurken microdrops arasında oosit aktarma, bu yöntem ile rahat olmak için harika bir yoldur. Mikroenjeksiyon öğrenme sırasında hücre ölümü görülür. Bu enjeksiyon iğne ile oosit karşı tarafında piercing çekirdeği isabet nedenlerle çok büyük bir malzeme hacmi (yani bir iğne açılması çok büyük) enjeksiyonu da dahil olmak üzere bir dizi,, ya da meydana gelebilir enjekte edilen malzeme oosit için zehirlidir. Hayatta kalma oranı en az% 50 kadar oosit içine enjekte tampon Uygulama mastering bu tekniğin önemli. Oosit olgunlaşması için başarısız olursa milrinon yeterince seyreltilmiş olmadığını muhtemeldir. Biz olgunlaşma önce milrinon ücretsiz CZB çok büyük damlalar yoluyla oosit durulama önerilir. Ploidi analizi aşağıdaki mikroenjeksiyon mayotik olgunlaşma değerlendirmek için birçok testlerinin biridir. Laboratuvarda kullanan diğer rutin analizler kinetiği izleme mili oluşumu ve kromozom uyum ve yumurta aktivasyonu analiz ya da in vitro fertilizasyon oosit manipülasyon 14,15 gelişimsel sonuçları, 16 değerlendirmek için immünofloresan mayoz yoluyla oosit ilerleme, 17.

Özel reaktifler Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Milrinon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> 2.5mm az DMSO içinde süspanse edin </td></tr><tr><td> Madeni yağ </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Sadece embriyo test edilmiş, steril filtrelenmiş kullanabilirsiniz </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Yeşil </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> 100 mM az DMSO içinde süspanse edin </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Özel ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Ağızlık </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Dürbün </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petri Dish </td><td> Şahin </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Cam Pasteur pipetleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Yan sıcak </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Diseksiyon mikroskobu </td><td></td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Odası Slayt </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Kılcal Boru </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipet Çektirme </td><td> Flaming-Brown mikropipet çektirmesi </td><td></td><td> Model P-97 </td></tr><tr><td> Ters mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Mikromanipülatörler </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Model PLI-100 </td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> CO 2 tank </td><td></td><td></td><td> Inkübatör için </td></tr><tr><td> N2 tankı </td><td></td><td></td><td> Masa ve enjektör için </td></tr><tr><td> Anti-titreşim tablosu </td><td> Teknik Üretim </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Kuvöz </td><td></td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Holding pipetler </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td> Güzel bilim araçları </td><td></td><td> Herhangi bir standart model </td></tr><tr><td> Nemlendirilmiş haznesi </td><td></td><td></td><td> Biz tupperware </td></tr><tr><td> 96 plaka, Kapak </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Thomas bilimsel </td><td> 6663-F10 </td><td> Kalınlığı özel mikroskoplar için değişecektir </td></tr><tr><td> Merkezi iyi organ kültürü çanak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 x 15mm </td></tr></tbody></table>

fare oosit mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi değerlendirmesi

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Kromozom segregasyon hatalar anöploid hücrelere yol. Somatik hücre, anöploidi kanseri ile ilişkili ama gamet, anöploidi Down sendromu gibi kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar yol açar. Haploid gametlerin mayoz bölünme ile birleştiğinde türe özgü gelişim programları aracılığıyla oluşturur. Kromozomlar ayrı, kardeş kromatidler bağlı kalır çünkü ilk mayoz bölünme (MI) mayoz için eşsizdir. Reductional bölümü tam olarak anlaşılamamış nedenlerden dolayı, bu hataları eğilimli ve daha yaygın hataları daha mayoz II (MII) ya da erkek mayoz 1,2 hataları daha anöploidi kaynağıdır . Memelilerde, büyük, sağlam germinal vezikül (GV; nükleus) profaz MI oosit tutuklama ve ovulatuar ipuçları aldığınızda sadece mayoz devam. Bir kez mayoz bölünme devam eder, oosit tam MI ve MII, metafaz tekrar yakalama, asimetrik hücre bölünmesi tabi. Yumurta, sperm tarafından döllenmiş kadar MII tamamlayacak. Oosit in vitro kültür koşullarında 3 kurulan mayotik olgunlaşma tabi. Ve gen-hedefli transgenik fare mutantlar üretimi pahalı ve uzun süre alabilir, çünkü in vitro dişi gamet manipülasyonu daha ekonomik ve zaman tasarrufu sağlayan bir stratejidir. Burada, fareler ve mikroenjeksiyon için profaz-tutuklandı oosit izole etmek için yöntemler açıklanmaktadır. Herhangi bir malzeme tercih oosit içine tanıtıldı olabilir, ama yetkili meiotically-oosit 4,5 Crna değil, DNA transkripsiyonel sessiz çünkü, ektopik ifade çalışmaları için enjekte edilmelidir. Ploidi değerlendirmek için, MII yumurta oositlerin in vitro olgunlaşma için koşulların tanımlanması. Tarihsel, kromozom yayılan teknikleri, kromozom sayısı 6 saymak için kullanılır . Bu yöntem teknik olarak zordur ve sadece hyperploidies belirlenmesi amacıyla sınırlıdır. Burada, hipo-ve sağlam yumurta 7-8 kullanarak hyperploidies belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bipolar, iğsi 9 böylece ayıran kromozom bireysel eski haline döner, anti-CREST otoimmün serum kullanılarak kolayca algılanır ve sayılacaktır ki bir monopolar mili içine çöker kinesin-5 inhibitörü, monastrol kullanır . Çünkü bu yöntem sağlam yumurta, kromozomlar, operatör hatası nedeniyle kaybolmuş değildir.

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Kromozom ayrılmasındaki hatalar, aneuploid hücrelere yol açar. Somatik hücrelerde aneuploidi kanser ile ilişkilidir ancak gametlerde aneuploidi şuna yol açar...

Bu prosedürün genel amacı, deneysel manipülasyon sonrası metafaz iki evresindeki yumurtaların ploidisini değerlendirmektir. Öncelikle, cinsel olarak olgunlaşmış ve primerlanmış dişi farelerden tam gelişmiş oositler toplayarak başlayın. Ardından, ilgili proteini bozmak için seçtiğiniz materyalleri oositlere mikroenjeksiyon yoluyla aktarın ve oositleri in vitro ortamda mayoz ikiye metafaz evresine kadar olgunlaştırın. Sonrasında, monopolar iğcik oluşumuyla sonuçlanan mantrol tedavisi uygulayarak yumurtada kromozom yayılımını uyarın.Nihayetinde bu sonuçlar, immünofloresan ve konfokal mikroskopi aracılığıyla yumurtanın ploidi durumunu betimleyebilir. Bu yöntem, akışkanlığa yol açan moleküler mekanizmaları anlamak gibi üreme biyolojisi ve kromozom ayrımı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikroenjeksiyon tekniğinin öğrenilmesi zor olduğundan ve birçok adımın yazı ile aktarılması güç olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Her fareden izole edilen antral folikül sayısını maksimize etmek için, cinsel açıdan olgun dişi farelere intraperitonal yolla 5 IU gebe kısrak serum gonadotropini enjekte edin.PMSG priminginden yaklaşık 48 saat sonra, fare başına üç mililitre toplama ortamını 37 °C'de ısıtın ve en az bir saat boyunca bir mililitre kültür ortamı ile dengeleyin. Bir Petri kabına bunlardan mikro damlalar hazırlayın ve üzerini mineral yağ ile kaplayın.Şimdi kültür ortamı kabını inkübatöre, toplama ortamı kabını ise bir lam ısıtıcıya yerleştirin. Fareyi sakrifiye edin, yumurtalıkları diseke edin ve önceden ısıtılmış toplama ortamı içeren bir saat camına yerleştirin.Bir mililitrelik insülin şırıngası kullanarak yumurtalıkları kaba sabitleyin ve birbirine bağlanmış 27 gauge iğnelerle birkaç kez delerek antral folikülleri serbest bırakın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, ağızla çalıştırılan cam bir pipet kullanarak cumulus hücre komplekslerini toplayın. Sadece büyük antral folikülleri toplayın; daha küçük preantral folikülleri veya çıplak oositleri toplamayın.Kompleksleri, oosit çapından biraz daha geniş bir küçük pipet yardımıyla hazırlanmış toplama ortamının bir mikro damlasına aktarın. Kumulus hücrelerini komplekslerden ayırın. Çıplak oositleri, daha geniş bir pipetle kültür ortamının bir mikro damlasına aktarın.Oositlerin manipülasyondan önce inkübatörde en az bir saat boyunca dinlenmesine izin verin. Mekanik bir çekici kullanarak borosilikat cam kapiler tüpleri çekerek enjeksiyon pipetlerini hazırlayın. Tek kuyucuklu oda slaytından medya odasını çıkarın.Bir mikroenjeksiyon platformu oluşturmak için, toplama ortamından beş µL'lik bir damlayı, SIR N-A-C-R-N-A veya morfino oligonükleotid enjeksiyon materyalinin 0.5 µL'lik damlasına mümkün olduğunca yakın bir konuma yerleştirin, üzerini mineral yağ ile kapatın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Enjeksiyon ve tutma pipetlerini tutuculara yerleştirin ve toplama ortamı damlasının içine konumlandırın. Piko enjektöre ve titreşim önleyici masaya bağlı olan azot tanklarını açın.Medium ile doldururken, enjeksiyon pipetinin ucunu tutucu pipete hafifçe vurarak açın. İnkübatörden beş ila 10 adet oocyte'i platform üzerindeki toplama medium damlasına aktarın. Şimdi, clear düğmesine basarken piko enjektörün parametrelerini beş ila 10 picoliterlik bir enjeksiyon hacmi için ayarlayın.Enjeksiyon iğnesini materyal damlasına taşıyın ve doldurun. İğneyi tekrar besiyeri damlasına geri getirin. Bir oosit yakalamak için tutucu pipeti kullanın ve enjeksiyon iğnesini, oositi ve tutucu pipeti x ekseni boyunca hizalayın.Daha yüksek büyütme altında, çekirdeğe zarar vermemeye dikkat ederek enjeksiyon pipetini oositin içinden ilerletin. Plazma membranı delindikten sonra enjekte butonuna basın; enjeksiyon sonrası iğneyi geri çekin, oositi serbest bırakın ve işlemi tekrarlayın. Tüm oositler enjekte edildiğinde, onları genellikle 12 ila 24 saat arasında değişen istenen süre boyunca kültür ortamında tutmak üzere inkübatöre geri yerleştirin.Ardından hücreleri birkaç damla CZB ile yıkayın, yağ altındaki bir CZB mikro damlasına aktarın ve mayoz iki metafaz aşamasına olgunlaşmalarını tamamlamaları için 16 saat inkübe edin. Dış halkasında su bulunan bir organ kültürü kabının kuyucuğuna 100 µM Mastri içeren 750 µL CZB yerleştirin. Şimdi yumurtaları birkaç damla CZB artı mastri ile yıkayın ve ardından organ kültürü kabına aktarıp bir saat boyunca inkübe edin.Yumurtaları, PBS içinde %2 paraformaldehit içeren bir saat camında, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fiksasyon işlemine tabi tutun. Ardından, yumurtaları bloklama solüsyonuna aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca geçirgenleştirme işlemi uygulanana kadar 4 °C'de saklayın. Son olarak, birkaç kez büyük hacimli bloklama solüsyonu ile durulayın.Prosedürün geri kalanını, ışıktan korunan nemlendirilmiş bir bölme içindeki 96 kuyucuklu plaka kapağı üzerinde gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, yumurtaları 15 dakika boyunca 25 µL'lik bloklama çözeltisi damlacıklarına aktarın. Ardından, sentromerleri işaretlemek için yumurtaları, 1/40 dilüsyonda Crest Antiserum içeren bir bloklama çözeltisi damlacığına aktarın ve en az bir saat inkübe edin.Ardından, her birinde 15 dakika inkübe ederek üç damla bloklama çözeltisiyle yıkayın. Yumurtaları, fluoro four konjuge antikor içeren bir damla bloklama çözeltisine aktarın ve bir saat boyunca inkübe edin. Kromozomları tespit etmek için iki kez yıkayıp bloklama çözeltisi uygulayın.Örnekleri 1/5.000 oranında seyreltilmiş cytx green ve bloklama çözeltisi içinde inkübe edin ve 5 µL vector shield ile kapatın. Yumurtaların ezilmesini önlemek için lamel köşelerinin yerleştirileceği noktalara dört küçük miktar vazelin sürün. Lameli yerleştirip oje ile mühürleyin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme aşamasına kadar 4 °C'de bir lam kitinde saklayın. 100x objektif ile görüntüleme yaparken, Z düzleminde 0,4 µm adımlarla çekim yapın ve NIH'den Image J gibi bir görüntüleme yazılımı kullanarak metafaz bölgesinin tamamını görüntüleyip sentromerleri sayın. Euploid fare yumurtaları 20 kinetokor çifti içerir, bu da euploid bir metafaz II yumurtasının bu Z projeksiyonunda toplam 40 nokta sağlar; DNA yeşil, kinetokorlar ise kırmızı renktedir.Oklar, mikroenjeksiyon prosedürünü takiben, 17 ve 18 numaralı kinetokorlarda örtüşme olduğunu gösteren iki farklı kromatid koluna işaret etmektedir. İlgilendiğiniz proteinin pertürbasyonunun miyotik olgunlaşmayı ve gelişim potansiyelini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla Western blotting, gerçek zamanlı PCR, iğne konfigürasyonu ve kromozom hizalanma değerlendirmeleri ile in vitro fertilizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, oositlerin nasıl manipüle edileceği ve metafaz II oositlerin PLO durumunun nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, fare oosit mayoz mili montaj ve organizasyon değerlendirmek için immünoflüoresans analizi ile takip özgü siRNA aracılı mRNA tükenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, transkript in vitro tükenmesi ve farklı mili ve / veya oositlerde MTOC ilişkili faktörler fonksiyonel değerlendirmesi için uygundur.

SiRNA aracılı susturma Mouse Oositlerinin içinde mayoz Mili Değerlendirmesi

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül--dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Polarize ışık mikroskobu kullanarak insan yumurtası olgunluğunun non-invaziv değerlendirilmesi için klinik protokolün ana hatlarını salıyoruz.

İnsan Yumurtası Olgunluk Değerlendirmesi ve Klinik Uygulaması

Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Öğrenin fare oosit mikroenjeksiyonu ve ploidi değerlendirmesi yöntemlerini. Bu teknik, üreme biyolojisi ve kromozom ayrışması alanlarındaki moleküler mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet