Name: Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremasterın kas Hazırlık (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin fare kremaster kası hazırlama yöntemiyle mikrosirkülasyonun canlı görüntülenmesini. Bu teknik, kardiyovasküler araştırmalarda kan akışı ve oksijen taşınımını hücresel düzeyde incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Fare kurulu, kas kaide, vücut kama ve superfusion çözümü <ol><li> Fare kurulu: şeffaf bir dikdörtgen Pleksiglas kartı (6 "geniş X 8" uzun X 3 / 16 "kalın) mikroskop sahne sığacak şekilde yapılır." Anestezi fare cerrahi hazırlanması sırasında güvenli olduğu fare board " Cremaster'ın kas. </li><li> Kas kaide: şeffaf silastik kauçuk kaide, üreticinin ° talimatlarına göre karışık Sylgard 184, hazırlanır. Uygun bir kalıp, 15 mm kalınlığında x 50 mm çap çap tek Petri kabı. Sylgard blok bir jilet (Şekil 1C bakın.) Istenilen şekilde kesilir. Berrak su geçirmez silikon yapıştırıcı ince bir tabaka fare kuruluna Sylgard blok güvence altına almak için kullanılır. Faydalı ipuçları: Petri kabı içine Sylgard dökme, bir saat için bir vakum odasında gaz alma, sonra hava kabarcıkları ortadan kaldırır ve netliğini artırır. Sylgard için süre 50 ° C'de birkaç saat için bir laboratuvar fırın, bulaşık koyarak kısalır kür, gaz alma sonra. </li><li> Vücut kama ve ısıtma platformu: fare altında ve kaide karşı konumlandırılmış bir kama (2 "X 4" X 15 °) kökeni kaide üzerinde Cremaster'ın kas uzanan kolaylaştırır, vücudun ileri yatırır. Yüzeyine alüminyum bir platformda birleştiren iletken ısı sağlar. Bu platform, bir DC güç kaynağı (Şekil 1A) bağlı dirençler tarafından ısıtılır. Kalibre platform sıcaklığı ~ 40 ° C ~ 37 özofagus sıcaklığı korur ° C Aksi takdirde, bir lamba radyant ısı kullanılır. </li><li> Pins. Cremaster'ın kas kaide üzerinde güvenli hale getirmek için bir "L" şeklini içine bükülmüş 0.15 mm böcek pimleri, iğne hazırlanır. </li><li> Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS). Hazırlıklar ultra saf (M 18.2) H 2 O. hazırlanan bikarbonat-tamponlu PSS sürekli superfused (sulanan) Stok çözümleri 20X son çalışma konsantrasyonda hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edilir. 4 saklandığında Stok çözümleri birkaç hafta için iyi kalır ° C Bikarbonat tuzları ayrı ayrı hazırlanması ve deney günü seyreltme ile karıştırılarak kalsiyum bikarbonat yağış önler. Stok tuz solüsyonu (mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23.4 CaCl 2 oluşur. Stok bikarbonat 360 NaHCO 3. Bir denemenin yapıldığı gün, ilgili çözümler ölçülü balona son hacmi (genellikle belirli bir deney için 2 L) getirilir ve bir su banyosuna yerleştirilir ~ 37 ° C'de PSS değişikti% 5 CO 2 / ~ 15 dakika bir gaz dağıtıcı kullanarak% 95 N 2 ~ 7.4 pH ayarlar ve yağış önler. PSS% 5 CO 2 /% 95 N 2 deneyler boyunca sürekli kabarmış. Son çalışma çözeltisi bileşimi (mmol / L): 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. Anestezi ve ameliyat için hazırlık <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Fare pentobarbital sodyum (60 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Frenleyici tüp ilk enjeksiyon sırasında fare güvenliğini sağlamak için yararlı kanıtlıyor. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. İpucu: Sulandırma pentobarbital 10 mg / ml steril serum fizyolojik enjeksiyonu, doz aşımı olasılığını azaltır. </li><li> Anestezi fare ilk enjeksiyondan hemen sonra sıcak tutulmalıdır böylece ısı düzenleme uzlaşır. (Havalandırılan alüminyum sepet) ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı fare yerleştirilmesi (~ 37 kalibre ° C) iyi çalışır. Alternatif olarak, bir ısı lambası özen fare uygun bir mesafe konumlandırmak için kullanılabilir. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilene kadar fare her 5-10 dakika takip edilmelidir. 15-20 dakika sonra ek doz gerekebilir. Sabırlı olun ve özellikle obez veya yaşlı hayvanların aşırı dozda önlemek için dikkatli devam etmek en iyisidir. </li><li> Saç dikkatle ilgili bölgelerde tıraş alt karın, bel, skrotum ve bacakları kaldırılır. Aksi Cremaster'ın kas zarar skrotum ve testisler, travmayı önlemek için özellikle dikkat alınmalıdır. Taze bir alkollü bez ile gevşek saç çıkarın. </li><li> Mesane dolu ise karın duvarı üzerinden küçük bir üzüm gibi hissedeceksiniz. Cremaster'ın hazırlık deneyler sırasında idrar fare önlemek için hafif basınç mesane boşaltın. Kimwipe toplama bir etkisi süngert idrar. </li><li> Bacaklarını kaide straddling kama yatarken, sırtında fare yerleştirin. Her ayağın bağlı bir ipek sütür (4-0 veya 5-0), kaide karşı kasık fare güvenliğini sağlamak için bir ip sağlar. Göğsünde gevşek yerleştirilir ve kama için güvenli bir parça bant genel vücut konumunu sürdürmektedir. Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps kullanarak stereomikroskopta üzerinden izlerken Cerrahi işlemler yapılmaktadır. </li></ol> 3. Açık Cremaster'ın kas Cerrahi hazırlık <ol><li> Pin skrotal kese apeks (ya sağ ya da sol tarafı) ile cilde gerginlik yere kaide yerleştirilir ve sabitlenir. PSS (34-35 ° C) ile Superfusion cerrahi alanın üzerine başlatılan ve maruz kalan doku sıcak ve nemli tutmak için diseksiyon boyunca korunur. Skrotal kese ve diğer sonraki bir vakum hattına yanında bir ucundan bir fitil yerleştirilmiş (Kimwipe yapılan), atık su PSS kaldırır. Pleksiglas kurulu yapıştırılır ve kama tamamen çevreleyen ve kaide aspire olmayan herhangi bir PSS toplamak için "hendek" olarak hizmet vermektedir mikroskop üzerine PSS kaçağını önlemek için etkili bir önlem olarak hizmet silikon bir boncuk. </li><li> Skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapılır. Testis karın boşluğuna Cremaster'ın kas retrakte olması durumunda, alt karın kese içine hafif bir basınç testisin yönlendirir. Testis üzerinde Cremaster'ın kas yüzeyi, şu anda tespit edilmelidir. Bağ dokusu, skrotal cilt ve Cremaster'ın kas arasındaki Cremaster'ın doku çevresindeki kas serbest dikkatle kaldırılır. </li><li> Skrotal cilt hafifçe kaide proksimal kenarı arkasında retrakte ve her iki tarafında bir iğne ile güvence altına alınmıştır. Cremaster'ın kas yüzeyi dış yüzeyi daha sonra bağ dokusu temizlenir. Diseksiyonu nemlendirir bağ dokusu sırasında sürekli superfusion, görünürlük ve kaldırma kolaylaştırılması. </li><li> Cremaster'ın kas apeks ile pin boyuna gerilim altında yerleştirmek için kullanılır. Vasküler arz kesintileri en aza indirmek için alınan büyük bir özen ile kas ventral uzunlamasına bir kesi ile yapılır. Bu doku hasarı 14 hazırlık çevresine yakın kan akışını dinamikleri değişmiş. Bu nedenle, en aza indirmek için bu görüntüleme ve fizyolojik çalışmalar için kullanılan veri toplama, hazırlama merkezine yakın kan damarlarını etkiler. </li><li> Cremaster'ın kas epididim testisin altında ince bir bağ ile bağlıdır. Bir tarafa testis yansıtan epididim dikkatli bir şekilde ayrılmış olan bu bağ, ortaya çıkarır. Cremaster'ın kas apeks civarında küçük arter ve ven epididim bağlamak. Forseps arasında bu gemiler kapatılmasıy ve bunları birbirinden çekerek kanama en aza indirir. Testis, epididim, testis arter ve ven, (4-0 veya 5-0 ipek sütür) proksimale bağlandı ilgili kasık yağ yastığı ile birlikte kopmuş ve (orşiektomi) atılır. Alternatif olarak, testis karın boşluğuna hafifçe geri itti ve bir parça pamuk veya Kimwipe ile muhafaza edilebilir. Orşiektomi testisler karın boşluğuna geri iterek, doku mümkün travması önlemek için hizmet vermektedir. Biz işlemi 7,15 birini kullanarak Cremaster'ın mikrosirkülasyon hazırlık kalitesinde gözle görülür farklılıklar (bkz. Bölüm 3.8) bulamadı. </li><li> Cremaster'ın kas dış yüzeyinde kalan bağ dokusu temizlenir ve daha sonra kaide yüzeyinde radyal yayıldı. Kenarları bozulmamış mikrosirkülasyon çizgili kas düz bir sayfa oluşturmak için 5-6 yerlerde pimleri (bkz. Bölüm 1.4) ile teminat altına alınmıştır. </li><li> Tamamlanan hazırlık aşamasında, intravital bir mikroskop, (3-5 ml / dk, 34 ° C) sürekli superfused ve 30 dakika için dengelenmiş. </li><li> Cremaster'ın hazırlık Dürüstlük, çeşitli kriterlere göre değerlendirilecektir. Minimal cerrahi travma ile Spontan vazomotor sesi arteriol ve venüller yapışık lökosit eksikliği tempolu akışı ile gösterilir. En hassas, duyarlı bir hazırlık indeks 5-10 dakika superfusion çözüm oksijen içeriği yükselterek arteriyollerin daralma. Bu% 21 O 2 ile değişikti tarafından yapılır (vs% 5 O 2; bkz. Bölüm 1.5,% 5 CO 2, denge N 2). Arteriollerde lökosit varlığı, yokluğu, kılcal damarların akan kırmızı kan hücreleri ve / veya venüller biriken ve çevre dokulara lökosit, doku hasarı ve inflamasyon belirtileri. </li></ol> 4. Cremaster'ın kas mikrosirkülasyon intravital görüntüleme <ol><li> Olympus MVX10 Stereo Zoom platformu dayalı özel bir mikroskop intravital görüntüleme yapılır. MVX10 mikroskop vücutMVX10 melez standı aydınlık (Köhler) görüntüleme için transillüminasyon (halojen lamba) ve floresan görüntüleme için epi-aydınlatma (cıva lambası) ile donatılmış bir monte edilir. Epi-aydınlatma kullanarak, GCaMP2 520/35 nm'de emisyon toplanan ile 472/30 nm heyecanlı. Piper Kontrol Yazılımı (SPI) ile bir kişisel bilgisayar; XR/Mega-10 yoğun bir dijital fotoğraf makinesi (SPI Stanford Fotonik, Inc.) Kullanarak; Görüntüler MV PLAPO 2XC lens (Olympus sayısal diyafram = 0.50) ile elde edilir. Bu sistem sayesinde, view (FOV) gözlenen alan 553 mm X 442 mm, 22 mm X 18 mm çeşitli olabilir. </li><li> Intravital görüntüleme deneylerin tamamlanmasından sonra, anestezi fare servikal dislokasyon pentobarbital doz aşımı ile ötenazi. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 fare Cremaster'ın hazırlık intravital görüntüleme için Fare kurulu. A) alüminyum platformu ile Vücut kama (sarı plastik izolasyonlu) alttan izlendi. Platformun alt güvenli Isıtma dirençleri yapılan ısı sağlar. B) ısıtma platformu, bir plastik takoz aittir. C) vücut kama cerrahi ve intravital mikroskop sahne sonraki transfer için bir Pleksiglas tahta üzerine yerleştirilir. Sylgard kaide kırmızı ok ile gösterilir. Su geçirmez silikon boncuk mikroskop damlamasını engelleyen intravital prosedürü sırasında sızıntı olabilir herhangi bir çözüm içeren tüm hazırlık çevreler. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: widefield görüntüleme Özel MacroZoom mikroskop . A) MVX10 mikroskop XR/Mega-10 ICCD kamera ile vücut (Olympus) (Stanford Fotonik) trinoküler port üzerine monte edilmiş. B) mikroskop vücut Close-up. (A) Zoom kontrolü (0.63 6.3x), (b) filtre tekerleği, (c) görüntü doubler'i (25X optik büyütme ile NA = 0.50). C) Askat aydınlık (Köhler) aydınlatma (Kondenser NA = 0.55, Çalışma Mesafesi = 27 mm) için kondansatör. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 fare Cremaster'ın hazırlık tamamlandı. Sıcak plastik kaplamalı alüminyum platform (sarı) yatar pozisyonda anestezi altında fare. Vücut pozisyonu bant ile sabitlenir. Cremaster'ın kas şeffaf silastik lastik kaide üzerinde radyal yayıldı ve kenarlarında tutturulmuş. Superfusion çözüm plastik damlatıcı (beyaz ok) ile proksimal sonunda tanıtıldı. Bir vakum hattı (beyaz ok ucu) Kimwipe fitil yoluyla çözüm kaldırır. İki mikropipetler doku ve ipuçları ile yer gösterilir. Cremaster'ın kasının alt kenarında bir referans elektrot (gümüş tel) güvence altına alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 endotelde GCaMP2 arterioler ağları ifade görselleştirmek için büyütme aralığı anlama. A)) Floresan ve B aydınlık görüntü, video monitör toplam = 42x büyütme için 3.2x optik büyütme alınır. [Görüş alanı (FOV) = 4375 x 3470 mm. Ölçeği bar = 500 mm. Bu büyütme Çalışmak istenilen noktada mikropipetler yerleştirme kolaylaştırır. Toplam büyütme 6.4X optik büyütme alınan C) Floresan ve D) aydınlık görüntü = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Ölçeği bar = 200 mm. E) Floresan ve F) aydınlık görüntü toplam büyütme 12.6X optik büyütme = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Ölçeği bar = 100 mikron. G) görüntü katlayıcı, optik büyütme = 25.2X. Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Missouri Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanları da içeren tüm prosedürleri ve protokolleri için National Institutes Sağlık Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde gerçekleştirildi. Bu video-makale Üretim Stanford Fotonik tarafından sponsor oldu.

Burada, in vivo olarak mikrosirkülasyon gözlemlemek için fare açık Cremaster&#39;ın kas hazırlık açıklar . Bu prosedür, ilk olarak rat 4 açıklanan &quot;açık&quot; Cremaster&#39;ın hazırlık sonra modellenmiştir. Uygulama ile tüm cerrahi işlem en az 1 saat içinde tamamlanabiliyor. Bu preparatın çeşitli deneysel manipülasyon için çok yönlülük sağlar ve benzer bir biçimde incelenmesi gereken çeşitli deneysel modellerin kolayca sağlayan, hamsterlar olarak sıçanlara uyarlanmıştır. Hazırlık erkek hayvanların sınırlı ve ölçümleri, 14 kas kenarlarına yakın hasarlı bölgeler kaçınarak, dokusunun merkeze doğru yapılmalıdır . Ayrıca, basınç ve debi dağılımları Cremaster&#39;ın kas damarları birbirine 16 kesilir değişmiş iken, mikrodamarlar duyarlı ve tekrarlanabilir veri toplama için uygun kalır, kabul edilmelidir . Cremaster&#39;ın kas mikrosirkülasyon görselleştirmek için birincil kısıtı özellikle sıçanlarda hem de hamster, olgun hayvanlar ve boyutu artış gibi bağ dokusu oluşumunu. Ayrıca, hayvanların yağ olsun, pentobarbital lipofilik ve adipoz dokuda absorbe edilebilir, çünkü anestezi kontrol etmek daha da zorlaşıyor. Ilerlemek için en iyi yolu olduğunu, hayvanın ° vücut sıcaklığını 37 ~ muhafaza sağlarken hasta tarafından ° C maruz kalan doku PSS ile sürekli sulanmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Adı reaktif ya da cihaz </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Balıkçı </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Balıkçı </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Sodyum Çözümü </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Ayrıca pentobarbital olarak sodyum anılacaktır </td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrolör </td><td> Warner Aletleri </td><td> TC-344B </td><td> Alternatif: ayarlanabilir 12V DC güç kaynağı </td></tr><tr><td> Series 20 platformu ısıtıcı kiti RH-2 </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0274 </td><td> Özel yapılmış alüminyum levha gerektirir. </td></tr><tr><td> Mega-10 Kamera </td><td> Stanford Fotonik </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC objektif </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 hibrid stand </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Kontrol Yazılımı </td><td> Stanford Fotonik </td><td></td><td> Mega-10 kamera Programı </td></tr><tr><td> Stereo Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Su geçirmez Silikon (Sil) </td><td> General Electric </td><td> 47.970-72.643-LW5000 </td><td> Diğer açık silikon sızdırmazlık ürünleri aynı zamanda iş </td></tr><tr><td> 60 x 15mm Petri Dish </td><td> Balıkçı </td><td> 08-757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrodisseksiyon Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS Membran </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Böcek Pins </td><td> Austerlitz </td><td> M boyut 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Kompakt Pet Giyotin </td><td> Wahl Clipper Corp. </td><td> Model 9966 </td><td> Her kullanımdan sonra temizleyin </td></tr></tbody></table>

mikrosirkülasyon intravital görüntüleme fare cremaster&#39;ın kas hazırlık

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Homeostazının korunması, vücutta metabolik yan ürünleri ile kaldırılması ile oksijen ve besin eşlik eden sabit bir kaynağı gerektirir. Bu denge kan, tüm doku ve organları boyunca vasküler kaynağı en küçük dalları kapsayan mikrosirkülasyon aracılığıyla hareketi ile elde edilir. Arterlerden arteriol şube parankimal hücreleri ile yakından ilişkili çok sayıda kılcal damarların akan oksijenli kan dağılımı ve büyüklüğü kontrol ağları oluşturur. Kılcal damarların doku hücreleri ve kan akımı arasındaki difüzyonal değişimi için büyük bir yüzey alanı sağlar. Venüllerde kılcal atık toplamak ve kalbe doğru deoxygenated kan dönüş olarak yakınsama. Görselleştirilmesi ve yaşam mikrosirkülasyon manipüle için gerçek zamanlı olarak bu süreçleri gözlemek için deneysel bir yaklaşım gerektirir. Sıçan Cremaster&#39;ın kas ilk histoloji ve elektron mikroskobu post mortem 1,2 kullanılarak inflamasyon çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır. Maruz sağlam sıçan Cremaster&#39;ın kas in vivo raporda ilk ışığı 3 yansıyan vazoaktif ilaçlar mikrovasküler tepkiler araştırdık. Ancak bu hazırlık odaklı aydınlatma eksikliği kas ve eğrilik yararlılığı sınırlı. Büyük bir atılım, kas açılış testis ayrılmakta ve bileşik mikroskop altında 4 transillüminasyon için düz bir levha olarak radyal yayılmasını gerektirmişti. Sıçanlarda 5 ve hamster 6 mikrosirkülasyon fizyolojisi incelemek için değerli bir hazırlık olduğu gösterilmiş olsa da, farelerde 7 Cremaster&#39;ın kas mikrovasküler fonksiyon 8-11 ve hücrelerarası gerçek zamanlı görüntüleme düzenleyen hücresel yollar diseksiyon özellikle yararlı olduğunu kanıtlamıştır 12 sinyalizasyon. Testisler inguinal kanal 13 üzerinden iner gibi Cremaster&#39;ın kas iç oblik ve transvers abdominus kas türetilmiştir. Ve testislerin sıcaklığını korumak: destek (Cremaster&#39;ın = askı Yunanca) hizmet vermektedir. Burada açıklandığı gibi, Cremaster&#39;ın kas üstün optik çözünürlük için ince düz bir levha olarak hazırlanmıştır. Fare istikrarlı bir vücut ısısı ve anestezi düzlemde devam cerrahi hazırlık, çevredeki doku ve testislerin fizyolojik tuz çözeltisi ile sürekli sulama ise kas kurtararak, silastik kauçuk şeffaf kaide üzerine yayılan ve böcek iğneli kenarları güvence . İşbu Protokol arterioler endotel hücreleri GCaMP2 transgenik farelerin ifade kullanır. GCaMP2 genetik olarak kodlanmış bir floresan kalsiyum göstergesi molekülü 12 . Widefield görüntüleme ve yoğun bir şarj çiftli aygıt kamera arterioler endotel kalsiyum sinyal in vivo çalışmada sağlar.

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster&#39;ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Vücut genelinde homeostazın sürdürülmesi, metabolik atıkların uzaklaştırılmasıyla eş zamanlı olarak sürekli oksijen ve besin sağlanmasını gerektirir...

Bu prosedürün genel amacı, anestezi uygulanmış erkek bir farenin canlı mikrosirkülasyonunu incelemek için kremaster kasını hazırlamaktır. Bu cerrahi işlem, skrotumun ventral yüzeyine yapılan bir insizyon ile başlar. Tıraşlama işleminin ardından bir sonraki adım, kremaster kasını temizlemek ve çevre dokulardan ayırmaktır.Ardından orşiektomi gerçekleştirilir ve doku, şeffaf bir kaide yüzeyine radyal olarak yayılır. Bu preparat, kremaster kası içindeki mikrosirkülasyonu görüntülemek için mikroskopi ile incelenebilir. Nihayetinde; kan akışının ve oksijen iletiminin sağlıklı sistemlerde, hastalık modellerinde ve deneysel manipülasyonlara yanıt olarak canlı sistemlerde gerçekte nasıl kontrol edildiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, mikrosirkülasyona ağırlık veren kardiyovasküler tıbbi araştırmalardaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Özellikle, kan akışının ve oksijen iletiminin sağlam sistemdeki hücresel düzeyde nasıl düzenlenebileceği üzerine odaklanılır. Bu yöntem, fare mikrosirkülasyonunun in vivo fonksiyonuna dair içgörü sağlayabilir.Bu yöntem ayrıca hamster ve sıçan gibi diğer kemirgen modellerine de uygulanabilir. Fareyi mikroskop altında sabitlemek için bazı yeni ekipmanların hazırlanması gerekecektir. İlk olarak, mikroskop tablasına uygun, şeffaf dikdörtgen bir pleksiglas levha hazırlayarak başlayın.Ardından, bir Petri kabına dökülmüş cigar 180 4'ten şeffaf bir kaide oluşturun. 15 milimetreye uyarlamak için, dökülen sil guard'ı bir vakum odasında bir saat boyunca degaze edin. Hava kabarcıklarını gidermek ve berraklığı artırmak için, degaze edilmiş sill guard'ı 50 °C'lik bir fırında yaklaşık dört saat boyunca kürleyin.Sertleşme tamamlandıktan sonra, kaideyi üst kısmı yuvarlatılmış bir beşgen şeklinde kesin. Ardından kaide bloğunu, ince bir tabaka şeffaf su geçirmez silikon yapıştırıcı ile dikdörtgen pleksiglas levhaya sabitleyin ve silikonun gece boyunca sertleşmesine izin verin. Sonrasında, fareyi kaideye karşı konumlandırmak için kama şeklinde bir platform oluşturun.Kama platformu akrilik plastikten yapılabilir ve preparatın sıcak tutulması için bir ısı lambası kullanılabilir. Alternatif olarak, plastik bir kamaya alüminyum monte edilebilir. Alüminyum, bir DC güç kaynağına bağlı dirençli ısıtma elemanları kullanılarak ısıtılır.Son olarak, deney gününde ultra saf su içerisinde karbonat tamponlu PSS hazırlanır. Tuzların deney gününde karıştırılmasıyla bikarbonatların çökelmesi önlenir. PSS'yi 37 °C'deki bir su banyosunda tutun ve bir gaz dağıtıcı kullanarak PSS'yi 15 dakika boyunca azot gazı içindeki %5 karbondioksit gazı ile dengeleyin.Bu işlem pH'ı yaklaşık 7.4'e ayarlar ve tuz çökelmesini daha da önler. Yetişkin bir fareyi anesteziye aldıktan sonra; alt karın, alt sırt, skrotum ve bacaklardaki tüyleri dikkatlice tıraş edin. Alttaki kremaster kasına zarar vermemek için skrotum ve testislerin çevresinde ekstra dikkatli olun.Gevşek tüyleri taze bir alkollü pamukla temizleyin. Mesanenin dolu olup olmadığını kontrol edin. Eğer doluysa, karın duvarı üzerinden küçük bir üzüm tanesi gibi hissedilecektir; bu durumda mesaneyi boşaltın.İdrarı toplamak için penis yanına bir kim wipe ucu tutarak hafifçe bastırın. Şimdi, fareyi bacakları koruyucu kaideyi çevreleyecek şekilde kama platformu üzerine sırt üstü yatırın ve ardından fareyi kasık bölgesi kaideye gelecek şekilde sabitleyin. Pozisyonu korumak için göğüs bölgesine gevşek bir bant parçası yapıştırın ve bunu platforma sabitleyin.Skrotal kesenin apeksinden pedestale doğru bir pin sabitleyerek skrotal deriye gerginlik vererek cerrahiye başlayın. Şimdi, diseksiyon boyunca cerrahi alan üzerinden PSS süperfüzyonunu başlatın ve sürdürün. Çıkan PSS'yi uzaklaştırmak için, bir ucu skrotal kesenin yanında, diğer ucu ise vakum hattının yanında olacak şekilde bir Kim wipe yerleştirin.Testis, kremaster kası tarafından karın boşluğuna çekilmişse, deriyi açılı pensle tutarken mikrodiseksiyon makası kullanarak skrotal torbanın ventral yüzeyi boyunca dikey bir insizyon yapın. Alt karın bölgesine hafifçe basınç uygulamak, testisi torbaya doğru yönlendirir. Şimdi, testisin üzerinde bulunan kremaster kasının yüzeyini belirleyin ve kas ile skrotal deri arasındaki bağ dokusunu dikkatlice temizleyin.Kremaster kasını açığa çıkarmak için, skrotal deriyi pedalın proksimal kenarının arkasına doğru nazikçe retraksiyonla geri çekin ve her iki yandan sabitleyin. Ardından bir iğne yardımıyla, kasın dış yüzeyindeki bağ dokusunu temizleyin. Gerginlik sağlamak için kremaster kasının apeksinden bir iğne yerleştirin ve ventral yüzeyi boyunca çok dikkatli bir şekilde longitudinal insizyon yapın; bu sırada vasküler beslenmenin bozulmasını en aza indirmeye çalışın.Krem master kası, ince bir ligament ile EPI'lere bağlanır. Testisin alt kısmında, testisi bir kenara doğru yansıtın. EPI'lerden dikkatlice ayrılan bu ligamenti açığa çıkarın.Kremaster kasının apeksine yakın bölgede, epididime bağlanan küçük, çift bir arter ve ven bulunur. Kanamayı en aza indirmek için bu damarları pensle sıkıştırın ve birbirinden ayırın. Şimdi, proksimaldeki inguinal yağ pedi dahil olmak üzere bir orşiektomi gerçekleştirin; testisi, epididimi, testiküler arteri ve veni ligatörleyin.Ardından bunları kesin ve atın. Kremaster kasındaki kalan bağ dokusunu temizleyin ve ardından kası kaidenin yüzeyine radyal olarak yayın. Mikro sirkülasyonu bozulmamış, düz bir çizgili kas tabakası oluşturmak için kenarları beş ila altı raptiye ile sabitleyin.Tamamlanan preparatı, sürekli olarak 34 °C'de sabitlenmiş bir intravital mikroskobun tablasına aktarın ve deneysel manipülasyon veya veri toplama işleminden önce 30 dakika boyunca dengeye gelmesini bekleyin. Parlak alan aydınlatmalı ve epi-aydınlatmalı özelleştirilmiş bir mikroskop kullanılarak, cremaster preparatının dijital görüntüleri parlak alan aydınlatması altında elde edildi. Kas, floresan altında 42x, 83x ve 165x büyütmelerde görselleştirildi. Kas, gelişimi tamamlandıktan sonra 42x, 83x, 165x ve 330x büyütmelerde görselleştirildi.Bu teknik, mikrosirkülasyon alanındaki araştırmacıların doku regülasyonu, kan akışı, oksijen iletimi ve inflamasyonun altında yatan mekanizmaları incelemesinin önünü açmıştır. Bu prosedür uygulanırken, mikrovasküler reaktivitenin bozulmadığından emin olmak için dokunun hassas bir şekilde işlenmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikrodolaşımında gözlem için yeni bir çok yönlü bir yöntem sunulmuştur. Bu uzun vadeli bir gözlem için uygun olduğu düşünülen ve pharmacophysiological veya moleküler biyolojik müdahaleler ile birlikte.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Microiontophoresis mikropipet içi ve dışı arasındaki elektriksel potansiyel bir fark yanıt mikropipet iyonların hareketi gerektirir. Biyolojik aktif molekülleri böylece elektrik akımı ile orantılı olarak teslim edilir. Biz mikrosirkülasyon endotel bağımlı vazodilatasyon çalışma mikromanipülasyon ile birlikte asetilkolin microiontophoresis göstermektedir.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Kremasterik mikrosirkülasyonda postkapiller venüllerde Dijital intravital Epifloresans mikroskopi lökosit-endotel etkileşimi içgörü kazanmak için uygun bir...

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Bu çalışma, in vivo hücresiz tabakanın görselleştirilmesi için sıçan kremaster kasının cerrahi hazırlığını göstermektedir. Bu çalışmada, hücresiz katman genişliği ölçümünün doğruluğunu etkileyen önemli faktörler tartışılmıştır.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Öğrenin fare kremaster kası hazırlama yöntemiyle mikrosirkülasyonun canlı görüntülenmesini. Bu teknik, kardiyovasküler araştırmalarda kan akışı ve oksijen taşınımını hücresel düzeyde incelemek için kullanılır.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster'ın kas Hazırlık

Daha fazla video keşfet