Name: Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, mikrobiyal paspaslardan yüksek moleküler ağırlıklı DNA çıkarma yöntemini. Hücreleri matristen ayırarak DNA kalitesini ve konsantrasyonunu artırın. Bu protokol, fonksiyonel metagenomik çalışmalar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Çevre Genomik Programı (Hibe No EF-0.723.707) tarafından finanse edildi.

1. Mikrobiyal Hücre Ekstraksiyon: <ol><li> Mikrobiyal paspaslar steril bir taşlama havaneli ile iyice karıştırılarak homojenize. Yaklaşık 1 dakika süreyle homojenize mat malzeme steril kap içine Waring blender bütün 30 g (ıslak ağırlık), yaklaşık 100 mL 1 M NaCl (ya da örnek kullanım için belirli bir konsantrasyon) eklemek, üç kez ve orta hızda karışımı yerleştirin. 1 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda aralıklı soğutma. Bulamaç 250 ml santrifüj şişeye aktarın ve kalan boş hacim 1 M NaCl ile doldurun. Otoklava DI su NaCl çözeltisi hazırlayın ve sterilize filtre. </li><li> Ayrıca 30 dakika oda sıcaklığında bir vortexer (Vortex-Genie R 2) (150 rpm) sallayarak matris mikrobiyal hücrelerin yerinden. </li><li> 15 dakika 4 ° C düşük hızlı (500x g) Santrifüj Tortu minimum rahatsızlık ile hafifçe bir balona süpernatantı aktarın. </li><li> Pelet tortu kullanarak 1.2 ve 1.3, 1.3 adım sonunda her tortu pelet taze NaCl ilavesi ile dört kez karıştırma ve adımları tekrarlayın. Her NaCl çıkartılmasından süpernatant taze bir balona transfer edilir. </li><li> 15 dakika yüksek hızda (25.000 xg) 200 ml hacimde 5 hücre ekstraksiyon ve santrifüj süpernatantlar birleştirin 4 ° C Süpernatantı atın, 10 ml% 2 sodyum hexametaphosphate her hücre pelletini tekrar süspansiyon, pelet birleştirmek ve% 2 sodyum hexametaphosphate ile 200 mL birimi oluşturacak. 30 dakika oda sıcaklığında (150 rpm) sallayarak hücreleri yıkayın. Bu adımın sonunda bir sonraki adıma geçmek için hücrelerin sadece bir tüp olmalıdır. </li><li> 15 dakika 4 ° C yüksek hızda (25.000 xg) Santrifüj TE (50 mM EDTA), 200 ml supernatant, tekrar süspansiyon hücre pelletini atın ve 10 dakika oda sıcaklığında (150 rpm) sallayarak hücreleri yıkayın. </li><li> 4 az 15 dakika yüksek hızda (25.000 xg) Santrifüj ° C, 15 ml TE (10 mM EDTA) tekrar süspansiyon süpernatant, atmak ve mağaza 200 mcL alikotları -80 ° C kadar DNA ekstraksiyon için gerekli. </li></ol> 2. DNA Ayırma ve Saflaştırma: <ol><li> 200 mcL 5 M NaCl, 200 mcL% 10 SDS ve 200 mcL mikrobiyal hücre kısım 100 mcL 14.3 M β-mercaptoethanol ekleyin. Tersini 4-6 kez hafifçe karıştırın. </li><li> , 2 dakika, 5 dakika boyunca 65 ° C su banyosu içinde çözülme takip sıvı nitrojen içinde daldırarak donma-çözülme 3 tur Konu karışımı. Son 10 dakika çözülme uzatın. </li><li> 200 mcL 5 M potasyum asetat (pH 5.5) ve 10 dakika süreyle buz yer ekleyin. Santrifüj 10,000 xg'de 10 dakika 4 ° C ve geniş çaplı bir pipet kullanarak yeni bir tüp süpernatantı aktarın. 1hr RNaz 37 A ve inkübe ° C 3 mcL ekleyin. </li><li> Eşit miktarda kloroform, inversiyon kısaca sallamak ve oda sıcaklığında 10 dakika 15.000 xg'de santrifüj. </li><li> Süpernatant üst tabakası, geniş çaplı bir pipet kullanarak yeni bir tüp içine dikkatlice aktarın. Üst ve alt katmanları arasında yer alan beyaz arabirim katmanı pipetleme kaçının. Kloroform-çıkarma prosedürünü tekrarlayın. </li><li> Soğutulmuş, eşit hacimde (-20 ° C) çökelti DNA 30 dakika buz üzerinde inkübe supernatant ve izopropanol. </li><li> 4 az 10 dakika süreyle maksimum hızı (20,800 xg) Santrifüj ° C pelet DNA. </li><li> 1 ml soğuk (-20 ° C)% 70 etanol ile süpernatant ve yıkama DNA pelet atın. </li><li> Maksimum hız (20,800 xg) 10 dakika 4 ° C santrifüjleyin, süpernatantı atmak, 10 dakika süreyle% 70 etanol yıkama ve kuru hava DNA pelet tekrarlayın. % 70 etanol yıkama tekrarlayın. </li><li> 25 mcL TE (10 mM EDTA) yeniden süspanse DNA, 65 yaşında sıcak ° C 5 dakika boyunca birden fazla tüpler varsa bir tüp içine birleştirmek ve TE 500 mcL hacim makyaj. </li><li> Ekle 500 mcL buz (veya 4 ° C)% 20 polietilen glikol (PEG) (1.2 M NaCl hazırlanan). Pelet DNA 4, 10 dakika süreyle maksimum hızda 10 dakika ve santrifüj buz üzerinde inkübe inversiyon ° C ile hafifçe karıştırın. Süpernatantı çıkartın ve atın ve 1 ml soğutulmuş% 70 etanol, 10 dakika süreyle kurumaya ile pelet DNA yıkayın ve 30-50 mcL TE veya moleküler sınıf su tekrar süspansiyon haline getirin. 65 yaşında DNA tabanda ısınmanın kolaylaştırılması ° -80 ° C arasında 5 dakika ve Mağaza DNA </li></ol> 3. DNA Saflık, Konsantrasyon ve Boyut Belirlenmesi: <ol><li> A 260/280 ve 260/230 oranları Nanodrop 1000 spektrofotometre veya herhangi bir başka uygun enstrümantasyon kullanarak ölçerek DNA kalitesini belirlemek . </li><li> Üreticinin talimatlarına göre Quant-iT dsDNA Assay kiti kullanılarak DNA konsantrasyonu belirleyin. </li><li> Darbe alan jel elektroforezi kullanılarak DNA boyutunu belirlemek. 0.5x TBE% 1 agaroz jel hazırlayın ve aşağıdaki parametreleri CHEF Mapper XA Sistemi kullanmak; ilk geçiş süresi 0.35 saniye, 7.67 s son bir geçiş süresi ve 120 ° 6.0 V / cm bir degrade açısı doğrusal rfaktör amping. 30 dakika için 1 x SYBR Green I ile jel Leke. 700-1000 ng toplam DNA jel arasındaki yükleyin. Bkz: Şekil. 3 tam protokol yoğunlaştırılmış bir form için. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Hücre çıkarma: Sıralı mikrobiyal hücre özleri (süpernatantlar) özler bulanıklık ekstraksiyon sayısı artış olarak azaldığını göstermiştir. Bu, birbirini izleyen her hücre çıkarma, hücre sayısında bir azalma göstermektedir. Burada dikkat edilmesi gereken önemli noktalar her ek hücre çıkarma adım kirletici tanıtımı için fırsat sağlar, hücre ekstraksiyon sayısı son hücre pelletini genel mikrobiyal topluluğun temsilcisi böylece minimize olması gerektiğini. Diğer kirlenme kaynakları yeterli steril laboratuar teknikleri benimseyerek kontrol altına alındı. Örneğin, çözümler otoklavlanmış DI su hazırlanır ve steril filtre. Konteynerler, alkol ile sterilize otoklava ve UV ışığı ve ultraviyole çapraz bağlayıcı altında tedavi edildi. DNA konsantrasyonu ve kalite belirlenmesi: 1,6 A 260/280 oranı ile protokol mat örnek gram başına yaklaşık 2 mikrogram HMW DNA (35-50 kb) (Şekil 4) vermiştir ve 0,7 A 260/230 oranı (Tablo 1). A 260/230 oranının düşük olması, 16S rRNA genleri ayrı bir çalışmada 7 gözlendi PCR amplifikasyon olarak mansap moleküler tabanlı uygulama inhibisyonu gibi görünse de. EPS ve tuzları; hypersaline paspaslar DNA'nın iki ana kaynakları kirlenme dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle bu kirleticilerin izlerini aşağı akışı uygulamaları üzerindeki etkilerini azaltmak için büyük çabalara rağmen A 260/230 oranları etkileyen olabilir. DNA büyüklükleri belirlenmesi: Darbe alan jel elektroforezi Şekil 3'te gösterildiği gibi bir DNA smear sonucu aralıklı yönlü anahtarları ile zonklayan akım kullanır. Protokolü, yaklaşık 35-50 kb HMW DNA vermiştir. Bazı DNA boyutu 30 kb daha küçük olsa da, fosmid klonlama ~ 40 kb DNA ekler gerektirir ve daha büyük DNA parçalarının sağlam biyosentetik yollar için daha fazla erişim sağlayan 35 kb Yukarıdaki smear parçası olması önemlidir. Çalışmalarda, 35 kb Yukarıdaki DNA smear eksize edildi ve büyük takın vektör klonlama ve diğer moleküler uygulamalar için saflaştırılmış. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Eleuthera, Bahamalar üzerinde bulunan Hypersaline mikrobiyal mat örnekleme sitesi (Big Pond). <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2'de bu çalışmada kullanılan hypersaline mikrobiyal mat bir kesit. Mikrobiyal mat Eleuthera, Bahamalar üzerinde bulunan bir hypersaline gölet elde edildi. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 şematik mikrobiyal hücre çıkarma, hücre parçalama, ekstraksiyon, metagenomic DNA saflaştırılması ve ilgili prosedürlerin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 darbe alan jel elektroforezi kullanarak çıkarılan DNA Molekül ağırlığı karakterizasyonu. Lane M HMW işaretleyici, 1 ve 2 şeritli Eleuthera hypersaline paspas yukarıdaki protokolü kullanılarak çıkarılan metagenomic DNA çoğaltır. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekstraksiyon Metodu </td><td></td><td> Konsantrasyon ng / g </td><td> A 260/280 </td><td> A 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Tecrübe 1 </td><td> 1806,1 </td><td> 1,64 </td><td> 0,76 </td></tr><tr><td></td><td> Tecrübe 2 </td><td> 2010,8 </td><td> 1,61 </td><td> 0,75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. DNA konsantrasyonu ve kalite ölçümü mikrobiyal hypersaline mat ayıklanır.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Karmaşık ve oldukça çeşitli mikrobiyal mat örneklerinden tüm hücrelerin uzaklaştırılmasının pratik olmadığı göz önüne alındığında, temel endişe, ekstrakte edilen hücrelerin genel mikrobiyal mat topluluğunu ne ölçüde temsil ettiğidir. Önceki bir çalışmada, mikrobiyal 16S rRNA genlerinin PCR-DGGE analizi, bu protokolde kullanılan beş hücre uzaklaştırma adımının, genel mikrobiyal mat topluluğunu temsil eden hücreleri ekstrakte ettiğini göstermiştir7. Genel mikrobiyal topluluğu temsil eden bir hücre peleti sağlama...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilen glikol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 1.2 M NaCl içinde% 20 </td></tr><tr><td> Potasyum asetat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT dsDNA Assay kiti </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> BDH Kimyasallar </td><td> BDH8014 </td><td> Uygun kons. </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil Sülfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> % 10 su </td></tr><tr><td> sodyum hexametaphosphate </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> SX0583-3 </td><td> Su içinde% 2 </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA Sistemi </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spektrofotometre </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Bilimsel Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraviyole Çapraz </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring blender </td><td> Waring laboratuvar </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal paspas yüksek moleküler ağırlıklı dna çıkarımı

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Metagenomic veri Başarılı ve doğru analiz ve yorumlama, yüksek kaliteli, yüksek molekül ağırlığı (HMW) topluluk DNA verimli çıkarma bağımlı. Ancak, çevre mat örnekleri, genellikle yüksek kalite, HMW DNA yüksek konsantrasyonlarda elde etmek için zorluklar teşkil. Hypersaline mikrobiyal paspaslar, yüksek miktarda ekstraselüler polimerik maddelerin (EPS) 1. ve çıkarılan DNA alt uygulamalar inhibe edebilir tuzları içerir. Doğrudan ve sert yöntemleri genellikle refrakter örneklerinden DNA ekstraksiyonu kullanılır. Bu yöntemler, paspaslar, yapışkan bir matris, EPS direkt lizis sırasında DNA 2,3 bağlar, çünkü genellikle kullanılır . Sert ekstraksiyon yöntemlerinin bir sonucu olarak, küçük boyutları 4,5,6 parçalanmış DNA olur. DNA, bu nedenle büyük eklemek vektör klonlama için uygun olur. Bu sınırlamaları aşmak için, biz hypersaline mikrobiyal paspaslar iyi kalite ve kantite HMW DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir yöntem rapor. Biz karıştırma ve diferansiyel santrifüj yoluyla arka plan mat matris mikrobiyal hücrelerin ayrılması içeren dolaylı bir yöntem kullandı. Ayıklanan mikrobiyal hücrelerin DNA özü ve arındırmak için mekanik ve kimyasal işlemler bir arada kullanıldı. Bizim protokol 1,6 A 260/280 oranı, HMW DNA (35-50 kb) mat örnek gram başına yaklaşık 2 mikrogram verir. Ayrıca, 16S rRNA genleri 7 amplifikasyonu protokol bulaşanların herhangi bir inhibitör etkilerini en aza indirmek veya ortadan kaldırmak mümkün olduğunu göstermektedir . Bizim sonuçlarımız Fonksiyonel metagenomic çalışmalar için mikrobiyal paspaslar HMW DNA ekstraksiyonu için uygun bir yöntem sağlar ve diğer çevre örnekleri DNA ekstraksiyonu zorlu olduğu için geçerli olabilir.

Biz hypersaline mikrobiyal paspaslar yüksek molekül ağırlıklı DNA ayıklamak için geliştirilmiş bir protokol sağlar. Mikrobiyal hücrelerin DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma mat matris önce ayrılır. Bu konsantrasyonları, kalite ve DNA boyutunu artırır. Bu protokol, diğer refrakter numuneler için kullanılabilir.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Metagenomik verilerin başarılı ve doğru analizi ve yorumlanması, yüksek kaliteli, yüksek moleküler ağırlıklı ... verisinin verimli bir şekilde ekstraksiyonuna bağlıdır.

Bu prosedürün genel amacı, hiper salin mikrobiyal matlardan yüksek moleküler ağırlıklı DNA izole etmektir. Bu işlem, öncelikle mikrobiyal matın homojenize edilmesi ve mikrobiyal hücrelerin ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, mikrobiyal hücreler dondur-çöz ve kimyasal yöntemler kullanılarak lizize edilir.Sıradaki aşama, organik ekstraksiyonlar ve RNA'lar kullanılarak hücre kalıntılarının ve RNA'nın uzaklaştırılması, ardından DNA ekstraksiyonunun gerçekleştirilmesidir. Prosedürün son adımı ise DNA çöktürme ve saflaştırmadır. Nihayetinde, yüksek moleküler ağırlık kalitesinde ve konsantrasyonda DNA gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, doğrudan ve sert DNA ekstraksiyon yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fonksiyonel metagenomik çalışmalar için karmaşık bir çevresel örnekten yüksek moleküler ağırlıklı DNA kullanmasıdır. Bu çalışmada kullanılan mikrobiyal mat, Bahamalar'ın Eleuthera bölgesinde bulunan hiper salin bir göletten elde edilmiştir; arka plan mat matrisinden mikrobiyal hücreleri ekstrakte etmek için önce yaklaşık 30 gram mat, steril bir ezme piliyle öğütmeden iyice karıştırılır. Karışımda hiçbir topak görülmediğinde mat tamamen homojenleşmiş olur.Ardından, homojenize edilmiş mat malzemeyi bir blendera yerleştirin ve yaklaşık 100 mililitre sodyum klorür ekleyin. Orta hızda bir dakika boyunca karıştırın, ardından eksi 20 derece Celsius'ta bir dakika boyunca soğutun. Bu karıştırma ve soğutma işlemini iki kez daha tekrarlayın; karıştırma tamamlandığında, bulamacı 250 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın ve kalan boş hacmi bir molar sodyum klorür ile doldurun.Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayın, ardından süspansiyonu dört derece santigrat sıcaklıkta 15 dakika boyunca düşük hızda santrifüjleyin. Sonrasında, çökeleğinle minimum düzeyde etkileşime girerek süpernatantı nazikçe bir erlene aktarın. Peletlenmiş çökeleğe taze sodyum klorür ekleyin.Tekrar karıştırın ve 30 dakika boyunca çalkalayın. Ardından daha önce yaptığınız gibi santrifüjleyin ve süpernatantı yeni bir erlene aktarın. Taze sodyum klorür ekleme, karıştırma, santrifüjleme ve süpernatantın uzaklaştırılması işlemlerini üç kez daha tekrarlayın.Beş hücre ekstraksiyonundan elde edilen süpernatantları birleştirin ve 200 mililitrelik alikotları dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve her bir hücre peletini 10 mililitre sodyum heksametafosfatta yeniden süspande edin. Dört tüpteki hücre süspansiyonlarını birleştirin ve toplam hacmi 200 mililitreye tamamlamak için sodyum heksametafosfat ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalayarak yıkayın. Çalkalama işleminden sonra hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 200 mililitre te içerisinde yeniden süspande ederek hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika daha çalkalayarak tekrar yıkayın. Son olarak, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca tekrar yüksek hızda santrifüjleyin.Snat Resus çöktürülerek atıldıktan sonra, hücre peletini 15 mililitre içerisinde süspanse edin ve mikrobiyal hücrelerden 200 mikrolitrelik alikotlar hazırlayın. Mikrobiyal hücreler, DNA ekstraksiyonları için ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 derece Celsius'ta saklanabilir. Mikrobiyal hücrelerden DNA ekstraksiyonu ve saflaştırma prosedürüne başlamak için, her bir 200 mikrolitrelik mikrobiyal hücre örneğine sodyum klorür, SDS ve beamr capto etanol ekleyin.Toplam sekiz tüpe aliquotlar hazırlayın. Dört ila altı kez altüst ederek nazikçe karıştırın, karışımı iki dakika boyunca sıvı azot içinde bekletin ve ardından beş dakika boyunca 65 °C'de çözdürün; sıvı azotta bekletme ve 65 °C'de çözdürme işlemini iki kez daha tekrarlayın.Son çözdürme işlemini 10 dakikaya uzatın. Üçüncü dondurma-çözdürme döngüsünden sonra, her tüpe 200 µL potasyum asetat ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından 4 °C'de 10.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. Üç µL RNAs A ekleyin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik inkübasyonun ardından, eşit hacimde kloroform ekleyin.Ters çevirerek kısa süreliğine çalkalayın ve 15, 000 Gs hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, üstteki süpernatan tabakasını yeni bir tüpe aktarın. Kloroform ekstraksiyon prosedürünü tekrarlayın.Süpernatantın üst tabakasını tekrar yeni bir tüpe aktarın. Süpernatanta eşit hacimde soğutulmuş isopropanol ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. DNA'yı çöktürmek için maksimum hızda santrifüjleyin, DNA pelletini oluşturun, süpernatantı dökün ve her bir DNA pelletini bir mililitre soğutulmuş %70 ethanol ile yıkayın.%70 etnol yıkamasını, maksimum hızda, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek tekrarlayın. Süpernatantı atın. %70 etnol yıkamasını tekrarlayın ve DNA peletini 10 dakika boyunca havada kurutun.Her bir DNA peletini yaklaşık 25 µL te içinde yeniden süspande edin. 65 °C'de beş dakika boyunca ısıtın, ardından hepsini tek bir tüpte birleştirin ve te ile hacmi 500 µL'ye tamamlayın. Ters çevirerek nazikçe karıştırılmış polietilen glikol ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.DNA'yı çöktürmek için santrifüjleyin. Ardından DNA'yı soğutulmuş %70 etanol ile yıkadıktan sonra süpernatantı uzaklaştırın ve atın; 10 dakika boyunca havada kurutun, 30 ila 50 µL TE veya moleküler sınıf su içerisinde yeniden süspande edin ve beş dakika boyunca 65 °C'de ısıtın.DNA'yı -80 °C'de saklayın. Bu tablo, mikrobiyal hipersalin matın ekstraktı olan DNA'nın konsantrasyon ve kalite ölçüm sonuçlarını göstermektedir. Protokol, 1,6'lık bir A260/A280 oranı ve 0,7'lik bir A260/A230 oranı ile mat örneğinin gramı başına yaklaşık iki mikrogram DNA sağlamıştır.A$_{260}$/A$_{230}$ oranı düşük görünse de, DNA boyutunun puls alan jel elektroforezi kullanılarak belirlendiği ayrı bir çalışmada, 16S ribozomal RNA genlerinin PCR amplifikasyonu gibi aşağı akıştaki moleküler tabanlı uygulamalarda herhangi bir inhibisyon gözlemlenmemiştir; sonuçlar yaklaşık 35 ile 50 kilobazlar arasında yüksek moleküler ağırlıklı veya HMW-DNA olduğunu göstermektedir. Burada, M şeridi bir HMW markörüdür ve bir ile iki numaralı şeritler, eleuthra hipersalin matından ekstrakte edilen metagenomik DNA'nın replikalarıdır. 35 kilobazın üzerindeki DNA yayması, büyük insert vektör klonlaması veya diğer uygun moleküler uygulamalar için kesilip saflaştırılabilir.Bu prosedürün ardından, incelenen mikrobiyal topluluğun fonksiyonel çeşitliliği nedir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla P-C-R-D-G-G-E klonlama veya DNA dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.

0.22 mcM Sterivex Filtreler ve Sezyum Klorür Yoğunluk Gradient Santrifüj DNA Ekstraksiyon

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Burada açıklanan, uzun okunan genom dizilemede kullanılmak üzere zorunlu biyotrofik mantar patojeni olan küllemeden genomik DNA'nın ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalite kontrolü için bir yöntemdir.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Hidrokarbon bozunan bakterileri sucul habitatlardan izole etme, çoğaltma ve karakterize etme sürecini sunuyoruz. Protokol, bakteri izolasyonunu, 16S rRNA yöntemiyle tanımlamayı ve hidrokarbon bozunma potansiyellerinin test edilmesini ana hatlarıyla belirtir. Bu makale, araştırmacıların çevresel örneklerde mikrobiyal biyoçeşitliliği karakterize etmelerine ve özellikle biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları taramalarına yardımcı olacaktır.

Sucul Habitatlardan Hidrokarbon Metabolize Edici Özelliğe Sahip Bakteri Türlerinin İzolasyonu, Çoğaltılması ve Tanımlanması

Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak diatom DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

Su Örneklerinden ve Dokulardan Diatom DNA'nın Ekstraksiyonu

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Mikrobiyal Toplulukları Biyoloji - Röportaj

Öğrenin, mikrobiyal paspaslardan yüksek moleküler ağırlıklı DNA çıkarma yöntemini. Hücreleri matristen ayırarak DNA kalitesini ve konsantrasyonunu artırın. Bu protokol, fonksiyonel metagenomik çalışmalar için uygundur.

Mikrobiyal Paspas Yüksek Moleküler Ağırlıklı DNA çıkarımı

Daha fazla video keşfet