Name: Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Öğrenin, hücre kültürlerinde hipoksi indüksiyonu ve HIF-1 alfa ekspresyonu değerlendirmesi yöntemlerini. Kobalt klorür ve hipoksi inkübatörü kullanarak oksijen eksikliği koşullarını güvenilir şekilde oluşturun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. CoCl 2 çözüm indüklediği hipoksi Kobalt (II) Klorür hekzahidrat ve (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237.9), hipoksi-indüklenebilir faktör-1.3 8 indükleyen kimyasal bir madde. Bu ürün, açık, kırmızı bir çözüm verimli, su (100 mg / ml) çözünür. <ol><li> 25mm bir stok solüsyonu steril gg su hazırlayın, (hemen önce kullanıma hazırlamak) </li><li> Hipoksi ikna etmek için normal bir hücre kültürü medya 100μM son konsantrasyonda CoCl 2 kullanın . </li><li> Hücrelere CoCl 2 içeren medya ekleyin ve kültürlerin geleneksel bir inkübatör 24 saat inkübe (37 ° C,% 5 C0 2). </li></ol> Yukarıdaki konsantrasyonu hücre hatları için test ettik ama her hücre hattı, ilaca bağlı toksisite sınırı ve tahlil optimize etmek amacıyla çeşitli inkübasyon sürelerinde yanı sıra çeşitli konsantrasyonlarda (doza bağımlı bir eğri kurmak için) test edilmelidir çalışır. 2. Modüler İnkübatör Odası indüklediği hipoksi <ol><li> En az iki özdeş (ikiz kültür) hücre kültürleri hazırlayın. Hücre kültürleri, şişeler, tabak ya da kültür yemekleri olabilir. Odanın açmak için, ilk oda (hipoksik gaz tasfiye enjeksiyon / için kullanılan tüpler) ve yavaşça, çelik halka kelepçe açık bağlı borular üzerinde bulunan iki beyaz plastik kelepçeleri açın. </li><li> Kelepçe bırakın. Kapak ve tepsiler artık kaldırılabilir. </li><li> Hipoksik odasında hücre kültürü yerleştirin. Ayrıca odasında kültürlerinin yeterli nemlendirme sağlamak için steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. </li><li> Normoxia "ikiz" hücre kültürü kontrolü yerleştirin. </li><li> Tepsiler güvenli ve hareket etmiyor ve sonra kapağı odasına yakın emin olun. Doğru odasının Hermetik kapanmasını sağlamak ve bunu kapatmak için çelik halka kelepçe yerleştirin. </li><li> Hipoksi oluşturmak için,% 1 O 2 gaz karışımı içeren bir "hipoksi tankı" tüp takın. Tankına bağlı bir debimetre varsa odasına doğrudan gaz tankı-debimetre odacıklı () bağlı olacaktır. Biz regülatör kurulmuş bir debimetre kullanın. </li><li> Bunu yapmak için 7-10 dakika dakika başına 20 litre akış hızında gaz tankı açarak odasına floş odasında ve medya tüm oksijen mevcut, eğer en kaldırmak için önemlidir; sonra hızlı bir şekilde kapatmak- gaz akışı ve odanın her iki beyaz kelepçeler kapatarak tamamen kapatın. </li><li> Zaman istenilen süre için geleneksel bir inkübatör odasına dönün. 2 saat sonra tekrar aynı hizada büyük kültürleri kullanıyorsanız, 1 için de gaz kültürlerde medya izin verir. Yukarıdaki adımları yapıcı öneriler '(Billups-Rothenberg, Inc.) Dayanmaktadır. Gaz tankeri, her zaman için güvenli olduğundan emin olun. </li></ol> Notlar: <ul><li> 1-3hours sonra yeniden gaz odasına kez tavsiye medya bulunan O 2 ortadan kaldırmak için. </li><li> 48hours daha uzun inkübasyon süresi için de yeniden gaz odasına tavsiye edilir. </li><li> O 2 hücre / odasında yer alan ölçümleri sağlayan oksijen sensörleri (elektrotlar / manometre), oda / hücre içi O 2 içerir) daha hassas ölçüm sağlayacaktır . </li><li> Bir zaman eğrisi yapmak için çeşitli süre kültür hücrelerinin belli hücreleri HIF-1α uygun zaman ifade belirlemenize yardımcı olacaktır. </li></ul> 3. Hipoksi Değerlendirilmesi <ol><li> Western blot HIF-1 α algılama. <ol><li> Yeniden açın odası olarak bölüm 2.2 'de açıklanan ve hemen buz üzerinde kültürler yerleştirin. </li><li> Plakalar% 5 SDS çözümü ile hipoksi arıtılmış ve arıtılmamış hücreler Lyse sonra, tüpler sonikasyon, yavaşlatmayı hücre artıkları hücre lyzate transferi ve süpernatantı toplamak. </li><li> Tedbir protein konsantrasyonu BCA kiti kullanılarak, 5 dakika boyunca 95 yükleme tamponu ve ısıtma ° C ekleyerek örnek hazırlayın. </li><li> % 8 SDS-poliakrilamid jel ve Selülozik membranlara transfer Electrophorese proteinler. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında veya çalkalayıcı üzerinde 4 ° C gecede% 5 yağsız kuru süt içeren PBS membran ve% 0.1 Tween 20 engelleyin. </li><li> 4 aynı tampon anti-HIF-1α birincil monoklonal antikor (1 / 600) bir gecede immüno ° C. </li><li> PBS PBS içinde HRP-ikincil antikor (1 / 2000) +% 0.1 Tween 20 45 dakika oda sıcaklığında, 5dakika her zaman ve inkübe% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın. </li><li> PBS, 5dakika / saat oda sıcaklığında% 0.1 Tween 20 içeren 3 kere yıkayın. </li><li> Protein bandı göstermek için Pierce ECL kiti ve X-ray film kullanın. </li></ol></li><li> Hipoksi Duyarlı Elemanlar (HRE). HIF-1α Hipoksi Düzenlenmesi Element (HRE) olarak adlandırılan bir dizi bağlanarak çok sayıda genler (yani VEGF, EPO) düzenler. HRE ilişkili bir marker gen I9 HIF aktivite tespit etmek mümkündür. Bu yöntemi kullanmak için, önce hücrelerin adapte transfeksiyon yöntemi kullanılarak HRE lusiferaz plazmid hücreleri transfect gerekir. Örneğin biz Lipofectamine 2000 kullanılır. Hücreler hipoksi ve normoxia inkübe önce, en az 4 saat transfekte olması gerekiyor. Bu sefer, bu ilk adım, hipoksi etkilenmez, böylece DNA'nın hücrelere girmek için izin verir. Lusiferaz sinyal Lusiferaz Assay Kit kullanılarak tespit edilmiştir. <ol><li> Hipoksi, modüler odasında HRE-transfekte hücreler inkübe veya CoCl 2 ile inkübe HRE transfekte hücreleri normoxia kontrolü içerir. </li><li> Istenilen bir kuluçka döneminden sonra, hücre büyümesi orta çıkarın. </li><li> PBS içinde hücreler durulayın, PBS çıkarın. </li><li> Kültür çanak içine 400μl 1X reaktifi Uygulama ve ekli hücreleri kazıyın, sonra onları bir mikro tüp transferi. </li><li> Kısa süreli santrifüj Pelet enkaz. </li><li> Mix 20μl hücre Lusiferaz Testi Reaktif 100μl supernatant lizatları ve lüminesans lüminometre kullanarak ölçmek. </li></ol></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: K562 hücrelerinin (insan lösemi hücre hattı) normoxia kıyasla düşük oksijen kültürlü 2 gün, hipoksi western blot (Şekil 1) tespit edildi HIF-1α protein bir artışa neden olur. HRE lucifeares, hipoksi kültür (embriyonik böbrek hücre hattı) 293 hücreler değiştirilen önemli bir HIF-1α aktivitesi artmış hipoksik hücreleri tespit edildi (Şekil 2). Kullanarak <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: hipoksik hücrelerin HIF-1α artırın. K562 hücrelerinin 48 saat için normoxia ve hipoksi (hipoksik odasına) kültür ve HIF-1α için özel bir antikor kullanarak western blot ile analiz. Aktin için bir antikor özel yükleme kontrolü için kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: HIF-1α aktivite. HRE lusiferaz 293 hücreleri hipoksi ve 48 saat için normoxia kültüre edildi değiştirilmiş ve daha sonra bir lusiferaz tahlil kiti ve luminometre kullanarak lusiferaz sinyali tespit etmek için parçalanmış. Sonuçlar göreli lüminesans birimi (RLU) olarak ifade edilir.

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hipoksik koşullarda hücre proliferasyonu ve canlılığı, hücre türlerine bağlı olarak çok değişir. Bu nedenle, hücre sayısı ile başlar, deneyler için yeterli hücre / proteinlerin olacaktır emin olmak için kültürler plakaların sayısı ayarlamanız gerekir. Kobalt klorür yöntemi, ucuz ve hızlı bir avantaja sahiptir. Bu ürün HIF-1/3α uyararak hipoksi taklit eder ama bu ürün bu &quot;taklit bağımsız özel hücrelerin fonksiyon ve fenotip başka ne gibi etkileri olabilir kontrol ederek projeye adapte olduğundan emin olun, diğer genlerin düzenlenmesi hipoksik &quot;etkisi. Ayrıca hipoksi taklit etmek için kullanılan başka bir ilaç deferoksamin mesilat (DFO, 100 mcM final konsantrasyonda kullanılır). Bu ilaçların kullanımı experimentator &quot;hipoksik durum&quot; etkilemeden kültür plaka / çanak / şişesi birçok kez açmak için izin verir. Gaz karışımı bulunan oksijen düzeyi hipoksi değerleri, doku ve hücre tipleri bağlı olarak değişir deneyler ve hücre tiplerini bağlı olarak değişebilir. Gerçekten de, bazı hücreler O 2 ihtiyacı% 1&#39;den daha az O 2 hipoksik% 5 hipoksik. Kültürlerin pH stabilize etmek için% 5 CO 2 gaz karışımı eklenir, gaz geri kalanı genellikle Azot. Hipoksik odaları oksijen gerilimi bağımsız hücre davranış alternatif ilaçlar kullanarak avantajı var. Ancak, her açılışında oksijen odasına tekrar girer ve böylece hipoksi azaltır olarak her türlü deney yapılabilir. Deneylerde bu faktör göz önünde bulundurmalıdır; hipoksi / yeniden-oksijenasyon, bazı hücre tiplerinin etkileyebilir belirli bir durumdur. Alternatif bir hipoksi iş istasyonları (ön karışık gaz tankları veya gaz karışım sistemlerine bağlı) veya deney ortamı değiştirmek ve sürekli hipoksik ortamda hücreleri manipüle etmek için izin büyük hipoksi inkübatör (torpido gözü ile hipoksi işlem odası) kullanmaktır. Çeşitli hipoksik odaları son on yıl içinde satışa sunulmuştur ve sizin laboratuar, proje, uzay, boyut, ve bütçe göre seçilmelidir. Her zaman doğru kültür koşulları garanti altına almak için odasının iyi kullanmak ve durumu sağlamak. Genel olarak bir oda kullanırken, hipoksi düzeyi çeşitli gaz karışımları (yani% 1,% 5,% 10 oksijen) seçerek modüle edilebilir. HIF-1α tespiti ile ilgili olarak, bilmek önemlidir ki, bazı kanser hücre hattı normoxia olarak ifade HIF-1α. Bu nedenle, bu hücre hatları HIF bazal düzeyini belirlemek için bir normoxia kontrol kullanmak için kritik öneme sahiptir. HIF-1α hücre stimülasyon veya stres sonrası non-malign hücrelerin normoxia de mevcut olabilir. Bu aynı zamanda, bu hücreleri aç meydana hücre kültürleri doğru beslenmek ve korunur emin olun.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> Kobalt (II) Klorür </td><td> Sigma </td><td> C8661-25G </td></tr><tr><td> İnkübatör Odası </td><td> Billups-Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-Lusiferaz plazmid </td><td> Adgene </td><td> 26731 Plazmid </td></tr></tbody></table>

hücre kültürü ve hipoksi test İndüksiyon

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hipoksi, organ, doku veya hücrelerin oksijen azalması veya yokluğu olarak tanımlanır. Bu azalma, oksijen gerginlik azalmış oksijen kaynağı (yetersiz kan damarı ağı, arızalı kan damarı ve anemiye neden olur) ya da tedarik göre (ani bir yüksek hücre proliferasyon oranı neden) oksijen tüketiminin artmasına bağlı olabilir . Hipoksi, 1-3, romatoid artrit, ateroskleroz, vb katı kanserleri gibi fizyolojik veya patolojik olabilir ... Her doku ve hücrelerin bu yeni duruma uyum sağlamak için farklı bir yeteneği var . Hipoksi sırasında, hipoksi indüklenebilir faktör alfa (HIF) stabilize ve oksijen 4 anjiyogenez veya nakliye dahil olanlar gibi çeşitli genler düzenler. Bu nedenle, bu proteinin istikrar HIF rutin hipoksi 5-7 için ekran için kullanılır tespit, hipoksi bir özelliğidir. Bu makalede, biz, bu hücrelerin hipoksik durumunu değerlendirmek için memeli hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için iki basit yöntem öneriyoruz.

Burada kültürlerin hipoksik durumunu değerlendirmek için, hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için basit yöntemler öneriyoruz.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hipoksi; organlarda, dokularda veya hücrelerde oksijenin azalması veya eksikliği olarak tanımlanır. Oksijen tansiyonundaki bu düşüş, ...'daki azalmış bir kaynağa bağlı olabilir.

Bu prosedürün genel amacı, hücre kültüründe hipoksi indüklemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin indüklenebilir hipoksi faktör 1'in kimyasal bir indükleyicisi varlığında kültüre edilmesiyle veya hücrelerin özel bir gaz karışımıyla doldurulmuş bir hipoksi inkübatörü veya haznesinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından hipoksi, protein hücre ekstraktlarındaki HIF 1 alfa ekspresyon düzeyi doğrulanarak veya HIF 1 alfa bağlanma dizilerini kodlayan bir ENC vektörü kullanılarak aktivitesi ölçülerek tespit edilir.Sonuç olarak, western blotting ve lüminesans deteksiyonu aracılığıyla HIF one alpha ekspresyon seviyelerinde ve aktivitesinde bir artış olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Benim adım Danny U. Patrizia Inda'nın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün, kobalt klorür ile hipoksi oluşturma prosedürünü göstereceğim.Steril çift distile su içerisinde 25 millimolar kobalt klorür stok çözeltisi hazırlayarak başlayın. Çözeltiyi hücrelere ekleyin ve 100.Micromolar nihai konsantrasyonda kültüre edin. Hipoksiyi indüklemek için hücreleri 37 degrees Celsius ve %5carbon dioxide koşullarında 24 saat inkübe edin.Modüler bir inkübatör haznesi kullanarak, en az iki özdeş hücre kültürü hazırlayın. Ancak, her koşul için üç tekrarlı çalışma yapılması önerilir. Modüler inkübatör haznesini, önce hazneye bağlı tüplerde bulunan iki beyaz plastik klempi açarak açın ve kapağı ile tepsileri çıkarın.Kültürlerin yeterli şekilde nemlendirilmesini sağlamak amacıyla, içinde steril su bulunan bir Petri kabı ile birlikte hücre kültürünü hipoksik kamaraya yerleştirin. Hipoksiyi indüklemek için kontrol grubu olarak ikinci hücre kültürünü Normoksia koşullarına yerleştirin. Boruları, %1 oksijen gaz karışımı içeren bir hipoksi tankına bağlayın.Eğer tankınıza bir debimetre bağlıysa, hazne doğrudan buna bağlanacaktır. Haznedeki ve ortamdaki tüm oksijeni uzaklaştırmak için regülatörümüze entegre edilmiş bir debimetre kullanıyoruz. Gaz tankını dakikada 20 litre debiyle dört ila yedi dakika boyunca açarak hazneyi yıkayın.Ardından gaz akışını hızlıca kapatın ve her iki beyaz klempi kapatarak hazneyi tamamen mühürleyin. Hazneyi istenen süre boyunca konvansiyonel bir inkübatöre geri yerleştirin.Büyük kültürler kullanılıyorsa, medyumun ve kültürlerin DGAs için bir ila iki saat beklemesine izin verin ve ardından hipoksiyi değerlendirmek için yıkama işlemini tekrarlayın. Western blot ile HIF one alpha tespiti kullanarak, daha önce gösterildiği gibi hazneyi açın ve kültürleri hemen buza yerleştirin. Hipoksiye maruz bırakılmış ve bırakılmamış hücreleri %5 SDS çözeltisi ile lise edin.Ardından lizatları tüplere aktarın ve proteinleri ekstrakte etmek için sonikasyon uygulayın, hücre kalıntılarını çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. Daha sonra, bir BCA kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. Ardından, yükleme tamponu ekleyip 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtarak bir jel örneği hazırlayın.Proteinleri %8'lik SDS poliakrilamid jel üzerinde ayırın ve nitrocellüloz bir membrana aktarın. Membranı, %5 yağsız kuru süt ve %0,1 tween 20 içeren PBS içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca veya bir çalkalayıcı üzerinde dört derece Celsius'ta gece boyunca bloklayın. Blot'u, aynı tampon içerisinde anti HIF one alpha primer monoklonal antikor ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün. Blot'u oda sıcaklığında, %0.1 tween 20 içeren PBS ile her biri beşer dakika olmak üzere üç kez yıkayın, ardından %0.1 tween 20 içeren PBS içindeki HRP ikincil antikoru ile 45 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, %0.1 tween 20 içeren PBS ile her biri beşer dakika olmak üzere üç kez yıkayın.Ardından membranı kemilüminesans tespit çözeltileri içinde inkübe edin ve lusiferaz aktivitesini ölçmek için x-ışını filmine maruz bırakın. Kültürlenmiş hücrelerdeki büyüme ortamını uzaklaştırın. Hücreleri PBS ile durulayın.Ardından, kültür kabına 400 µL bir katı (1x) lizis reaktifi ekleyin. Yapışık hücreleri kazıyarak bir mikrotüpe aktarın. Kalıntıları kısa süreli santrifüjle çöktürün.20 µL hücre lizatı süpernatantını yüz µL lusiferaz analiz reaktifi ile karıştırın ve lüminometre kullanarak lüminesansı ölçün. K 5 62 hücreleri normoksi veya hipoksi koşullarında 48 saat boyunca kültüre edilmiş ve H one alpha'ya özgü bir antikor kullanılarak western blot ile analiz edilmiştir. Yükleme kontrolü için beta actin'e özgü bir antikor kullanılmıştır.Sonuçlar, hipoksik hücrelerde HIF-1α seviyelerinde artış olduğunu göstermektedir. HRE Luciferase modifiye 293 hücreleri 48 saat boyunca hipoksi veya normoksi koşullarında kültüre edilmiş, ardından bir luciferase assay kiti ve lüminometre kullanılarak luciferase sinyali tespit edilmek üzere analiz edilmiştir. Hipoksik hücrelerde HIF-1α aktivitesinde de artış tespit edilmiştir.Sonuçlar bağıl lüminesans olarak ifade edilir. Hassas gazlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini; bu prosedürü gerçekleştirirken oksijen tüpünün duvara veya tezgaha düzgünce sabitlenmesi, oksijen tüpünün doğru şekilde açılıp kapatılması ve basıncın kontrol edilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Bu makale doğum sonrası gün 1-8 fare veya sıçan yavrular aralıklı hipoksi kısa süreli uygulanması için yöntem anlatılmaktadır. Bu yaklaşım etkili bir hipoksi maruz kalma 30 dakika içinde hasat edilir kültürlü nöral progenitör hücreler üzerindeki sağlam doku düzeyi "etkisi priming" ortaya çıkarır.

Teslimatı<em&gt; İn Vivo</em&gt; Akut Aralıklı hipoksi Yenidoğan Kemirgenler Başbakan subventricular bölgesi kökenli Sinir Progenitör Hücre Kültürleri için

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız.

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.

Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Uzamsal mesafe, ayrı endotel ve kardiyomiyosit hücre katmanlarının bir ko-kültür modelinde hipoksi / reoksijenasyon hasarının değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da ilk kez, kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Burada, yüksek metabolik proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenasyon hasarını modellemek için in vitro bir protokolü tanımlıyoruz. Bu model, proksimal tübul hasar belirteçlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum fonksiyonunun değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilen metabolik stres kaynaklı hasarı indüklemek için tasarlanmıştır.

Proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenlenme yaralanmasının modellenmesi

Öğrenin, hücre kültürlerinde hipoksi indüksiyonu ve HIF-1 alfa ekspresyonu değerlendirmesi yöntemlerini. Kobalt klorür ve hipoksi inkübatörü kullanarak oksijen eksikliği koşullarını güvenilir şekilde oluşturun.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Daha fazla video keşfet