Yayılma Depresyon Episodik ve Kronik Migren Sinir Bağışıklık Sinyalizasyonu Modelleme In Vitro

Bu videonun amacı, hipokampal dilim kültürlerinin, migren aurasının ve belki de migren baş ağrısının altında yatan en olası neden olan depresyonun yayılmasına yatkınlığı modüle eden nöral bağışıklık sinyalini deşifre etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Yayılan depresyon, hipokampal dilim kültürlerinde kolayca uyandırılır. Kültürler haftalarca in vitro olarak tutulduğundan, bireysel hücre tiplerinin davranışı uzun süreler boyunca ölçülebilir, taklit edilebilir ve modüle edilebilir.

Bu özellikle nöral immün sinyalleme çalışması için önemlidir. Olgun hipokampal beyin dilimleri hareketsiz bir bağışıklık durumuna ulaştığından, yayılan depresyonun bağışıklık tepkileri, modern moleküler biyolojik teknikler kullanılarak anestezinin potansiyel olarak karıştırıcı etkileri olmadan değerlendirilebilir. Bir dilimde en az 50 hücreden yaklaşık 90.000 hücreye kadar sinyal veren sitokinlerin hassas tespiti buna göre belirlenebilir.

Hipokampal beyin dilimi kültürleri, migreni hafifletmek için yeni nöral immün terapötiklerin geliştirilmesinde kullanım için idealdir. Benim adım Yian Berg ve bu Richard Craig'in laboratuvarından ve Chicago Üniversitesi Tıp Merkezi Nöroloji Bölümü'nden Aya Puss ve Heidi Mitchell. Bugün, sıçan hipokampusu, bitler, kültürler ve yayılan depresyonun düşük seviyeli bağışıklık sinyalizasyonunun çalışmasını göstereceğiz.

Depresyonun yayılması, artmış sinaptik aktivite patlaması ile tetiklenen ve daha sonra hızlı bir şekilde tüm aktivitenin geçici bir kaybıyla takip edilen paroksismal bir nöral olaydır. Artan kanıtlar, düşük seviyeli bağışıklık sinyalizasyonunun beyindeki sinaptik aktiviteyi etkileyebileceğini ve karşılığında etkilenebileceğini göstermektedir. Sitokinlerin depresyonun yayılmasına ve bunun sonucunda migren aurasına ve belki de migren baş ağrısına karşı duyarlılığı modüle ettiğini varsayıyoruz.

Burada tanımladığımız prosedürler, potansiyel olarak kafa karıştırıcı bağışıklık hücresi aktivasyonunu en aza indirmek ve düşük seviyeli bağışıklık sinyallerini tespit etme yeteneğimizi artırmak için tasarlanmıştır. Bu, en geniş nöral bağışıklık sinyali dizisini ve bunun yayılan depresyon ile etkileşimlerini tespit etmemizi sağlar. Bu işleme başlamak için, cam tüpleri 4,5 milimetre uzunlukta keserek toprak elektrotları yapın.

Ardından, kesilen bölümleri her iki uçta kısaca ateşle parlatın. Daha sonra, 100 mililitre bir molar potasyum klorürü kaynatın, üzerine 3.5 gram agar ve 0.5 gram EDTA ekleyin. Berrak sarı bir çözelti elde etmek için karışımı sürekli karıştırın.

Her cam tüpün üzerine bir parça kısa esnek boru yerleştirin. Daha sonra ılık potasyum klorür agri çözeltisini cam tüpe ve esnek boruya kısa bir mesafe çekin. Emmeyi serbest bırakın ve potasyum klorür agarın cam tüpün açık ucundan yavaşça damlamasına izin verin.

Agar damlarken, açık cam tüpün ucuyla bir parça buza dokunun, bu da agarın elektrot ucunda jelleşmesini ve cam tüp tüpüne geri çekildikten sonra jelleşmemesini sağlayacaktır. Agar jölelendikten sonra, agra'nın konumunu değiştirmeden esnek tüpü nazikçe çıkarın. Cam tüplerde, 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüp rafının her bir oyuğuna 0,5 mililitre bir molar potasyum klorür koyun.

Ardından, uçları nemli tutmak için her bir potasyum klorür afil cam tüpünün ucunu ayrı oyuklara yerleştirin. Ardından, bir hemostat ile 80 santimetre uzunluğunda 15 gauge gümüş bir tel tutun. Tezgahın üzerine tutulan bir zımpara tahtasından teli kazıyarak dört tarafın her birini temizleyin.

Bundan sonra, teli dört santimetre uzunluğunda kesin. Onları 20 ila 30 dakika boyunca çamaşır suyu ile doldurulmuş bir parıldama şişesine koyun. Temizlenmiş gümüş yüzeyin üzerine sağlam bir gümüş ila gümüş klorür kaplama yerleştirmek için, teli ikiye bükün ve yaklaşık dört ila altı milimetre açıkta bırakarak potasyum klorür agar ile doldurulmuş cam tüpe yerleştirin.

Daha sonra gümüş teli ve telin küçük bir kısmını içeren cam tüp ucunu, potasyum klorür agarın kurumasını önlemek için suya dayanıklı ve esnek bir yapıştırıcı olan goop ile kaplayın, tüm elektrotlar için tekrarlayın ve tutkalın gece boyunca kurumasını bekleyin. Çizimden sonra, elektrotları beş mililitre bir molar potasyum klorür ve 25 miligram EDTA ile sintilasyon şişelerinde saklayın. Dört santigrat derecede flakon başına yaklaşık beş ila altı elektrot.

Filamentli bo silikat cam tüpler ile kayıt elektrotları yapın. Daha sonra, yaklaşık 20 santimetre uzunluğunda Teflon kaplı platin meridyeni keserek uyarıcı bir elektrot yapın. Daha sonra uzunluğu ikiye bükün, gevşek uçları gevşek bir kare düğüme bağlayın ve düğümden telin uçlarına yaklaşık iki santimetre bırakın.

Telin diğer ucunu bir hemostat ile tutarken düğümü bir masanın üzerine yerleştirilmiş bir elektrikli kutu matkabının aynasına sabitleyin. Tel sıkıca bükülene kadar matkabı kısa bir süre açın ve kapatın. Platin meridyum bükümlü telleri kurşun tellere bağlamak için, önce platin meridyum bükümlü teli bir tezgah üstüne bantlayın ve bükülmüş telin bir serbest ucuna bir konsantre hidroklorik asit birikintisi bırakın.

Ardından, soyulmuş ucu bükülmüş tel ucuna bitişik bir kurşun tel üzerine yerleştirin ve ince uçlu bir havyadan ısı uygulayın, ardından iki tel sıkıca bağlanana kadar lehimleyin. Açıkta kalan kablo bağlantısının üzerine kısa bir uzunlukta ısıyla daralan makaron geçirin ve ısı ateşi ile büzülün. 15 santimetrelik bir pipetin ucunu parlatın ve bükülmüş platin meridyen telini pipetten aşağı doğru yönlendirin.

Elektrotun her iki ucunu da kapatmak için su itici bir epoksi kullanın. Son olarak, stereoskopik gözlem altında uyaran izolatörüne bağlantı için kurşun tel uçlarına muz tapaları takın. Elektrot ucunu PBS'ye yerleştirin ve bükülmüş tellerin kenarlarından herhangi bir kabarcık geliyorsa, elektrot uçlarının yalnızca kesik ucundan gelen elektrolitik üretilen kabarcıkları arayın.

Tellerin uzun eksenlerine sağlam bir yalıtım sağlamak için tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak elektrodu enine kesin. Anormal uyaran etkilerini çözmek için sorun giderirken, yeni kesilmiş bir elektrot ucu yapmaya çalışın. Bir diğer önemli adım, bir dilim kültür eki ve yaklaşık 1,0 santimetre aralıklı iki adet 1,0 x 12 milimetre cam çubuk üzerine oturan 35 milimetrelik bir kültür kabından oluşan kayıt kaplarını hazırlamaktır.

Cam çubuklar, cam tüplerin ısıtılması ve ardından forseps ile tabana bastırılmasıyla çanak tabanına tutturulur. Statik kayıt koşulları için, tabağa 1,5 mililitre ortam ekleyin. Bunu takiben, 10 milimetre genişliğinde ve üç ila dört santimetre uzunluğunda bir parça steril pamuğu ıslatın.

1.0 mililitre ortamda, pamuğu uzun eksen boyunca ikiye katlayın ve ek parçanın iç duvarı boyunca yerleştirin. Steril forseps ile ıslak pamuk, bulaşık neminin korunmasına yardımcı olur. Üç sıkıştırılabilir dört milimetre uzunluğundaki boru parçası, ek parçanın etrafına eşit aralıklarla yerleştirilmiştir.

Gaz değişimine izin vermek için çanağı polivinil klorür film ile sıkıca kapatın. Ardından, fazla polivinil klorürü çıkarmak için orta dikey duvarının etrafını tek kenarlı bir tıraş bıçağıyla kesin. Film, 0.2 hertz'de 100 mikrosaniye darbelerle yaklaşık üç alan potansiyeli uyandırır ve bir yanıtı tetiklemek için yeterli olan yaklaşık bir ila beş mikroamperlik bir akımla başlar.

Kayıt elektrodunu, alan potansiyeli maksimum olana kadar parametal nöron uzun ekseni boyunca artışlarla hareket ettirin. Ardından, bu konumda bir kayıt elektrodu ile akımı artırın ve yaklaşık 10 ila 20 mikro amperlik maksimum akım tepkisine dikkat edin. Son olarak, trans sinaptik olarak uyarılmış yayılan depresyon eşiğini belirlemek için deneyler için yarı maksimal uyaran yoğunluğunu kullanın.

10 hertz'de darbe başına 100 mikrosaniyelik tek patlamaları manuel olarak uyandırmak için stimülasyon paradigmasını değiştirin. Yayılan depresyon tetiklenene kadar uyaran patlaması başına akım yoğunluğunu kademeli olarak artırın. Lumlarda yayılan depresyon eşiğini bildirin, bir saat boyunca her dokuz dakikada bir depresyonun yayılmasını tetikler.

Ayrı dijital sinyal işleme sistemleri aracılığıyla üç alanlı hızlı potansiyel ve yavaş potansiyel değişikliklerini kaydedin. Son yayılan çöküntüden sonra, kültür ekini normal inkübasyon koşullarına geri getirin ve kültür kabı kapağını işaretleyin. Yayılan depresyonu yaşayan kültürü not etmek için, kültür hasadına kadar her üç ila dört günde bir ortam değiştirin.

Bu prosedüre, ISO selektinini büyüme ortamında mililitre başına 20 mikrograma seyrelterek başlayın. Daha sonra dilim kültürleri görüntülemeden dört ila 10 saat önce normal inkübasyon koşullarında inkübe edin, mikroskop kamerasını, UV ışığını, sıcaklık kontrolünü ve gazları görüntülemeden en az bir saat önce açın. Ardından, görüntüleme için metamorf yazılımını kurun, bunu takiben, eki altta iki adet bir milimetre cam çubuk bulunan 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin.

Ardından, ek parçanın duvarları ile kültür kabı arasına üç adet iki milimetrelik lastik boru yerleştirin. Ek parçayı daha da stabilize etmek için, ek parçanın içine ek bir mililitre ortama batırılmış 10 milimetre genişliğinde bir pamuk parçası yerleştirin. Nemlendirilmiş bir ortamı korumak için, kültür kabının üstünü polivinil klorür film ile sıkıca kapatın.

Sıvı kaybını önlemek için, görüntülemenin odağının CA üç parametal hücre tabakası üzerinde olduğundan emin olun. İnce odak penceresinde beş x 10 x ve 20 x olarak faz resimleri çekerek dilimlerin yönünü not edin, aralık akımını sekiz ve doğruluğu tek tıklama olacak şekilde ayarlayın, zaman atlamalı pencerede odak içi bir görüntü sağlamak için odak bulun. Mikroglial hareketleri doğru bir şekilde yakalamak için zaman aralığını bir dakika ve süreyi altı saat olarak seçin.

Görüntüleme, filmin sonunda dakikada bir defadan daha az sıklıkta olmamalıdır. PCR deneyleri için CY konuşma taraması ile hücre hasarını kontrol edin. Dilim kültürü eklerini daha sonra iki ila üç mililitre RNA'ya batırın ve daha sonraki işlemlere kadar üç güne kadar dört santigrat derecede saklayın.

Hasat etmek için, bir cam bıçak kullanarak yabancı dokuyu çıkarın, dilimleri tek tek RNA'lara koyun. DNA'lar içermeyen 1.5 mililitre santrifüj tüpleri, 0.5 mililitre steril fosfat tamponlu salin içerir. İnce uçlu bir boya fırçası kullanarak, numuneleri bir dakika boyunca 10.000 RPM'yi stereotipik bir şekilde döndürün, böylece tüm dilimler tüplerinin aynı tarafına yapışır.

PBS süpernatantını çıkarın ve numuneyi 500 mikrolitre triol içinde yeniden süspanse edin. Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın veya RNA ekstraksiyonuna kadar buz üzerinde tutun SI RNA yıkımından kaynaklanan protein ekspresyonu değişiklikleri, gümüş yoğunlaştırma ve müteakip densi metrik miktar tayini yoluyla geleneksel DAB immün boyamanın geliştirilmesiyle hassas bir şekilde değerlendirilebilir. Burada, CA üç parametal nöron tabakasına bir kayıt mikro elektrodunun yerleştirildiği ve dentat girusa bir bipolar uyarıcı elektrotun yerleştirildiği dilim kültürü elektrofizyolojik kayıt paradigması gösterilmektedir.

Burada, yarı maksimal yanıtı oluşturmak için kullanılan, dentat girus stimülasyonu ile uyarılmış CA üç alan potansiyelinin bir örneği, burada, sonunda yayılan depresyonu tetiklemek için bir yoğunlukta kademeli olarak artan 10 hertz patlamasına CA üç alan potansiyeli tepkisini göstermektedir. Sağ altta. Burada örnek bir hayati bağışıklık hücresi gösterilmektedir.

Bu görüntüleme, ilk kez, mikroglia'nın bir kısmının, sinaptik aktivite ile ters orantılı olan levy uçuşları olarak bilinen kırmızı ile gösterildiği gibi optimal bir arama modelinde uzun mesafeleri hareket ettirdiğini göstermektedir. CDNA'nın preem amplifikasyonu, hipokampal dilim kültürlerinde IFN gama'nın saptanmasına izin verir. Başlangıçta, bir referans gen RPL 13 A için BT 20.5 idi ve solda IFN gama tespit edilemedi.

Bununla birlikte, sağda gösterilen Preem amplifikasyonundan sonra, IFN gama 29.0'da kolayca tespit edildi. RPL 13 A ile, sinyal amplifikasyonunda 12 kat artışı belirtmek için 14.1'de kaydedilen bir verimliliğin immünohistokimyasal doğrulaması burada gösterilmektedir. Peroksidaz diamin benzin immüno boyamanın farklılaştırılmış gümüş yoğunlaştırması, siRNA ile muamele edilen hipokampal dilim kültürlerinde siklofilin B üretiminin önemli ölçüde azalmasını ölçmek için kullanılır.

Bu videoda özetlenen teknikler birkaç gün içinde gerçekleştirilebilir. Hipokampal dilim kültürlerimizin in vivo muadillerine çok yakın olduğunu ve bağışıklık sinyalizasyonunu incelemek ve depresyonu yaymak için ideal olduğunu vurgulamak isteriz. Bununla birlikte, hareketsiz bağışıklık ortamını kontrollü ve sahte koşullar altında tutmak esastır.

Karıştırıcı immün aktivasyonu en aza indirmek için, kültürler steril koşullar altında tutulmalıdır. Aşırı kimyasal, mekanik veya termo bozulmalara maruz bırakılmamalıdırlar. Fizyolojik sitokin sinyalizasyonu femto molar seviyede gerçekleştiğinden, oldukça hassas ve tekrarlanabilir ölçüm teknikleri uygulanmalıdır.

PCRA teknolojisi ve hassas proteomik teknikler kullanıyoruz. Son olarak, sitokinler hem pleiotropik hem de gereksizdir. Buna göre. Zaman içinde ölçülen multipleks sitokin hedefleri, bağışıklık sinyalizasyonunun burkulma, depresyon ve buna bağlı olarak migrene duyarlılığı nasıl modüle ettiğini incelemek için yararlıdır.