Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan fetal fare alt ürogenital kanal dokularındaki mRNA ekspresyon modellerini görselleştirmektir. Bu, öncelikle PCR ile oluşturulmuş bir kalıptan digoksin işaretli bir ribo prob sentezlenerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, titreşimli bir mikrotom kullanarak kalın kesitler oluşturmaktır.

Üçüncü adım, özel sepetler içinde bulunan alt ürogenital sistem kesitlerinde in situ hibridizasyon gerçekleştirmektir. mRNA'lar, BM purple çöktürücü alkali fosfataz substratı kullanılarak, bağlanan ribo probların immünohistokimyasal tespiti yoluyla görselleştirilir. Sonuç olarak, mikroskopi ile fetal fare alt ürogenital sistemindeki düşük ve yüksek bolluktaki mRNA transkriptlerinin uzamsal ve zamansal lokalizasyonu gösterilebilir.

Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ribo problarının kolayca üretilebilmesi ve tüm fare genomundaki çoğu mRNA'yı tanıyacak şekilde hazırlanabilmesidir. Bu yöntem, fetal fare genital üriner gelişimi sırasındaki mRNA ekspresyon modellerine dair bilgi sağlasa da diğer organ sistemlerine, türlere ve gelişim evrelerine de uygulanabilir. Dokunun agar içine gömülmesi sürecinin öğrenilmesi zor olabildiği ve oryantasyondaki küçük farklılıkların tutarsız sonuçlara yol açabildiği için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Dokuyu hazırlamadan en az bir gün önce, 12 milimetre çapındaki bir milli hücre kültür plağının membranını çıkarıp atın; geriye kalan ve kalıp görevi görecek olan halkaları bir gece boyunca RNA inhibitör çözeltisinde bekletin.

Protokol günü, kademeli metanol ile rehidre edilmiş bir fare alt ürogenital sistemini diseke edin. PBS tween yıkamalarıyla mesanenin yaklaşık üçte ikisini atın ve geri kalan alt ürogenital sistem dokusunu PBS tween içinde saklayın. Şimdi, cam bir mikroskop lamı üzerine işlem görmüş bir halka kalıp yerleştirin, içini 62 °C'deki %4'lük düşük erime noktalı agar çözeltisiyle doldurun ve yaklaşık iki dakika boyunca soğumaya bırakın.

Şimdi, alt ürogenital traktus dokusunu blok kurutun ve arose çözeltisine daldırın. Dokunun halkanın üst ve alt kısımlarının tam ortasında asılı kalacak şekilde yönlendirmek için pens kullanın. Arose katılaşana kadar dört derece Celsius'ta inkübe edin.

Dokuyu dilimlemeden önce, çözücülerle ve ardından suyla durulayarak özel bir Wilkinson bıçağı hazırlayın. Çift bıçağı boylamasına iki tekli bıçağa ayırın. Ardından, Wilkinson bıçağını bir mikrotom bıçağı ile destekleyin.

Bunu yapmak için öncelikle mikroton bıçağını, Wilkinson bıçağının uzunluğunda kesin. Ardından, Lock Tite yapıştırıcı kullanarak mikroton bıçağını, kesme kenarından yaklaşık üç ila dört milimetre kayacak şekilde Wilkinson bıçağına yapıştırın. Şimdi, güçlendirilmiş bıçağı titreşimli mikrotoma yerleştirin ve bıçak açısını 35 dereceye ayarlayın.

Banyoyu PBS ile doldurup etrafını ıslak buzla çevreleyerek lüks numune banyosunu hazırlayın. Tapa içine gömülmüş dokuyu monte etmeden önce, dokuyu halka kalıptan çıkarın ve alt yüzeyini blok üzerinde kurutun. Ardından, kurutulmuş yüzeyi Loctite yapıştırıcı kullanarak montaj diskine yapıştırın.

Diski vibratöre yerleştirin ve kesit kalınlığını 50 mikron, hızı iki ve bıçak genliğini dört olarak ayarlayın. Doku kesitlerini alırken, her bir kesiti yarım mililitre buz gibi soğuk PBS tween ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir kültür plakasına aktarmak için küt uçlu pensler kullanın. Dilimleme işleminden sonra, INI hibritlemesine başlamadan önce yay makası kullanarak her bir doku kesitinin etrafındaki arosların çoğunu temizleyin; kesitler, iki milimolar sodyum azit içeren PBS tween içerisinde dört derece Celsius'ta 48 saate kadar saklanabilir.

Öncelikle, bir mikro santrifüj tüpünün alt kısmını 100 µL işaretinden keserek özel numune sepetleri hazırlayın. Tüpün kesilecek kısmını, plastik yumuşayana kadar alevde ısıtın. Ardından, yumuşayan plastiği bir tel örgü karesinin üzerine sıkıca bastırın.

Sertleşmesini bekleyin ve fazla ağ kısmı kesin. Her tüp kapağına ısıtılmış 18 gauge bir iğne ile iki delik açarak sepetleri tamamlayın. 24 kuyucuklu bir plaka kapağına eşit aralıklarla 24 adet 12 milimetrelik delik açarak örnek sepetlerini tutacak bir tepsi hazırlayın.

Kapaklı bir hibridizasyon haznesi, içerisine yaklaşık 1,27 cm yüksekliğinde musluk suyu doldurularak 60,5 °C'ye ön ısıtmaya başlanmadan önce her bir delik doğrudan bir kuyucuğun üzerine gelecek şekilde konumlandırılmalıdır. 24 kuyucuklu kültür plakasının her bir kuyucuğuna iki mililitre PBS tween ekleyerek in situ hibridizasyon işlemine başlayın. Bu plakayı, sepetlerin yerleştirildiği hazırlanmış kapakla kapatın.

Şimdi doku kesitlerini oda sıcaklığında sepetlere aktarın ve sallamalı inkübatörde %6 hidrojen peroksit içeren PBS tween ile inkübe edin; bunu PBS tween ile bir dizi yıkama, proteinaz K ile inkübasyon, bir başka fiksasyon ve ek yıkamalar takip etsin. Numunelerin hazırlanmasını tamamlamak için, her kuyucuğa iki mililitre ön ısıtılmış pre-hibritizasyon tamponu ekleyin ve plakayı ısıtılmış hibritizasyon odasında en az bir saat inkübe edin. Her birine 0,5 mikrogram işaretli RIBA Probu ekleyerek hibritizasyonu başlatın.

Ardından, inkübasyona ısıtmalı hibridizasyon odasında gece boyunca devam edin. Ertesi gün dokuları, çözelti birden çözelti ikiye kademeli olarak geçerek yıkayın, ardından RNase ile işlem uygulayın. Sonrasında çözelti üç ile yıkayın, dokular doku bloklama tamponunda inkübe olurken TBS tween ve doku bloklama tamponu ile yıkamaları gerçekleştirin.

İnkübasyon süresinin ardından, anti dig antikörünü antikor absorbsiyon tamponunda dört derece Celsius'ta en az iki saat boyunca inkübe etmeye başlayın. Antikor çözeltisini 10,000 RPM hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmak için, iki mililitre antikor çözeltisi tamponuna Senna ekleyin.

Şimdi dokuları bloklama tamponundan çıkarın ve hazırlanan antikor çözeltisinde inkübe edin. Prosedürün üçüncü gününde, dokuları bir hibridizasyon odasında gece boyunca 4 °C'de bekletin. Dokuları birkaç kez TBST ile yıkayın.

Ardından, cam pasta pipeti kullanarak dokuları dikkatlice temiz mikro santrifüj tüplerine aktarın. Dokuları, bir mililitre NTM boşluğu ile 10 dakika boyunca yıkayın.

Ardından solüsyonu, lava sole MBM purple içeren TMT ile değiştirin. Tüpleri karanlıkta bekletin ve sonraki birkaç gün boyunca renk gelişimini izleyerek gerektiğinde solüsyonu yenileyin. Renk gelişimi tamamlandıktan sonra, dokuları kısaca lava sole içeren TMT ile yıkayın ve ardından paraformaldehit içeren PBS içerisinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün dokuları ağartın ve yıkayın. Kesitler artık görüntüleme için hazırdır. Alt ürogenital kanal dokusu, üretral orta hattı aros tıpasının düz yüzeyine paralel olacak şekilde agara gömülmüştür.

Bu oryantasyon sagittal kesitler sağlamıştır. Özel yapım örnek sepetleri, hassas doku kesitlerini toz ve partikül maddelerden korumuştur. Birkaç gün süren C iki hibridizasyon prosedürü sırasında.

Ayrıca herhangi bir kesitin kaybını da önlediler. Düşük bolluktaki mRNA'ları tespit etmek için gereken uzun inkübasyonlar sırasında arka plan boyanmasını sınırlamak zordur. Ancak, sodyum azid eklenmesi ve ardından yapılan filtrasyonun arka plan boyanmasını sınırladığı görülmektedir.

Ayrıca, örnekler renk geliştirme solüsyonunda uzun süre inkübe edildiğinde arka plan boyanmasında görünür bir fark oluşmamıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde altı günde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, mRNA ekspresyon paterninin protein ekspresyon paterni ile korele olup olmadığını belirlemek için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mRNA ekspresyon modellerini ve gelişmekte olan fare alt genital sistemini nasıl görselleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.