Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan fetal fare alt ürogenital sistem dokularında mRNA ekspresyon modellerini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak PCR tarafından oluşturulan bir şablondan etiketli ribo proburada bir di oksijenin sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, titreşimli bir mikrotom kullanarak kalın kesilmiş kesitler oluşturmaktır.

Üçüncü adım, özelleştirilmiş sepetlerde bulunan alt ürogenital sistem kesitlerinde in situ hibridizasyon yapmaktır. mRNA'lar, BM mor çökeltici alkalin fosfataz substratı kullanılarak bağlı ribo problarının immünohistokimyasal tespiti yoluyla görselleştirilir. Sonuç olarak, mikroskopi, fetal fare alt ürogenital sistemindeki düşük ve yüksek bolluktaki mRNA transkriptlerinin uzamsal ve zamansal lokalizasyonunu gösterebilir.

Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ribo problarının üretilmesinin kolay olması ve tüm fare genomundaki çoğu mRNA'yı tanımak için yapılabilmesidir. Bu yöntem, fetal fare genital idrar gelişimi sırasında mRNA ekspresyon paternleri hakkında bilgi sağlasa da, diğer organ sistemlerine, türlere ve gelişim aşamalarına da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü dokuyu burgu içine gömmek öğrenmek zor olabilir ve oryantasyondaki küçük değişiklikler tutarsız sonuçlara yol açabileceğinden, dokuyu hazırlamadan en az bir gün önce, zarı 12 milimetre çapında bir mili hücre kültürü plakasından çıkarın ve atın, kalan halkayı yerleştirmek bir kalıp olarak işlev görürken, halkaları gece boyunca RNA inhibitör çözeltisine batırın.

Protokol gününde, dereceli metanol ile rehidre edilmiş bir fare alt ürogenital yolunu inceleyin. PBS ara yıkamaları, mesanenin yaklaşık üçte ikisini atar ve kalan alt ürogenital sistem dokusunu PBS arasında depolar. Şimdi işlenmiş bir halka kalıbı bir cam mikroskop lamına yerleştirin ve 62 santigrat derecede% 4 düşük eriyik arose çözeltisi ile doldurun ve yaklaşık iki dakika soğumaya bırakın.

Şimdi, alt ürogenital sistem dokusunu bloke kurutun ve ortaya çıkan solüsyona batırın. Dokuyu yönlendirmek için forseps kullanın, böylece halkanın üst ve alt kısmı arasında yarıya kadar asılı kalır. Küf, ortaya çıkana kadar dört santigrat derecede inkübe edilir.

Dokuyu dilimlemeden önce, çözücülerle durulayarak ve ardından suyla özel bir wilkinson bıçağı hazırlayın. Çift bıçağı uzunlamasına iki tek bıçağa ayırın. Ardından, Wilkinson bıçağını mikrotonlu bir bıçakla destekleyin.

Önce bunu yapmak için, mikroton bıçağını Wilkinson bıçağının uzunluğuna kadar kesin. Ardından, bir Lock Tite yapıştırıcısı kullanarak, mikroton bıçağını, kesme kenarından yaklaşık üç ila dört milimetre kaydırarak Wilkinson bıçağına yapıştırın. Şimdi güçlendirilmiş bıçağı titreşimli mikrotoma monte edin ve bıçak açısını 35 dereceye ayarlayın.

Banyoyu PBS ile doldurarak ve etrafına ıslak buz koyarak lüks numune banyosunu hazırlayın. Tapaya gömülü dokuyu monte etmeden önce, halka kalıptan çıkarın ve alt yüzeyi kurulayın. Daha sonra kurumuş yüzeyi Loctite yapıştırıcı kullanarak montaj diskine yapıştırın.

Diski vibratöre yerleştirin ve kesit kalınlığını 50 mikrona, hızı ikiye ve bıçak genliğini dörde ayarlayın. Doku bölümlerini keserken, her bölümü yarım mililitre buz gibi soğuk PBS arası ile doldurulmuş 24 oyuklu bir kültür plakasına aktarmak için künt forseps kullanın. Dilimlemeden sonra, INI hibridizasyonuna başlamadan önce yaylı makas kullanarak her doku bölümünün etrafındaki aroların çoğunu çıkarın, bölümler iki milimolar sodyum azid içeren PBS arasında dört santigrat derecede 48 saate kadar saklanabilir.

İlk olarak, 100 mikrolitre işaretinde bir mikro santrifüj tüpünün altını keserek özel numune sepetleri yapın. Tüpün kesilmesini plastik yumuşayana kadar alevde ısıtın. Ardından yumuşak plastiği bir ağ kareye sıkıca bastırın.

Fazla ağı sertleştirmesine ve düzeltmesine izin verin. Her tüp kapağına iki delik açmak için ısıtılmış 18 gauge iğne kullanarak sepetleri tamamlayın. 24 oyuklu bir plakanın kapağına 24 eşit aralıklı 12 milimetre delik açarak numune sepetlerini tutmak için bir tepsi yapın.

Yarım inç musluk suyu ile doldurulmuş kapalı bir hibridizasyon odasını 60,5 santigrat dereceye kadar ön ısıtmaya başlamadan önce her delik doğrudan bir kuyu üzerine yerleştirilmelidir. 24 kuyucuklu kültür plakasının her bir oyuğuna iki mililitre PBS arası ekleyerek yerinde hibridizasyona başlayın. Bu plakayı sepetlerle dolu hazırlanan kapakla örtün.

Şimdi doku bölümlerini oda sıcaklığında sallanarak sepetlere aktarın, bölümleri PBS tween ile% 6 hidrojen peroksit içinde inkübe edin, ardından PBS tween ile bir dizi yıkama, proteinaz K ile bir inkübasyon, başka bir fiksasyon ve daha fazla yıkama yapın. Numuneleri hazırlamayı bitirmek için, her bir oyuğa iki mililitre savaş öncesi hibridizasyon tamponu ekleyin ve plakayı ısıtılmış hibridizasyon odasının içinde en az bir saat inkübe edin. Her birine 0,5 mikrogram etiketli RIBA Probu ekleyerek hibridizasyonun başlatılmasını sağlayın.

Daha sonra, ısıtılmış hibridizasyon odasının içinde gece boyunca inkübasyona devam edin. Ertesi gün, dokuları birinci çözelti ile yıkayın, yavaş yavaş ikinci çözeltiye geçin, ardından RNA'larla muamele edin. Daha sonra üçüncü çözeltide yıkayın, ardından dokular doku bloke edici tamponda inkübe edilirken TBS arası ve doku bloke edici tamponda yıkayın.

İnkübasyon süresinden sonra dört santigrat derecede antikor absorpsiyon tamponunda anti dig antikorun en az iki saatlik inkübasyonuna başlayın. Antikor çözeltisini bir dakika boyunca 10.000 RPM'de döndürün. Çözünenleri çıkarmak için, Senna'yı iki mililitre antikor çözeltisi tamponuna ekleyin.

Şimdi dokuyu bloke edici tampondan çıkarın ve hazırlanan antikor çözeltisi içinde inkübe edin. İşlemin üçüncü gününde gece boyunca dört santigrat derecelik bir hibridizasyon odasında tutun. Dokuları TBST'de ole ile birkaç kez yıkayın.

Sonra bir cam makarna pipeti kullanarak. Dokuları dikkatlice temiz mikro santrifüj tüplerine aktarın. Mendilleri bir mililitre NTM boş olarak 10 dakika yıkayın.

Ardından çözeltiyi lav tabanı MBM mor içeren TMT ile değiştirin. Tüpleri karanlıkta ve sonraki birkaç gün boyunca yerleştirin, renk gelişimini izleyin ve çözeltiyi gerektiği gibi değiştirin. Tam renk gelişiminden sonra, dokuları lav içeren TMT ile kısa bir süre yıkayın ve ardından para formaldehit içeren PBS'de gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün ağartın ve dokuları yıkayın. Kesitler artık görüntüleme için hazırdır. Alt ürogenital sistem dokusu, üretral orta hat aros tıkacının düz yüzeyine paralel olacak şekilde agar'a gömüldü.

Bu yönelim sagital kesitler verdi. Özel yapım numune sepetleri, hassas doku bölümlerini toz ve partikül maddelerden korudu. C'de çok gün boyunca iki hibridizasyon prosedürü.

Ayrıca herhangi bir bölümün kaybını da önlediler. Düşük bolluktaki mRNA'ları tespit etmek için gereken uzun inkübasyonlar sırasında arka plan lekelenmesini sınırlamak zordur. Bununla birlikte, sodyum azid ilavesi ve müteakip filtrasyon, sınırlı arka plan boyamasına sahip gibi görünmektedir.

Ayrıca, numuneler uzun süre renk geliştirme çözeltisi içinde inkübe edildiğinde arka plan boyamasında gözle görülür bir fark yoktu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa altı gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, mRNA'ların ekspresyon paterninin proteinlerin ekspresyon paterni ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için immünohistokimya gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mRNA ekspresyon kalıplarını nasıl görselleştireceğinizi ve gelişmekte olan farenin genital yolunuzu nasıl alçaltacağını iyi anlamış olmalısınız.