Name: Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin, fetal fare alt ürogenital yolunda mRNA ifade desenlerini yüksek verimli in situ hibridizasyon yöntemiyle görselleştirmeyi. Bu teknik, gelişimsel biyoloji araştırmalarında gen ekspresyonunu incelemek için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar doku sepet hazırlanmasında Dr Lan Yi, New Jersey Kanser Enstitüsü, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeler DK083425 ve DK070219 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

1. PCR oluşturuldu Şablon digoxigenin-11-UTP Etiketli Spastine Özgü Riboprop Sentezi <ol><li> Gen-spesifik bir Spastine Özgü Riboprop sentezlemek için, cDNA referans gen sekansı (RefSeq) elde etmek için Entrez Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) kullanın . CDNA dizisinin 3'-bölge karşı gen-spesifik PCR primerleri tasarım Primer3 programı (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 kullanın. PCR primer seçimi için önerilen parametreler (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html) başka bir yerde tanımlanmıştır. </li><li> MegaBLAST Programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 seçilen DNA dizisi özgüllüğü değerlendirmek için kullanın. 0.01 BEKLEYEBILIRIM eşik kullanarak, DNA sekans spesifik olarak kabul edilir, diğer dizileri RefSeq veritabanı ile uyumlu değildir. </li><li> PCR Spastine Özgü Riboprop şablonu yükseltmek. PCR reaksiyonu bileşenleri ve thermocycling koşulları her astar kümesi için optimize edilmelidir. Tipik bir 50 ul reaksiyon içerir: 1X tampon, 2mm MgCl 2, 0.2mm dNTP, 1X Q çözümü, 1μg cDNA, 2.5U Taq DNA polimeraz, 0.25μm primerler ve nükleaz içermeyen H 2 O. Tipik bir thermocycling protokolü bir ilk denatürasyon 94 ° 2dk 30sn 40 çevrimleri ile 94 ° C için C, 57 ° C, 30 saniye için 72 ° C 1dk ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son bir uzantısı içerir. CDNA PCR reaksiyonlarında kullanılan fare ürogenital mRNA sentezlenir. </li><li> PCR ürünü agaroz jel elektroforezi ile ayırın, Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak arındırmak ve saflaştırılmış ürünler spektrofotometri ile ölçmek. Beklenen verimi 1.2 - 3.6μg. </li><li> Etiketli Spastine Özgü Riboprop içine PCR ürünü Transcribe. Transkripsiyon reaksiyonu (40 ul) içerir: 400ng saflaştırılmış PCR ürünü, 1X digoxigenin 11-UTP, 1X transkripsiyon tampon, 5U RNaz inhibitörü, 80U T7 RNA polimeraz ve nükleaz içermeyen H 2 O. içeren nükleotid etiketleme karışımı Inkübe 3-4saat, 37 ° C ve ajitasyon örnekleri her 30 dk. </li><li> Sütun DNaz sindirim RNA temizleme talimatları dayalı riboprobes arındırmak için Qiagen RNEASY Mini kiti kullanın. Spektrofotometri riboprobes Asitli. Beklenen verimi 4-20 mg. % 1.5 sigara denatüre agaroz jel elektroforezi ile bir kısım ayırarak prob kalitesini değerlendirmek. Yüksek kaliteli probları minimal bulaşması ile ayrı bantları olarak göç ederler. </li><li> Spastine Özgü Riboprop özellikle hedef tanır sağlamak için, ilk ISH deney için bir pozitif kontrol doku içerir. Bu pozitif kontrol dokusu Spastine Özgü Riboprop hedef mRNA desen bilinmesi gerekmektedir. </li></ol> 2. Titreşimli Mikrotom Blade Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7 <ol><li> % 4 düşük erime agaroz çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS). Agaroz çözülür ve 62 çözüm korumak için Mikrodalga çözüm ° C </li><li> 12mm çapı Millicell kültür plakasına yerleştirin ve bir agaroz kalıp olarak kullanmak için polistiren halka korumak zarı çıkarmadan polistiren halka kalıp hazırlayın. Her kullanımdan önce RNaz inhibitörü çözümü geceleme halkaları bekletin. </li><li> Düzgün bir kesim yüzeyi sağlamak için,% 100 konsantrasyonda, aşağıdaki çözücüler ile durulama Wilkinson bıçak yüzeyi pas önleyici ve diğer katkı maddeleri kaldırın: petrol eteri, ksilen, kloroform, metanol ve MilliQ su. Iki tek bıçak içine uzunlamasına çift bıçak ayırın. </li><li> Wilkinson bıçakları Loctite yapıştırıcı ile bir mikrotom bıçak uyun. Mikrotom bıçak kesim için değil, Wilkinson bıçak sertliği ekleyen. Wilkinson, bıçağın kesme kenarından 4mm - mikrotom bıçağı, metal makas ve bir kez yapıştırılır kullanarak Wilkinson bıçak uzunluğu kesilmelidir, 3 mahsup edilmelidir. </li></ol> 3. Kesit Ürogenital Dokular Diseksiyon, Depolama ve Hazırlık <ol><li> PBSTw çözüm hazırlayın (PBS% 0.1 içeren Tween ™ 20 ve 0.2mm sodyum azid 0.22μm Stericup süzgecinden ® filtre ünitesi). Çözüm önceden hazırlanmış ve 25 ° C'de saklanabilir </li><li> 4 geceleme taze disseke fare LUT (mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapılar) ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid fiksatif içeren inkübe edin. </li><li> 25 10 dakika süreyle yıkanması ° C kademeli metanol / PBSTw (1:3, 1:1, 03:01 v / v) çözümleri bir dizi dokular dehydrate. Gecede en az% 100 metanol içinde -20 ° C saklayınız örnekleri. Arşivlenmiş dokulara en az 2yr tutulabilir. </li><li> Arşivlenen dokuların rehidrate kesit için dokular hazırlayın. 25 ° C, kademeli metanol / PBSTw bir dizi (3:1, 1:1, 01:03 v / v) çözümleri 10 dakika süreyle yıkayın. </li><li> Inceleyin ve üretra bağlı trigon bölgenin en bırakarak, mesane yaklaşık üçte ikisi iptal. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 4. Agaroz ürogenital Doku gömme <ol><li> 25 ° C düz cam mikroskop lamı, aşağı polistiren halka kalıp, düz bir yüzeye yerleştirin. </li><li> 62 ° C agaroz çözeltisi ve 2 dakikada bir yaklaşık serin halka kalıp doldurun. </li><li> PBSTw LUT doku çıkarın ve silin emici bir kuru kurulayın. </li><li> Agaroz çözüm doku aktarın. </li><li> Yönlendirmek agaroz katılaşmış ° C kadar halka kalıp alt ve üst arasında yarım asma ve 4 doku inkübe böylece agaroz LUT doku forseps kullanın. </li><li> Doku agaroz katılaşma sürecinde tamamen lavabolar, agaroz ve yeniden gömülü eksize edilebilir. Yeniden gömme işlemi sırasında gerekli agaroz soğutma saati ayarlayın. </li></ol> 5. Titreşimli Mikrotom (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7 ile Ürogenital Doku Kesit <ol><li> Titreşimli mikrotom Mount takviyeli Wilkinson bıçak ve bıçak açısı 35 ° 'ye ayarlayın. Deluxe örnek banyo PBS ve paket numune banyo etrafında ıslak buz ile doldurun. </li><li> Halka kalıp katılaşmış agaroz fişini çıkartın ve emici bir malzeme ile silin alt yüzeyi kurulayın. Doku doğru yönde olduğundan emin olun. Dokular oryantasyon agaroz fişi düz kenarı konik bir jilet kullanarak ayarlanabilir. </li><li> Şekil Loctite yapıştırıcı ile disk montaj titreşimli mikrotom numune üzerine agaroz fiş uyun. 1A. </li><li> Vibratome içine numune montaj disk yerleştirin. </li><li> 4 mikrotom kesit kalınlığı 50μm, 2 hız ve bıçak genlik ayarlayın ve doku kesitlerinde kesme başlar. </li><li> Künt forseps buz 0.5mL PBSTw içeren 24-iyi bir kültür plakasına her doku kesiti (Şekil 1B) aktarmak için kullanın. </li><li> In situ hibridizasyon, tüketim için her doku bölümü (kalan agaroz ISH prosedürü sırasında eriyecek) etrafında agaroz örnekleri hazırlamak ve ilgili tüm pislikleri temizleyin. 4 48hr Mağaza bölümleri ° C PBSTw içinde. </li></ol> 6. Situ Hibridizasyon için Örnek Sepeti Hazırlama <ol><li> 100μL işareti mikrosantrifüj tüp alt kesin. </li><li> Kadar plastik yumuşatılmış bir alev tüp kesme kenarı Isı mikrosantrifüj tüp, daha sonra merkezi bir 0.5in polyester mesh kare üzerine sıkıca basın. </li><li> Trim ve aşırı örgü sepet hazırlama (Şekil 1C) tamamlamak için her tüp kapağının içine delmek iki delik ısıtmalı 18 iğne kullanın. </li><li> 24 plaka kapağını çıkarın ve her aşkın merkezli bir 12mm delik. ISH protokol yıkar (Şekil 1D) arasında örnek sepetler aktarmak için kapağı kullanın. </li></ol> 7. Situ Hibridizasyon için Embriyo Toz Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü) 8 <ol><li> Aynı doku bölümleri olarak değerlendirilmekte olup, sahne ve mağaza -80 ° C fareler fare embriyo doku toplamak Dondurulmuş doku, sıvı nitrojen içinde seramik harcı, batığın doku içine yerleştirin ve doku ince bir toz haline öğütmek için bir havaneli kullanabilirsiniz. </li><li> Aseton 4 cilt embriyo tozu birleştirin ve Dounce Homojenizatör birkaç vuruş ile homojenize. </li><li> 15 mL cam vida top flakon Homojenat transferi ve gece ekstresi, 4 ° C </li><li> 4 10 dakika süreyle santrifüj 5000rpm Pelet embriyo tozu ° C Lipit içeren süpernatant çıkarın ve atın. Taze aseton 4vol içinde doku pelletini tekrar ve 4 2saat için ayıklamak ° C </li><li> Pelet 4 5000rpm 10 dakika süreyle santrifüj embriyo toz ° C Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> Hava # 2 Whatman filtre kağıdı pelet kurulayın. 4 sıkıca kapalı cam şişe içinde ince bir toz ve mağaza verim pelet Crush ° C Yaklaşık verimi 1 g embriyo ıslak ağırlık başına 50 mg toz. </li></ol> 8. Gün 1 Situ Hibridizasyon <ol><li> 60.5 için ısıtın prehybridization solüsyonu (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 Engelleme reaktif, 10μg/mL maya tRNA, 10μg/mL heparin mağaza -20 ° C) ° C Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de saklanabilir </li><li> Musluk suyunun yaklaşık 0,5 ile küçük bir plastik saklama kabı doldurarak nemlendirilmiş bir melezleşme odası hazırlayın. 60.5 ° C'ye kadar konteyner ve ön ısıtma Kapak </li><li> 24-iyi bir kültür plaka kuyulardan 2mL PBSTw ekleyin. Örnek sepet sepet (sepet başına 10 bölüm kullanılmıştır) içine 24 plaka kapağı ve transfer doku kesitlerinde deliklere yerleştirin. </li><li> 25 saat 30 dakika için doku bölümleri inkübe ° C% 6 H 2 O 2. Bu ve sonraki tüm inkubasyon aksi belirtilmedikçe, bir yörünge çalkalayıcı üzerinde yavaşça sallanarak ile yürütülen olmalıdır. Tüm inkubasyon bird yıkar 24-kuyucuğu yapılan ve 2mL/well toplam bir çözüm hacmi kullanın. </li><li> 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 4 x 5min yıkayın. </li><li> 25 12min için doku bölümleri inkübe ° C PBSTw içinde 5μg/mL proteinaz K içeren </li><li> 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 1 x 5min yıkayın. </li><li> 25 Post-fix 20dk için doku kesitlerinde ° C PBS içinde% 4 ve% 0.2 paraformaldehid glutaraldehid içeren. </li><li> Doku kesitlerinde 2 x 5min 25 ° C PBSTw içinde yıkayın. </li><li> Prewarmed prehybridization tampon 2mL/well ekleyin ve içindeki doku bölümleri 60.5 1hr en az nemlendirilmiş hibridizasyon odası ° C inkübe </li><li> 60.5 nemlendirilmiş hibridizasyon odasında bir gecede her iyi ve inkübe doku kesitlerinde prehybridization tampon 0.65μg etiketli Spastine Özgü Riboprop ekle ° C </li></ol> 9. 2 Situ Hibridizasyon Gün <ol><li> Post-hibridizasyon yıkama adımları için aşağıdaki çözümleri hazırlayın Çözüm 1 (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 SDS), Çözüm 2 (10mM Tris-HCL pH 7.5, 0,5 M NaCl,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid: ,) süzülmüş 0.22μm ve Çözüm 3 (2x SSC,% 50 formamid). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. Çözüm 1 ve 3 -20 ° C ve Çözüm 2 saklanır 25 saklanır ° C Çözümleri depolama ömrü en az 3 ay. </li><li> 60.5 doku kesitlerinde 3 X 30 dakika yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1. Yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın. </li><li> 60.5 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1/Solution 2 (1:1 v / v) solüsyonu ile. Yıkama sırasında nemlendirilmiş kamara kullanın. </li><li> Çözüm 2 ile 25 ° C sıcaklıkta doku kesitlerinde 4 X 10dk yıkayın. </li><li> 37 15dk için doku bölümleri inkübe ° C Çözüm 2 içeren 0.25μg/mL RNaz. </li><li> 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C Çözüm 2 (RNaz olmadan). </li><li> 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C, 3 Çözüm 2 X1hr Çözüm 3 ile 60.5 ° C 'de yıkar. 60.5 ° C yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın. </li><li> DIG etiketli riboprobes immünohistokimyasal tespiti için aşağıdaki çözümleri hazırlayın: Doku Engelleme Tampon (TB 1X TBS,% 10 koyun serum,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.22μm süzülmüş), Antikor Seyreltme Tampon (AD, 1xTBS,% 5 koyun serumu,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22 ™ m süzülmüş) Antikor Absorbsiyon Buffer (AA 1xTBS,% 5 koyun serum, 1 % engelleme reaktif,% 1 BSA, 6mg/mL embriyo tozu) ve TBSTw (1xTBS,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. TBSTw 25 ° C'de saklanır, diğer tüm çözümler -20 ° C'de saklanır </li><li> 25 3 X 10 dak ° C TBSTw ile yıkayın. </li><li> En az 25 2saat ° C TB tampon doku bölümleri inkübe edin. </li><li> Dokularda TB tampon kuluçka iken, her bir kuyu için 200μL AA tampon başına 1.1μL anti-DIG antikor ekleyin. Inkübe AA tamponu + antikor en az 4 2saat ° C, daha sonra 1dk için 10.000 rpm'de santrifüj. AA tampon süpernatantı ve AD tampon 2mL ekleyin. </li><li> TB tampon doku bölümleri çıkarın ve nemlendirilmiş bir odasında 4 gecede inkübe ° C antikor içeren AD tampon. </li></ol> 10 Situ Hibridizasyon Gün 3 <ol><li> Renk geliştirme çözümü NTMT (100 mM Tris-HCL pH 9.5, 100 mM NaCl, 50mm MgCl 2, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş) hazırlayın. Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve 25 ° C'de saklanabilir Hemen önce, 2mm levamizol eklemek ve% 0.1 Tween ™ 20. </li><li> 4 kuyu ve mağaza çözüm ° C antikor çözeltisi (AD tampon + antikor) çıkarın Iki kez tekrar edilebilir. </li><li> Dokuların 8 X 10 dakika 25 ° C TBSTw ile 2mm levamizol içeren yıkayın. </li><li> TBSTw bulunduğu Petri kabı dikkatlice sepet dokuların aktarmak. Forseps görünür enkaz kaldırmak için kullanın. Dokuların temiz mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. </li><li> Dokular 25 1 X 10 dak ° C 1mL NTMT ile yıkayın. </li><li> NTMT çıkarın ve hafif bir koruma kutusu ve inkübe 25% 50 NTMT (2mm levamizol içeren) ve% 50 BM Mor yer tüpleri içeren bir karışımı 1mL/tube ° C ekleyin Renk geliştirme süresini birkaç saat ile birkaç gün arasında değişmektedir. Renk geliştirmek için yavaş ise,% 100 BM Mor kullanılabilir. </li><li> Monitör renk gelişim ve değişim NTMT / BM Mor çözüm çöktürülmüş kristalleri birikir eğer veya sarı ve mor renk değişikliğine uğrar. Tam renkli kalkınma sonra (4-250 saat), yıkama dokuların 25 2 X 5min ° C ile 1mL/tube 2mm levamizol içeren NTMT. </li><li> 4 geceleme dokuların inkübe ° C PBS 1mL/tube% 4 paraformaldehid sonrası fiksatif içeren. </li><li> Çamaşır suyu için dokular, 30 dakika boyunca inkübe dokuların 25 ° C 1mL/tube PBSTw,% 3 H 2 O 2 içeren </li><li> Doku bölümleri, cam slaytlar monte dakika muamele ve bir bileşik mikroskobu ile görüntülenmiş. </li></ol> 11. Temsilcisi Sonuçlar: Uzamsal yönlendirme agaroz LUT doku doku kesitlerinde uçağın belirler. Sagital bölümler için, mesane en az üçte ikisinin eksize edilir ve kalan LUT doku üretral orta hat agaroz fişi (Şekil 1A) düz bir yüzeye paralel olduğunu agar gömülü. Agaroz fişi düz kenarına pah doku düzlemde küçük ayarlamalar yapılabilir. Bu düzlemde odaklı bir 17.5dpc erkek LUT doku bir temsilci sagital kesiti Şekil 1B gösterilmiştir. Örnek sepet kaybı ve çok günlük ISH işlemi sırasında biriken toz ve partiküler madde hassas doku bölümleri korur. Örnek sepet 1.5mL mikrofuge'de tüp (Şekil 1C) kesim sonuna kadar polyester mesh eriterek hazırlanmıştır. Küçük bir delik, içine ve dışarı sepetler çözüm akışını kolaylaştırmak için her bir numune sepeti kapağının içine deldi. Örnek sepetleri 24 plaka kapakları (Şekil 1D) 12mm delik delinmiş koyarak ISH çözümler askıya alınır. Modifiye plaka kapakları çözüm değişiklikleri sırasında 24-kuyucuğu arasında transfer sepet destekler. Bu uzun inkübasyon dönemlerinde düşük bolluk mRNA'ların tespiti için gerekli olan non-spesifik bir arka plan boyama sınırlamak zordur. 0.22μm filtreler aracılığıyla örnek tamponlar 0.2mm ve sodyum azid sonraki filtrasyon yanı sıra, arka plan boyama (Şekil 2) sınırlamak için ortaya çıktı. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, örnekleri uzun bir süre bir süre için (Şekil 3), renk geliştirme çözümü inkübe zaman arka plan boyama görünür farklılıklar görünmüyor. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bir fare, alt ürogenital (LUT) yolu doku bölümünde ve mikrosantrifüj tüp ISH için bir sepet hazırlanması . Mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapısı) bir parçası içeren bir LUT% 4 düşük erime agaroz silindirik bir fiş yerleştirilmiştir. (A) fişi bir örnek montaj diske yapıştırılmış ve (B) titreşimli mikrotom 50μm bölümleri oyulmuş. (C) bir LUT bölümünde tüp kapağı ve eritme polyester mesh tüp kesme alt ucunda bir delik delme tarafından hazırlanan bir mikrosantrifüj tüp sepet içine transfer edilir. (D) mikrosantrifüj tüp doku bölümleri ISH protokol sırasında tampon çözelti askıya alınır, böylece, bir 24-plaka kapağının içine delinmiş 12mm deliklere eklenir. Arrowheads agaroz fiş LUT doku göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 0.22μm süzülmüş çözümler 0.2mm sodyum azid Incorporation, doku kalitesini artırır ve arka plan boyama azaltır . 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Doku bölümler büküm homolog 1 yöneltilen bir prob kullanarak ISH tarafından boyandı. (A) ISH için kullanılan Tamponlar ya 0.22μm filtrelenmiş ve 0.2mm sodyum azid (Naaz) ile desteklenebilir veya (B) filtrelenmemiş ve Naaz ile desteklenebilir. Ok uçları arka plan boyama göstermektedir. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Arka plan boyama yoğunluğu, uzun süreli bir renk gelişimi ile artış görünmüyor. 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Bölüm (A) 9.5h (B) 43.5h orta bolluk tanıdığı bir prob kullanarak, yüksek bolluk transkript östrojen-reseptör gama (Esrrg) tanıdığı bir prob kullanarak kromajen boyama çözüm onları kuluçka ISH boyandı transkript bromodomain çinko parmak etki alanına bitişik, 2A (Baz2a), veya (C) düşük bolluk transkript kanatsız-tipi MMTV entegrasyon sitesi aile, üye 10a (Wnt10a) tanıdığı bir prob kullanarak 236h. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada anlatılan yöntemi kullanarak, tüm önemli hücre tipleri ve mezenkimal pedleri, ürotelium&#39;un, düz kas, prostat tomurcukları, ejakülasyon kanalı ve vajina da dahil olmak üzere fetal erkek ve dişi fare LUT doku bölmeleri mRNA&#39;ların tespit etmek mümkündür. Bu protokolde kullanılan 50μm bölümler, mimari dokusu (kan damarları gibi) çözmek için yeterli kalınlığa olmanın avantajı var ama yaygın tüm montaj ISH sırasında karşılaşılan metodolojik bir sorundur prob yakalama önlemek için yeterince ince. Her yeni Spasti...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Anti-digoxigenin antikor, Fab parçaları </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Mor AP substrat, presipite </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plaka iyi 24 </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> , Iki ucu keskin bir jilet bıçak </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klasik Model </td></tr><tr><td> Eliminase RNaz Remover </td><td> Decon Laboratuvarları </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Jel ekstraksiyon kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> H 2 O Glutaraldehyde,% 25 çözüm </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O Hidrojen peroksit,% 30 çözüm </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamizol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 hızlı ayarı anlık yapıştırıcı </td><td> Henkel A.Ş. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleik asit </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüpler, 1.5mL </td><td> Biologix Araştırma Şirketi </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell kültür plaka eklemek </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Moleküler taşlama reçine </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehit,% 4 çözelti fosfat tamponlu salin </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Fosfat Ca ve Mg olmadan tamponlu salin </td><td> MP Biyomedikal </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester örgü, 33 mikron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Küçük Parça A.Ş. </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinaz K çözümü, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Sütunlar </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q çözümü </td><td> Qiagen </td><td> Taq DNA polimeraz ile Sağlanan </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNaz-ücretsiz DNaz </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque düşük erime agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Koyun serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filtre ünitesi, 0.22μm, polyethersulfone, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Sodyum azid, taneli </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X çözüm </td><td> Araştırma Ürünler Uluslararası </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> Üst Simge III ilk iplikçik sentez sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimeraz </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Deluxe örnek banyo mikrotom Titreşimli </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Maya tRNA </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

yüksek verimli in situ</emfetal fare alt Ürogenital yolu mrna İfade desenler karakterize> hibridizasyon yöntemi

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Alt üriner sistem (LUT) geliştirilmesi, karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, androjenik sinyalleri ve etkileşimleri 1,2 epitelyal-mezenkimal dayanmaktadır fetal erkek üretra, prostat oluşumu sırasında kanıtlanmıştır . Prostat gelişiminde sorumlu olan moleküler mekanizmaların anlaşılması uygunsuz prostat, benign prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi hastalıklara yol açmaları daha sonra yaşamın yeniden canlanmasına sebep oldu büyüme mekanizmalarının ortaya çıkarabilir. Gelişmekte olan LUT anatomik olarak karmaşık. Tomurcuklanma zaman prostat 16.5 gün anlayışı (DPC) başlar, çok sayıda hücre tipleri mevcuttur. Damarları, sinirleri ve düz kas mezenkimal stroma 3 içinde bulunur. Bu çok katmanlı bir epitel stroma çevreleyen ve fetal androjen reseptör bağımlı parakrin sinyaller 4 ile prostata yol açmaktadır. Stromal androjen kimlik reseptör duyarlı prostat gelişiminde ve bu genlerin yanıt prostat duktal epitel formları tam olarak anlaşılmış değildir hangi mekanizma için gerekli olan genler. Yeteneği tam hücre tiplerinin tanımlanması ve bunların içindeki belirli faktörlerin ifade lokalize prostat gelişiminde daha fazla anlamak için şarttır. Situ hibridizasyon (ISH) bir doku içindeki mRNA&#39;ların lokalizasyonu için izin verir . Böylece, bu yöntem ve böylece potansiyel prostat gelişim düzenleyiciler nedenlerine açıklık, desen ve sinyal molekülleri ve bunların reseptörleri ifade zamanlaması tanımlamak için kullanılır. Burada, titreşimli mikrotom kesilmiş bölümler kullanarak fetal fare LUT mRNA desenleri tanımlamak için bir yüksek verim ISH tekniği açıklar. Bu yöntem diğer ISH protokolleri üzerinden birçok avantaj sunar. Bir slayt yapıştırılır ince bölümlerde ISH Sahne teknik olarak zor, hem cryosections ve parafin bölümleri genellikle zayıf sinyal çözünürlüğü neden cryosections sık sık kötü yapısal kalite var. Bütün montaj dokular üzerinde ISH Sahne prob yakalama neden olabilir. Buna karşın, yüksek kapasiteli tekniği ayrıntılı mimari dokusu ortaya kalın kesilmiş bölümler kullanır. Modifiye mikrofuge&#39;de tüpler ISH prosedürü sırasında bölümleri kolay kullanım sağlar. Ve böylece maliyet, maksimum verimlilik azaltarak, maksimum 4 mRNA transkript kadar tek bir çalışma tespit edilen 24 mRNA transkript ile tek bir 17.5dpc LUT gösterildi. Bu yöntem, birden fazla tedavi gruplarında böylece verileri yorumlamak için herhangi bir önyargı çıkarırken, aynı ve tek bir birim olarak işlenen sağlar. En pertinently prostat araştırmacılar için, bu yöntem, düşük ve yüksek bolluk mRNA transkript prostat duktal ağ sebebiyet veren fetal fare üretra mekansal ve zamansal bir konum sağlar.

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif<em&gt; In situ</em&gt; Fetal fare prostat doku bölümleri gelişmekte olan mRNA desenleri görselleştirmek için hibridizasyon (ISH) yöntemi. Bu yöntem diğer fare dokularda veya diğer türler dokularda mRNA ekspresyonu görselleştirmek için kolayca adapte olabilir.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Alt üriner sistemin (AÜS) gelişimi karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, prostatın fetal erkek... aşamasından itibaren oluşumu sırasında kanıtlanmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan fetal fare alt ürogenital kanal dokularındaki mRNA ekspresyon modellerini görselleştirmektir. Bu, öncelikle PCR ile oluşturulmuş bir kalıptan digoksin işaretli bir ribo prob sentezlenerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, titreşimli bir mikrotom kullanarak kalın kesitler oluşturmaktır.Üçüncü adım, özel sepetler içinde bulunan alt ürogenital sistem kesitlerinde in situ hibridizasyon gerçekleştirmektir. mRNA'lar, BM purple çöktürücü alkali fosfataz substratı kullanılarak, bağlanan ribo probların immünohistokimyasal tespiti yoluyla görselleştirilir. Sonuç olarak, mikroskopi ile fetal fare alt ürogenital sistemindeki düşük ve yüksek bolluktaki mRNA transkriptlerinin uzamsal ve zamansal lokalizasyonu gösterilebilir.Bu tekniğin immünohistokimya gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ribo problarının kolayca üretilebilmesi ve tüm fare genomundaki çoğu mRNA'yı tanıyacak şekilde hazırlanabilmesidir. Bu yöntem, fetal fare genital üriner gelişimi sırasındaki mRNA ekspresyon modellerine dair bilgi sağlasa da diğer organ sistemlerine, türlere ve gelişim evrelerine de uygulanabilir. Dokunun agar içine gömülmesi sürecinin öğrenilmesi zor ol

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Kalp gelişimini etkileyen genetik değişiklikler incelenirken Fetal ve perinatal ölüm ortak bir özelliktir. Yüksek frekanslı ultrason görüntüleme 2-D çözünürlüğü artmıştır ve erken kardiyak gelişimi mükemmel bilgi sağlayabilir ve önceden ölüm kalp yapısı ve fonksiyonu üzerine etkisini tespit etmek için ideal bir yöntemdir.

Mürin Fetal Ekokardiyografi

Ultra yüksek frekans ultrason küçük hayvanlarda kalp anormallikleri incelemek için güçlü bir canlı görüntüleme aracıdır. Bu girişimsel embriyoların fizyolojik durumunu korumak sağlar. Burada, rahimde embriyo E18.5 kalp oranlarını ölçmek için M-modu ultrason kullanımını gösterir.

Noninvaziv M-mod ekokardiyografi ile Fare Kalp Puan utero Ölçümünde

Fareler yaygın olarak Gestasyonel Biyoloji incelemek için kullanılır. Ancak, gebelik sonlandırma Boylamsal araştırmalar önler ve hayvanlar çok sayıda kullanımı gerektiren bu tür çalışmaları için gereklidir. Bu nedenle, yüksek frekanslı Ultrasonografi erken teşhis için non-invaziv tekniği ve hamile fare sonrası implantasyon olayları izleme açıklar.

Üç boyutlu yüksek frekanslı Ultrasonografi romanı kullanımı için fare erken gebelik karakterizasyonu

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Tekrarlanarak mRNA'ların içinde bireysel yumurtalar, tek molekül RNA Floresans in situ olarak sayıları saymak için hibridizasyon (RNA-balık) yapışık olmayan hücreler için optimize edildi. Yumurtalar toplanmıştır, transkript belirli probları ile melezleşmiştir ve bir görüntü miktar yazılımı kullanarak sayılabilir.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Erken fare embriyolarında mikroRNA'ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Öğrenin, fetal fare alt ürogenital yolunda mRNA ifade desenlerini yüksek verimli in situ hibridizasyon yöntemiyle görselleştirmeyi. Bu teknik, gelişimsel biyoloji araştırmalarında gen ekspresyonunu incelemek için uyarlanabilir.

Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi

Daha fazla video keşfet