Bir In Vitro Sistem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tümör dormansını veya metastatik büyümeye geçişi modellemek için kullanılan şu in vitro analiz aracılığıyla, potansiyel ajanların tümör hücresi dormansı ve/veya tümör dormansından çıkış üzerindeki etkisini gerçek zamanlı ve yüksek verimli bir şekilde gözlemlemektir. Bu, öncelikle dormant ve/veya metastatik tümör hücrelerinin, 96 kuyucuklu plaka platformuna uyarlanmış üç boyutlu bir kültür bazal membran ekstraktı veya BME sisteminde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. 3D sistemde kültüre edildiklerinde, metastatik hücreler geçici, dormant veya kuiesan bir evreye girerler.

Buna karşılık, in vivo ortamda dormant olan tümör hücreleri uzun süreli bir kuiesans durumuna girer. 3D kültür sisteminde, metastatik hücreler daha sonra, kuiesanstan proliferasyona geçişlerini önlemek amacıyla aday ajanlarla tedavi edilebilir. Öte yandan, dormant tümör hücreleri, kuiesanstan proliferasyona geçişlerini tetikleyebilecek aday ajanlarla tedavi edilebilir.

Tedavi sonucunda dormant ve metastatik hücrelerin proliferatif davranışı, analiz için istenen zaman noktalarında Cell Titer 96 Aqueous One Solution hücre proliferasyon analiz kiti eklenerek ve bir ELISA plaka okuyucu ile analiz edilerek puanlanacaktır. 3D sistemdeki hücre proliferasyon analizine dayanarak, tedavinin dormant veya metastatik tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, hangi faktörlerin ve hücresel mekanizmaların yayılmış tümör hücrelerini dormant durumda tuttuğu ve hangi faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tümör dormansından klinik metastaza geçişi tetiklediği gibi.

Proliferasyon analizi yapılmadan bir gün önce, büyüme faktörleri azaltılmış BME'yi dört derece santigrat derece sıcaklıktaki buzdolabında gece boyunca bekletin. Ardından analiz gününde, deney için ya uyuyan ya da metastatik bir tümör hücresi kültürü seçin. Sonrasında, bir 96 kuyucuklu plakayı laminer akışlı kabin içinde bir buz tepsisi üzerine yerleştirin.

Ardından, şırınga uçlu bir dispenser kullanarak plakanın her kuyucuğunu 50 µL çözülmüş buz soğuk BME ile kaplayın. Kuyucuklarda hava kabarcığı oluşmadığından emin olun ve BME ile kaplanmış 96 kuyucuklu plakayı %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. BME kaplı plaka inkübasyondayken, bir şişe tripsini ısınması için 37 °C sıcaklığa yerleştirin.

Tümör hücrelerindeki besiyerini aspire edin. Kültür plakalarını 10 milliliters PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve kültür plakalarına iki milliliters önceden ısıtılmış tripsin ekleyin.

Plakaları beş dakika inkübe edin. 15 mL'lik konik bir tüpe, %10 FCS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş beş mililitre yüksek glukozlu DMEM ekleyin. Bu süre zarfında.

İnkübasyonun ardından, ayrılmış hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri sayın. Ardından, kültüre alınacak toplam hücre sayısını bir doku kültürü santrifüjünde oda sıcaklığında 1500 G'de beş dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.

Çoğu durumda pelet görünür olmadığı için bir miktar besiyeri bırakın. Ardından, tek hücre süspansiyonu elde edildiğinden emin olmak için tüpün altına hafifçe vurun. Sonrasında, her 2 × 10³ hücre için 100 µL analiz besiyeri ile peleti yeniden süspanse edin.

Tek hücre süspansiyonunun korunduğundan emin olmak için hücreleri beş mililitrelik bir pipetle birçok kez tritüre edin. Kontrol Arka Plan değerleme plakası için 96 kuyucuklu BME kaplı plakadaki her kuyucuğa 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. 96 kuyucuklu BME kaplı plakanın yalnızca birkaç kuyucuğuna, kuyucuk başına ek olarak 100 µL analiz ortamı ekleyin. Ardından plakaları inkübe edin, eski ortamı aspire edin ve hücreleri her dört günde bir yeni analiz ortamı ile besleyin.

Hücre proliferasyonunu değerlendirmek için, istenen deneysel zaman noktasında analiz edilen her bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa, bir hücre proliferasyon analizi kitinden 20 µL cell titer 96 aqueous one solüsyonu ekleyin. Plakaları iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, immünofloresan hazırlığı kapsamında, bir ELISA plak okuyucu kullanarak hem deneysel hem de arka plan kuyucuklarının absorbansını 490 nm'de kaydedin.

Hücre sinyal moleküllerinin ve tümör hücrelerinin boyanması; boyamanın gerçekleştirileceği günden bir gün önce, BME'yi dört derece Celsius'luk buzdolabında gece boyunca çözdürün. Boyama gününde, sekiz odacıklı cam lam sistemini bir lamine akışlı kabin veya çeker ocak içindeki buz tepsisine yerleştirin. Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak cam lam sisteminin her bir kuyucuğunu 50 mikrolitre buz gibi soğuk BME ile kaplayın.

BME'nin eşit şekilde yayıldığından ve kuyucuklarda hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. Kaplanmış lamları 20 dakika boyunca inkübe edin. Uyuyan veya metastatik bir tümör hücre hattı seçin.

Hücreleri daha önce açıklandığı gibi tripsin kullanarak hasat edin. Ardından, kültüre edilecek toplam hücre sayısını 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Şimdi hücreleri santrifüjle çöktürün ve arkada bir miktar besiyeri bırakarak süpernatanı tekrar dikkatlice aspire edin.

Peleti tek hücre süspansiyonu elde etmek için 15 ml'lik konik tüpün altına hafifçe vurun. Her 5 × 10³ hücre için 400 µL assay medyumu kullanarak peleti yeniden süspande edin. Tek hücre süspansiyonunun korunduğundan emin olmak için hücreleri 5 ml'lik bir pipetle birkaç kez trite edin; BME kaplı sekiz bölmenin her bir kuyucuğuna 400 µL hücre solüsyonu ekleyin.

Ardından lam sistemini inkübe edin, eski medyumu aspire edin ve istenen deneysel zaman noktalarında her dört günde bir hücreleri yeni assay medyumu ile besleyin. Medyumun üst tabakasını aspire edin, tritton takviyeli 200 microliters fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra triton takviyeli fiksatifi aspire edin, sadece 200 microliters fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında ek 25 dakika daha inkübe edin.

Fiksatifi tekrar aspire edin ve ardından her bir kuyucuğa 400 µL PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve %0,05 Tween 20 içeren 400 µL PBS ekleyerek 10 dakika daha inkübe edin.

Yine oda sıcaklığında. Şimdi, fikse edilmiş hücreleri 200 microliters bloklama çözeltisi ile bloke edin. Ardından hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından bloklama çözeltisini aspire edin ve her birine bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 200 microliters primer antikor ekleyin.

Slaytlar, birincil antikor ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün antikor aspire edilir; ardından her seferinde 400 mikrolitre PBS eklenip 15 dakika beklendikten sonra solüsyon aspire edilerek kuyucuklar üç kez yıkanır. Son yıkamadan sonra PBS aspire edildikten sonra, rod domine red konjuge ikincil antikordan 200 mikrolitre eklenir.

Ardından, sekiz odacıklı lam sistemini alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları daha önce yapıldığı gibi üç kez PBS ile yıkayın; üçüncü yıkamadan sonra lamları dpi içeren beta shield montaj medyumu ile kapatın.

Son olarak lamları oda sıcaklığında, karanlıkta 40 dakika boyunca kurutun. 3D kültürdeki dormant D 2.0 R ve metastatik D two A one tümör hücrelerinin proliferasyon analizine bir örnek burada gösterilmiştir. D 2.0 R hücreleri, 14 günlük tüm deneysel kültür süresi boyunca dormant kalırken, yüksek derecede metastatik D two A one hücreleri kültürün yalnızca dört ila altı gününde dormant kalmakta ve ardından başlangıç dormant fazı sırasında prolifere olmaya başlamaktadır.

Dördüncü gün kültürünün temsili bir fotoğrafında burada gösterildiği gibi, birçok hücre 3D kültürde tekil kalırken, çoğalmayan diğer hücreler çok hücreli steroidler oluşturur. D two A one hücrelerinin 3D kültürde uyku durumundan proliferatif duruma geçişi, 12. gün kültürünün bu fotoğrafında gösterilmiştir. Bu şekildeki hücre morfolojisindeki belirgin değişikliklerle ilişkilidir.

D two A one hücrelerinin uyku halinden proliferatif duruma geçmesini engelleyen bir ajana örnek olarak, D two A one hücrelerinin miyozin hafif zincir kinazına karşı spesifik bir inhibitör ile uygulanmış tedaveleri gösterilmiştir. D two A one hücrelerini bu şekildeki figürde örneklendiği gibi uyku durumunda tutun. Uyku halinden (1. ile 4. günler arası) proliferasyona geçiş sırasında, kırmızı ile gösterilen D two A one hücrelerinde miyozin hafif zincir fosforilasyonunda belirgin bir artış ve bunu takiben yeşil ile gösterilen, aktin stres liflerini oluşturan F aktin filamentlerinin yeniden düzenlenmesi meydana gelir.

Yedinci gün. Bununla birlikte, D two A one hücrelerinde miyozin hafif zincir kinaz aktivitesinin SHRA veya ML seven ilacı ile bloke edilmesi, D two A one hücrelerini uyku durumunda tutar ve burada görüldüğü gibi miyozin hafif zincir fosforilasyonunun, F act ve stres lifi organizasyonunun inhibisyonu ile sonuçlanır. Bu videoyu izledikten sonra, tümör uykusunu ve metastatik büyümeye geçişi incelemek için in vitro model sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.