Name: Bir In Vitro Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Keşfedin 3D in vitro tümör dormansi ve metastatik büyüme geçişi modellemesi. Bu yüksek verimli sistem, ajanların hücre davranışları üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı analiz ederek kanser biyolojisi araştırmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü uyuyan ve metastatik tümör hücre hatları bakım <ol><li> Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) yüksek glukoz ve% 10 fetal sığır serumu (10 cm kültür plakaları uykuda (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) ve metastatik tümör hücrelerinin (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) büyütün FBS) ve antibiyotikler. Hücrelerin% 70-80 izdiham ulaştıklarında, aşağıdaki testleri geçin. </li></ol> 2. 3D BME sistemi atıl (latent) ve metastatik (prolifere) tümör hücreleri hücre proliferasyonu tayininde kültür 3D sistemi atıl / metastatik hücreler Kültürleme <ol><li> Tahlil yapılmadan önce, 4 çözülme Cultrex büyüme faktörü azaltılmış Bodrum Membran Extract (BME) ° C buzdolabında bir gece. BME her zaman buz üzerinde ele alınmalıdır. </li><li> Ertesi gün, 96 plaka laminar kaput içinde buz bir tepsi yerleştirin. Buz BME bir şırınga ile bir dağıtıcı kullanarak 50-100μl Coat her yanı. Kuyularda kabarcıklar oluşur emin olun. 30 dakika boyunca 37% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör BME ile kaplı 96 plaka ° C yerleştirin. </li><li> Bu arada uyuyan veya metastatik tümör hücrelerinin (Bölüm 1 hazırlanan) medya aspirat. Kültür plakaları, 10 ml fosfat tuzlu su, ph 7.4 (PBS) tamponlu ile durulayın. PBS ve eklemek 2ml tripsin 37 ° önceden ısıtılmış ° C, kültür plakaları aspire. 37 2 nemlendirilmiş bir% 5 CO plakaları ° C'de, 5 dk. </li><li> 5ml% 10 FCS ve antibiyotikler ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz içeren 15 ml konik tüp hücreleri transferi ve hücreleri saymak. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 1500g bir hızda bir doku kültür santrifüj kültüre toplam hücre sayısı aşağı spin. Analizlerde incelenmek üzere, her bir hücre hattı ya da zaman noktası / 2x10 3 hücre hazırlamak. Ancak, bu kullanılan hücre hatları bağlı olarak değişebilir. </li><li> Süpernatantı dikkatlice aspire. Not Çoğu durumda, pelet görünmez. Bu nedenle, bazı medya geride bırakın. Bir tek hücre süspansiyonu elde olduğundan emin olmak için parmaklarınızı konik tüp 15ml alt dokunun. DMEM ile desteklenmiş antibiyotikler ile düşük glukoz ile pelet yeniden askıya% 2 FCS +% 2 BME (testi medya). 100 test medya ul her 2x10 3 hücreler için ilave edilmelidir. 5ml pipet yardımıyla tek bir hücre süspansiyonu muhafaza edilmesini sağlamak için hücrelerin birçok kez Karışım. </li><li> Plaka hücre karışımı 100μl başına 96 BME kaplı plaka üstüne. Arka plan değerlendirme (bölüm 2.8) ek 100μl plaka başına 96 iyi BME kaplı plaka üstüne sadece tahlil medya için. 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör kültürlü 96 kuyucuğu inkübe ° C. Hücreler test medya ile her 4 günde bir yeniden beslenen olmalıdır. </li></ol> Silahların Yayılmasını Önleme tahlil: <ol start="8"><li> Hücrelerin çoğalması tahlil: istenilen zamanda kuyuların eklemek Hücre titresi 96 sulu Bir Çözüm Hücre Çoğalması tahlil kiti 20 ul işaret ediyor. 2s için nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör 37 ° C'de inkübe edin. 490nm bir Elisa Plaka Okuyucu kayıt absorbans kullanma. Hücre titresi 96 sulu Bir Çözüm Hücre Çoğalması tahlil kiti, BME ile kuyu öncesi kaplamalı arka plan değerlendirme ve çıkarma için 20μl ekleyin ve sadece tahlil medya ile kaplamış. Elisa Plaka Okuyucu kayıt absorbans 490 nm dalga boyunda kullanılması. </li></ol> 3. Ve / veya metastatik (prolifere) uykuda (latent) tümör hücrelerinin tümör hücrelerinin hücre sinyal molekülleri Immunofluorescent boyama Immunfluorescence boyama 3D sistemi kültür uykuda / metastatik hücreler * Aşağıdaki protokol Debnath J ve ark 18 tarafından yayınlanan bir 3D kültür protokolü bir değişiklik. <ol><li> BME bölüm 2.1 'de açıklandığı gibi hazırlayın. Ertesi gün: 8 oda cam slayt sistemi laminar kaput içinde buz bir tepsi. 200μl Pipetman kullanarak buz soğuk BME 50ul Coat her yanı. BME yayılır ve kuyulardan kabarcıklar oluşur emin olun. 20 dakika süreyle 37 2 nemlendirilmiş bir% 5 CO BME ile kaplı 8 odasının cam slayt ° C yerleştirin. </li><li> Bölüm 1 ve bölüm 2.3-2.4 açıklandığı gibi kültür hazırlamak Hasat uykuda veya metastatik hücreler. 15 ml konik bir tüp içinde kültür hücrelerinin toplam sayısı toplayın. Biz, incelenmek üzere her hücre dizisi ve zaman noktası için / 5 x10 3 hücreleri hazırlarlar . 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, hücrelerin doku kültürü santrifüj 1500g bir hızda dönerler. Supernate dikkatlice aspire. Not pelet görünmez olduğunu, bu nedenle bazı medya geride bırakmak. Tek bir hücre süspansiyonu elde olduğundan emin olmak için parmaklarınızı konik tüp 15ml alt dokunun.Tahlil medya pelet yeniden askıya aldı. Test medya 400μl her 5x10 3 hücreler için ilave edilmelidir. 5ml pipet ile hücreleri birçok kez Karışım. Bu adım, tek hücre süspansiyonu muhafaza edilmesini sağlamak için çok önemlidir. </li><li> BME ile kaplı 8 odaların her birinin üstüne başına iyi hücre karışımı Plaka 400μl. 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör kültürlü 8 odaları cam slayt sistemi inkübe ° C. Hücreler test medya ile her 4 günde bir yeniden beslenen olmalıdır. </li></ol> Immünofloresan boyaması: <ol start="4"><li> İstenilen zaman noktalarında, medyanın üst tabakası aspire ve% 4 Paraformaldehit (PFA),% 5 sakkaroz ve% 0.1 Triton X-100 içeren fiksatif 200μl ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Fiksatif aspire ve oda sıcaklığında 25 dakika süreyle% 5 sakkaroz ve inkübe içeren% 4 PFA 200μl ekleyin. </li><li> Fiksatif aspire fosfat eklemek 400 ul her kuyuya tamponlu salin (PBS). Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBS aspire ve 400 μ PBS oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 0.05 Tween 20 içeren ekleyin. </li><li> % 10 eşek serum ya 200μl ile veya oda sıcaklığında 1 saat için% 3 (kullanılmak üzere bir çözüm, her bir birincil antikor için ampirik olarak tespit edilmelidir engelleme) BSA ile sabit hücreler engelleyin. </li><li> Engelleme çözüm aspire ve primer antikor 200μl (seyreltme için ampirik olarak kullanılmak üzere her birincil antikor tespit edilmelidir). % 10 eşek serum engellemek için ise% 10 eşek serum primer antikor seyreltilir ya da% 3 BSA engelleme çözümü ise% 3 BSA primer antikor sulandırmak. 4 gece primer antikor ile inkübe ° C. </li><li> Antikor aspire 400μl PBS ile 15 dakika boyunca kuyulardan yıkayın ve iki kez tekrarlayın. PBS aspire ve rodamin kırmızı (seyreltme ampirik olarak tespit edilmelidir) anti-ilgili-IgG konjuge eşek 200μl eklemek için alüminyum folyo ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe 8 odasına slayt kapsayacak. </li><li> 400μl PBS (Her yıkamadan 3x15 dakika) kuyular yıkayın. Aspire PBS. VECTASHIELD DAPI orta montaj monte edilmiştir. Karanlık oda sıcaklığında 40 dakika Kuru slaytlar. Slaytlar 4 ° C'de 1 hafta süreyle saklanabilir Slaytlar karanlıkta saklayın. Resim mikroskopisi slaytlar. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1A 3D kültür uykuda D2.0R ve metastatik D2A1 tümör hücrelerinin çoğalması analiz bir örnek gösterilmiştir. Ise yüksek metastatik D2A1 hücreleri sadece 4-6 gün sonra hızla artmaya başlar uykuda kalır D2.0R hücreler, tüm deneysel, 14 günlük kültürü dönem boyunca (latent) uykuda. Prolifere olmayan diğer hücreleri çok hücresel parçacıklarının formu ise; uykuda ilk aşamasında, birçok hücre (Günde 4 Şekil 1B) 3-GE kültürü yalnız kalır. 3-GE kültürü proliferatif devletin atıl D2A1 hücreleri (Şekil 1B, 12 gün) geçiş hücre morfolojisi dramatik değişiklikler ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu testte ne faktörü test etmek için kullanılır / s onların uykuda devlet ortaya atıl D2.0R hücreleri tetikleyebilir ve ne faktörü / s, hareketsiz duruma geçiş D2A1 hücreleri engelleyebilir. Şekil 2, bir ajanın bir örnektir uyuyan bir proliferatif devlet geçiş D2A1 hücreleri engeller. Şekil 2'de gösterildiği gibi, miyozin hafif zincir kinaz (ML-7) belirli bir inhibitörü ile D2A1 hücre tedavileri, atıl bir durumda D2A1 hücreleri sürdürdü . 3D sistemi kültür uyuyan ve prolifere olan tümör hücrelerinin sinyal Hücre hücre sinyal molekülleri için immünofloresan boyama ile incelenebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, aktin stres lifler (yeşil boyama) oluşturan f-aktin filamentler reorganizasyonu ile takip D2A1 hücreleri (kırmızı boyama) miyozin hafif zincir fosforilasyon önemli bir artış dormancy den geçiş (1-4 gün) sırasında oluşur. proliferasyon (7 gün). Ancak, shRNA ya da belirli bir ilaç (ML-7) D2A1 hücre miyozin hafif zincir kinaz aktivitesini bloke D2A1 atıl bir durumda hücreler ve miyozin hafif zincir fosforilasyon ve f-aktin stres fiber organizasyonu (Şekil 4) inhibisyonu sonuçları korur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 soliter tümör hücre dinlenmesi ve metastatik büyümeye geçiş çalışma in vitro model. A) 3-D Cultrex BME uykuda D2.0R ve metastatik D2A1 Silahların Yayılmasının Önlenmesi, n = 8 (ortalama ± SE). Üç deneyleri (* p ≤ 0.05) Temsilcisi sonuçlar. B) D2.0R ve D2A1 hücreleri Işık mikroskobu görüntüleri, 3-D Cultrex BME büyütme x20 kültüre .Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Dormansi (sessizliğini) D2A1 hücrelerin çoğalma miyozin hafif zincir kinaz (MLCK) inhibisyonu 3D kültür sistemi geçiş önlenmesi. 3-D Cultrex BME n kültür D2A1 hücre proliferasyonu ders = 8 (ortalama ± SE). Hücreler (kontrol) tedavi edilmemiş ya da belirli bir MLCK inhibitörü (ML-7, 5 mcM) ile tedavi edilen kültür 5 gün 48 saat başında. Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. F-aktin yeniden yapılanma ile miyozin hafif zincir fosforilasyon dormancy den D2A1 hücrelerin proliferatif büyüme geçiş sırasında izledi. 8 oda cam slayt D2A1 hücreleri 3-D Cultrex BME kültüre edildi. Hücreleri sabit ve nükleer lokalizasyonu için DAPI (mavi), f-aktin Phalloidin (yeşil) ve çeşitli zaman noktalarında belirtildiği miyozin hafif zinciri (MLC-p) (kırmızı), fosforile formu karşı bir antikor ile boyandı. F-aktin ve MLC-p boyama (sarı) Birleştirme. MLC-p İfade dormansi (gün1 4) D2A1 hücreleri aktin stres lif oluşumu (oklar) takip proliferatif büyüme (7 gün) geçiş sırasında arttı. Mikroskopisi, büyütme X63. Beyaz çubuğu, 20 mikron eşittir. Şekil 17 Barkan et al değiştirilmiş. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Kültür günde 48 saat başında, miyozin hafif zincir kinaz (MLCK) D2A1 hücreler aracılı f-aktin stres lif oluşumunu inhibisyonu D2A1 Hücreler (kontrol) tedavi edilmemiş, ya da MLCK (5 mcM ML-7) için inhibitörleri ile tedavi edilen 5 ya da şifreli veya MLCK shRNA ile tedavi ve miyozin hafif zinciri (MLC-p) (kırmızı), f-aktin (yeşil) ve çekirdekleri (mavi) fosforile formu için boyanmış. F-aktin ve MLC-p boyama (sarı) Birleştirme. Mikroskopisi, büyütme X63. Beyaz çubuğu, 20 mikron eşittir.

<ol><li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models%2C+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li>
<li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Regul+Homeost+Agents%22%5BJournal%5D)">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li>
<li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site%3A+a+possible+contributor+to+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li>
<li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormancy+of+solitary+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li>
<li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li>
<li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+dormancy%3A+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li>
<li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li>
<li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+tumor+dormancy%3A+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li>
<li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li>
<li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li>
<li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tümör hücrelerinin metastatik büyümeye geçiş sönmüş bir devlet ya da sonucu dissemine korumak altında yatan mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir kalır. Bu fenomen, insan hasta 4,12 ve birkaç preklinik modellerde bu sorunu çözmek için geliştirilmiştir çalışma için son derece zor olmuştur . Bununla birlikte, in vivo ve ex-vivo tümör dormansi için model sistemler (1,12 gözden) karakterize edilmiştir. Ancak, tümör dormansi in vivo modellerde öncelikle tümör dormansi düz...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> DMEM yüksek glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM düşük glikoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Büyüme faktörü azaltılmış 3-D Cultrex Bodrum Membran Özü </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> 14-15mg/ml arasında protein konsantrasyonu </td></tr><tr><td> D2.0R ve D2A1 hücre hatları </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 ve K7M2AS1.46 hücre </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bir 8 odasının cam slayt sistemi </td><td> (Lab-TEK, Thermo bilimsel) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre titresi 96 sulu Tek Çözüm hücre proliferasyonu tahlil kiti </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD DAPI ile orta montaj </td><td> Vektör Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normal eşek serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Elisa Levha Reader </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> Kayıt 490nm </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss-EKK-510 </td><td></td><td> Büyütme X63 </td></tr></tbody></table>

bir in vitro</emmetastatik büyüme tümör dormansi ve switch eğitim> sistem

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Meme kanseri nüks genellikle kanserin hiçbir belirti bulunduğu uzun bir latent dönem takip ve metastaz primer tümörün çıkarılması ve adjuvan tedavi sonrası uzun yıllar kadar, klinik olarak belirgin hale olmayabilir. Bu olgunun olası bir açıklama, tümör hücrelerinin metastatik siteleri numaralı seribaşı geleneksel tedavilere dirençli ve 1-4 kez uzun süre atıl kalması olduğunu . Ikincil sitelerde, uykuda kanser hücrelerinin varlığı, ne prolifere ne apoptozis 5-7 geçmesi latent tek kişilik hücrelerinde daha önce açıklandığı gibi olmuştur . Dahası, bu tek kişilik hücrelerinde erken bir aşamada hastalığın ilerlemesi 8-10 primer tümörün yaygınlaştırılması ve hastaların kemik iliği, kan ve lenf düğümleri 1,4,11 büyüme tutuklandı ikamet gösterilmiştir. Bu nedenle, proliferatif bir devlet ya da geçiş dormansi düzenleyen mekanizmaların anlaşılması, hastalığın tekrarını önlemek için yeni hedefler ve müdahaleler keşfetmek için kritik öneme sahiptir. Ancak, mevcut model sistemler eksikliği, metastatik büyüme tümör dormancy den anahtarı düzenleyen mekanizmalar çözülüyor engel olmuştur. in vivo ve ex vivo tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesini çalışma model sistemler daha önce 1,12-14 tarif edilmiştir. Ancak bu model sistemler, gerçek zamanlı ve yüksek kapasiteli metastatik hastalık olarak prolifere yalnız uyuyan tümör hücrelerinin ortaya çıkması ne tetikler bir şekilde mekanistik anlayışlar var. Yakın zamanda (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) ya da uyuyan (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) veya proliferatif metastatik davranış sergileyen hücreler in vivo büyüme özellikleri modeli in vitro sistemde 3D ​​geliştirdik in vivo olarak. 3-boyutlu (3D) bazal membran ekstraktı (BME) kültüre, metastatik bir yerinde in vivo dormansi sergi tümör hücrelerinin in vivo metastatik hücreler son derece değişken sonra kolayca 3D kültür prolifere ise, latent kalır, ama nispeten daha kısa olduğunu göstermiştir sükunet, dönemleri. Daha da önemlisi, in vitro model sistem 3D kullanılarak biz ilk defa ECM kompozisyon uykuda tümör hücrelerinin proliferatif durumuna geçer ve in vivo çalışmalar 15-17 doğruladı olmadığını düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu nedenle, bu raporda açıklanan model sistem model tümör dormansi in vitro yöntem sağlar ve mikroçevresinin kaynaklanan proliferatif büyüme geçiş çalışma.

In vitro sistemi değiştirilmiş 3-D sulandırılmış bazal membran birçok tümör hücre hatlarının büyüme özellikleri tümör hücrelerinin metastatik ikincil site uykuda veya proliferatif davranışı ile ilişkili olduğu<em&gt; In vivo</em&gt;.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Meme kanserinin nüksü, genellikle kanser belirtilerinin görülmediği uzun bir latent dönemi takip eder ve metastazlar klinik olarak belirgin hale gelmeyebilir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tümör dormansını veya metastatik büyümeye geçişi modellemek için kullanılan şu in vitro analiz aracılığıyla, potansiyel ajanların tümör hücresi dormansı ve/veya tümör dormansından çıkış üzerindeki etkisini gerçek zamanlı ve yüksek verimli bir şekilde gözlemlemektir. Bu, öncelikle dormant ve/veya metastatik tümör hücrelerinin, 96 kuyucuklu plaka platformuna uyarlanmış üç boyutlu bir kültür bazal membran ekstraktı veya BME sisteminde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. 3D sistemde kültüre edildiklerinde, metastatik hücreler geçici, dormant veya kuiesan bir evreye girerler.Buna karşılık, in vivo ortamda dormant olan tümör hücreleri uzun süreli bir kuiesans durumuna girer. 3D kültür sisteminde, metastatik hücreler daha sonra, kuiesanstan proliferasyona geçişlerini önlemek amacıyla aday ajanlarla tedavi edilebilir. Öte yandan, dormant tümör hücreleri, kuiesanstan proliferasyona geçişlerini tetikleyebilecek aday ajanlarla tedavi edilebilir.Tedavi sonucunda dormant ve metastatik hücrelerin proliferatif davranışı, analiz için istenen zaman noktalarında Cell Titer 96 Aqueous One Solution hücre proliferasyon analiz kiti eklenerek ve bir ELISA plaka okuyucu ile analiz edilerek puanlanacaktır. 3D sistemdeki hücre proliferasyon analizine dayanarak, tedavinin dormant veya metastatik tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, hangi faktörlerin ve hücresel mekanizmaların yayılmış tümör hücrelerini dormant durumda tuttuğu ve hangi faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tümör dormansından klinik metastaza geçişi tetiklediği gibi.Proliferasyon analizi yapılmadan bir gün önce, büyüme faktörleri azaltılmış BME'yi dört derece santigrat derece sıcaklıktaki buzdolabında gece boyunca bekletin. Ardından analiz gününde, deney için ya uyuyan ya da metastatik bir tümör hücresi kültürü seçin. Sonrasında, bir 96 kuyucuklu plakayı laminer akışlı kabin içinde bir buz tepsisi üzerine yerleştirin.Ardından, şırınga uçlu bir dispenser kullanarak plakanın her kuyucuğunu 50 µL çözülmüş buz soğuk BME ile kaplayın. Kuyucuklarda hava kabarcığı oluşmadığından emin olun ve BME ile kaplanmış 96 kuyucuklu plakayı %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin. BME kaplı plaka inkübasyondayken, bir şişe tripsini ısınması için 37 °C sıcaklığa yerleştirin.Tümör hücrelerindeki besiyerini aspire edin. Kültür plakalarını 10 milliliters PBS ile durulayın. Ardından PBS'yi aspire edin ve kültür plakalarına iki milliliters önceden ısıtılmış tripsin ekleyin.Plakaları beş dakika inkübe edin. 15 mL'lik konik bir tüpe, %10 FCS ve antibiyotiklerle takviye edilmiş beş mililitre yüksek glukozlu DMEM ekleyin. Bu süre zarfında.İnkübasyonun ardından, ayrılmış hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri sayın. Ardından, kültüre alınacak toplam hücre sayısını bir doku kültürü santrifüjünde oda sıcaklığında 1500 G'de beş dakika boyunca çöktürün. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.Çoğu durumda pelet görünür olmadığı için bir miktar besiyeri bırakın. Ardından, tek hücre süspansiyonu elde edildiğinden emin olmak için tüpün altına hafifçe vurun. Sonrasında, her 2 × 10³ hücre için 100 µL analiz besiyeri ile peleti yeniden süspanse edin.Tek hücre süspansiyonunun korunduğundan emin olmak için hücreleri beş mililitrelik bir pipetle birçok kez tritüre edin. Kontrol Arka Plan değerleme plakası için 96 kuyucuklu BME kaplı plakadaki her kuyucuğa 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. 96 kuyucuklu BME kaplı plakanın yalnızca birkaç kuyucuğuna, kuyucuk başına ek olarak 100 µL analiz ortamı ekleyin. Ardından plakaları inkübe edin, eski ortamı aspire edin ve hücreleri her dört günde bir yeni analiz ortamı ile besleyin.Hücre proliferasyonunu değerlendirmek için, istenen deneysel zaman noktasında analiz edilen her bir 96 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa, bir hücre proliferasyon analizi kitinden 20 µL cell titer 96 aqueous one solüsyonu ekleyin. Plakaları iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, immünofloresan hazırlığı kapsamında, bir ELISA plak okuyucu kullanarak hem deneysel hem de arka plan kuyucuklarının absorbansını 490 nm'de kaydedin.Hücre sinyal moleküllerinin ve tümör hücrelerinin boyanması; boyamanın gerçekleştirileceği günden bir gün önce, BME'yi dört derece Celsius'luk buzdolabında gece boyunca çözdürün. Boyama gününde, sekiz odacıklı cam lam sistemini bir lamine akışlı kabin veya çeker ocak içindeki buz tepsisine yerleştirin. Ardından, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak cam lam sisteminin her bir kuyucuğunu 50 mikrolitre buz gibi soğuk BME ile kaplayın.BME'nin eşit şekilde yayıldığından ve kuyucuklarda hava kabarcığı oluşmadığından emin olun. Kaplanmış lamları 20 dakika boyunca inkübe edin. Uyuyan veya metastatik bir tümör hücre hattı seçin.Hücreleri daha önce açıklandığı gibi tripsin kullanarak hasat edin. Ardından, kültüre edilecek toplam hücre sayısını 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Şimdi hücreleri santrifüjle çöktürün ve arkada bir miktar besiyeri bırakarak süpernatanı tekrar dikkatlice aspire edin.Peleti tek hücre süspansiyonu elde etmek için 15 ml'lik konik tüpün altına hafifçe vurun. Her 5 × 10³ hücre için 400 µL assay medyumu kullanarak peleti yeniden süspande edin. Tek hücre süspansiyonunun korunduğundan emin olmak için hücreleri 5 ml'lik bir pipetle birkaç kez trite edin; BME kaplı sekiz bölmenin her bir kuyucuğuna 400 µL hücre solüsyonu ekleyin.Ardından lam sistemini inkübe edin, eski medyumu aspire edin ve istenen deneysel zaman noktalarında her dört günde bir hücreleri yeni assay medyumu ile besleyin. Medyumun üst tabakasını aspire edin, tritton takviyeli 200 microliters fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra triton takviyeli fiksatifi aspire edin, sadece 200 microliters fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında ek 25 dakika daha inkübe edin.Fiksatifi tekrar aspire edin ve ardından her bir kuyucuğa 400 µL PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve %0,05 Tween 20 içeren 400 µL PBS ekleyerek 10 dakika daha inkübe edin.Yine oda sıcaklığında. Şimdi, fikse edilmiş hücreleri 200 microliters bloklama çözeltisi ile bloke edin. Ardından hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından bloklama çözeltisini aspire edin ve her birine bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 200 microliters primer antikor ekleyin.Slaytlar, birincil antikor ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün antikor aspire edilir; ardından her seferinde 400 mikrolitre PBS eklenip 15 dakika beklendikten sonra solüsyon aspire edilerek kuyucuklar üç kez yıkanır. Son yıkamadan sonra PBS aspire edildikten sonra, rod domine red konjuge ikincil antikordan 200 mikrolitre eklenir.Ardından, sekiz odacıklı lam sistemini alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları daha önce yapıldığı gibi üç kez PBS ile yıkayın; üçüncü yıkamadan sonra lamları dpi içeren beta shield montaj medyumu ile kapatın.Son olarak lamları oda sıcaklığında, karanlıkta 40 dakika boyunca kurutun. 3D kültürdeki dormant D 2.0 R ve metastatik D two A one tümör hücrelerinin proliferasyon analizine bir örnek burada gösterilmiştir. D 2.0 R hücreleri, 14 günlük tüm deneysel kültür süresi boyunca dormant kalırken, yüksek derecede metastatik D two A one hücreleri kültürün yalnızca dört ila altı gününde dormant kalmakta ve ardından başlangıç dormant fazı sırasında prolifere olmaya başlamaktadır.Dördüncü gün kültürünün temsili bir fotoğrafında burada gösterildiği gibi, birçok hücre 3D kültürde tekil kalırken, çoğalmayan diğer hücreler çok hücreli steroidler oluşturur. D two A one hücrelerinin 3D kültürde uyku durumundan proliferatif duruma geçişi, 12. gün kültürünün bu fotoğrafında gösterilmiştir. Bu şekildeki hücre morfolojisindeki belirgin değişikliklerle ilişkilidir.D two A one hücrelerinin uyku halinden proliferatif duruma geçmesini engelleyen bir ajana örnek olarak, D two A one hücrelerinin miyozin hafif zincir kinazına karşı spesifik bir inhibitör ile uygulanmış tedaveleri gösterilmiştir. D two A one hücrelerini bu şekildeki figürde örneklendiği gibi uyku durumunda tutun. Uyku halinden (1. ile 4. günler arası) proliferasyona geçiş sırasında, kırmızı ile gösterilen D two A one hücrelerinde miyozin hafif zincir fosforilasyonunda belirgin bir artış ve bunu takiben yeşil ile gösterilen, aktin stres liflerini oluşturan F aktin filamentlerinin yeniden düzenlenmesi meydana gelir.Yedinci gün. Bununla birlikte, D two A one hücrelerinde miyozin hafif zincir kinaz aktivitesinin SHRA veya ML seven ilacı ile bloke edilmesi, D two A one hücrelerini uyku durumunda tutar ve burada görüldüğü gibi miyozin hafif zincir fosforilasyonunun, F act ve stres lifi organizasyonunun inhibisyonu ile sonuçlanır. Bu videoyu izledikten sonra, tümör uykusunu ve metastatik büyümeye geçişi incelemek için in vitro model sisteminin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

an-vitro-system-to-study-tumor-dormancy-switch-to-metastatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Tümör başlatıcı hücreler (TIC'ler), oldukça tekrarlayan ve ölümcül bir hastalık olan yumurtalık kanserinin tedavisi için uygun bir terapötik hedef olabilir. Bu yüksek derecede tümörjenik hücre popülasyonu için zenginleştiren kültür koşulları için bir protokol sunuyoruz.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Östrojene duyarlı meme kanseri hücreleri için kemik iliğinde in vitro bir uyku hali modeli geliştirdik. Bu protokolün amacı, uyku halinin moleküler ve hücresel biyolojisinin incelenmesi ve daha sonraki in vivo testler için hipotezlerin üretilmesi için modelin kullanımını göstermektir.

Bir<em&gt; In Vitro</em&gt; Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Keşfedin 3D in vitro tümör dormansi ve metastatik büyüme geçişi modellemesi. Bu yüksek verimli sistem, ajanların hücre davranışları üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı analiz ederek kanser biyolojisi araştırmalarına olanak tanır.

Bir In Vitro Sistem

Daha fazla video keşfet