Name: Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli'de fungal endoglukanaz aktivitesini yüksek verimli taramak için görsel okumalı, düşük yanlış pozitifli ve ölçeklenebilir bir yöntem. Bu teknik, enzim kütüphanelerinin hızlı değerlendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından ve UNCF / Merck Bilim Girişimi tarafından finanse edildi.

1. Tarama plaka hazırlığı <ol><li> , 25g LB besi, 15g Agar ve 1L distile su 1.5g karboksimetil selüloz (CMC) substrat ve sterilize etmek için otoklav ekleyin. </li><li> Otoklav sonra, uygun antibiyotik serin ve orta, izin ve nihai konsantrasyonu 100μM IPTG. </li><li> Her orta 200ml 5 büyük kare petri kaplarına / biyoassay tepsiler (240 x 240 x 20mm veya daha büyük) içine dökün. Plakaları tamamen kurumasına izin verin. </li></ol> 2. Endoglucanase kütüphane oluşturma ve ekran <ol><li> Endoglucanase katalitik domain (ler) in bir kütüphane oluşturun. Bu birçok şekilde yapılabilir (örneğin, site yönettiği ya da rastgele mutagenez, rekombinasyon, vb) ve araştırmacı tarafından belirlenir. </li><li> Lak operatörü ile T7 promotör kontrolü altında olduğunu bir vektör içine kütüphane Clone ve periplasm hedefleyen bir pelB sinyal dizisi içerir. Uygun bir vektör Novagen gelen pET22b (+) bir örneği. </li><li> E. endoglucanase kitaplığı Dönüşümü coli BL21 (de3) tek koloniler için tabak ve süzün. </li><li> Gecede dönüşüm inkübe 37 ° ° C. </li><li> Steril kürdan kullanarak, uygun antibiyotik ile desteklenmiş 400μL LB orta içeren 96 derin kuyu plakaları klonlar aşılamak. 37 ° ° C'de 250 rpm'de sallayarak ile geceleme. </li><li> % 10 -80 uzun vadeli depolama için nihai konsantrasyonu ° C de bir gecede 96 kültürleri steril gliserol ekle Bu ana plaka olacak. </li><li> 96-pin damgası kullanarak, IPTG ve CMC içeren tarama plakalar üzerine plaka gecede kültürler çoğaltmak. Her tarama tabağa gecede kültürlerin 5 set damgalı olabilir. </li><li> Böylece her 96 plaka kimlik ve yönlendirme bilinen tarama plakaları etiketleyin. </li><li> Oda sıcaklığında (17-25 ° C) gece veya görünür koloniler kadar damgalı kütüphaneleri inkübe edin. </li><li> Plaka kolonilerinin tüm izleri silinene kadar saf su ile durulayın. </li><li> Yıkanmış plaka üzerine; dökün Kongo Kırmızı (su içinde% 0.5 CR). Plaka karşılamak için yeterli CR eklemek için emin olun. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. CR inkübasyon için 15 dakika aşmayın. Uzun inkübasyon süreleri, daha az belirgin haleler neden olacaktır. </li><li> CR dökün ve 1M NaCl (fazlasıyla yeterli plaka kapsayacak şekilde) bol miktarda ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> CMC bozulması haleler ortaya NaCl kapalı dökün. Haleler daha iyi çözünürlük için, NaCl veya birden fazla NaCl yıkar uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. </li><li> Steril bir kürdan kullanarak, daha fazla karakterizasyonu için ana plaka aktif enzimleri klonlar seçin. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Bu yüksek kapasiteli ekran için okuma bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Klonlar bozulması bölgelerinin boyutuna göre inaktif, zayıf olarak aktif ve son derece aktif olarak tespit edilebilir. Kütüphane referans olarak bilinen bir enzim aktivitesi ise özellikle yararlıdır. Burada görüldüğü gibi, aktif enzimleri kimlik sağlam ve tekrarlanabilir. Ancak, tarama plakaların yeterli etiketleme son derece önemli olduğunun farkında olun. Araştırmacı, -80 ° C daha fazla karakterizasyonu için saklanan ana plaka almak için, uzak koloniler yıkandıktan sonra aktif türevlerini tespit etmek gerekir. Sonuç olarak, a priori yapay vs doğal yüzeylerde faaliyetler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için zordur. Bu nedenle, araştırmacı, endüstriyel ilgili malzeme protein spor belirlemek için tüm olumlu klonlar test etmelidir. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1 tarama yöntemi şematik anahat. Hücreler endoglucanase bir kütüphane ile değiştirdi ve tek koloniler için seçici kaplama. Klonlar (1) depolama -80 ° C ve (2) endoglucanase ifade ikna etmek için CMC ve IPTG içeren plakalar üzerinde çoğaltma kaplama için 96 derin kuyu levhalar gecede aldı ve büyüdü. Aktif klonlar -80 ° C'de saklanan ana plakadan aldı. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2 E. mantar katalitik etki Klonlama ve ifade coli. (A) Endoglucanase ifade vektör. Genler T7 organizatörü kontrol altında pET22b (+) (Novagen) klonlanmış. (B) Sağ panel: endoglucanase ifade BL21 (de3) koloniler. Sol panel: Kongo Kırmızı ile yıkama ve geliştirme sonra CMC bozulması haleler. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="Şekil 3"> Şekil 3 CMC / Kongo Red ekranından örnek sonuçları. Resimler, yıkama ve Kongo Kırmızı geliştirme sonra tarama plakaların alınır. S tüm kolonilericreening plakaları benzer büyüklükte.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan protokol minimal manipülasyon, aktif enzimler hızlı ve yüksek verimlilik kimlik sağlar. Hareketi algılama oldukça duyarlıdır ve niteliksel olarak hücre içinde aktivite miktarını yansıtır. Kullanım kolaylığı, sadece E. fonksiyonel ifadesi ile sınırlı, geniş bir enzim kütüphaneler için bu yöntemi uygun hale getirir coli. Ayrıca, bu tür aktivite tarama mantar sellülazlar sınırlı değildir, ancak herhangi bir endoglucanase faaliyet için adapte edilebilir, veya herhangi bir selüloz aktivite ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Ürün numarası </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Kongo Red </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Karboksimetil Selüloz </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Biyoassay plakalar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

mantar endoglucanase faaliyet yüksek verimli tarama escherichia coli</em

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Selülaz enzimleri (endoglucanases, cellobiohydrolases ve β-glukozidaz) da yakıt alkoller 1 dönüştürülebilir bileşeni şekerlerin içine hidroliz selüloz. Selülozik biyokütle yenilenebilir enerji sağlamak için enzimatik hidroliz potansiyeli, ekonomik yakıt üretimi 2 için sellülazlar mühendisi çabaları yoğunlaşmıştır . Özellikle ilgi çekici olan, gıda ve tekstil işleme endüstride kullanılan mantar sellülazlar 3-8, . Mutant sellülazlar bir kütüphane arasında aktif varyantları belirlenmesi mühendislik süreci için kritik; aktif mutantlar, daha gelişmiş özellikler ve / için test veya ek mutagenez maruz olabilir. Etkin mühendislik mantar sellülazlar yerli organizmalar için genetik araçları eksikliği ve enzimler heterolog hosts ifade zorluklar engel olmuştur. Son zamanlarda, Morikawa ve arkadaşları E. ifade etmek için bir yöntem geliştirdi coli H. jecorina 3,9, büyük miktarlarda sellülazlar salgılaması için kapasitesi ile önemli bir sanayi mantar endoglucanases katalitik etki. Fonksiyonel E. coli ifade Macrophomina phaseolina 10 ve Phanerochaete chrysosporium 11-12 dahil olmak üzere diğer mantar, sellülazlar için de rapor edilmiştir. Biz E. mantar endoglucanase aktivitesi yüksek kapasiteli tarama için bir yöntem mevcut coli. (Şekil 1) Bu yöntem katı ortamda büyüyen hücreleri tarafından karboksimetil selüloz (CMC) enzimatik bozulma görselleştirmek için ortak bir mikrobiyal boya Kongo Red (CR) kullanır . Aktivite assay ucuz reaktifler, minimal manipülasyon gerektirir ve koloni yerinde bozulması bölgeleri (&quot;haleler&quot;) olarak net sonuçlar verir. Enzimatik aktivite nicel bir ölçüsüdür bu yöntemle tespit edilemez olsa da, biz hale boyutu hücredeki toplam enzimatik aktivite ile ilişkili olduğunu buldular. Ayrıca bireysel pozitif klonların karakterizasyonu, bağıl protein spor belirleyecektir. Geleneksel tüm bakteri hücre CMC / CR faaliyet deneyleri 13, koloniler, çapraz kontaminasyon, ya da büyük ölçekli deneyler daha az yatkın olan CMC agar kuyu, kuluçka kültürleri konu üzerine agar içeren CMC dökme içerir. Burada selülaz aktivitesi için 14 mevcut yıkama yöntemleri değiştiren gelişmiş bir protokol raporu: CMC agar plakaları yetiştirilen hücreler CR boyama önce kaldırılır. Bizim protokol çapraz bulaşmayı önemli ölçüde azaltır ve binlerce klon hızlı bir tarama sağlayan, son derece ölçeklenebilir. H. yanı sıra jecorina enzimler, biz dile getirdiler ve bu protokol organizmaların bir dizi enzimler için geçerli olduğunu düşündüren, Thermoascus aurantiacus ve Penicillium decumbens (Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi) endoglucanase varyantları gösterildi.

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi tarif<em&gt; E. coli.</em&gt; Bu yöntem, substrat bozulması basit bir görsel okuma dayanır enzim saflaştırma gerektirmez ve yüksek ölçeklenebilir. Bu enzim varyantlarının büyük kütüphanelerin hızlı bir tarama sağlar.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Selülaz enzimleri (endoglukanazlar, selobiohidrolazlar ve $\beta$-glukozidazlar), selülozu bileşen şekerlere hidrolize eder; bu şekerler ise daha sonra ...'e dönüştürülebilir.

E. coli'deki fungal endo glukonaz aktivitesi için gerçekleştirilen bu yüksek kapasiteli taramada, katı ortamda büyüyen hücrelerin karboksimetil selülozun enzimatik yıkımını görselleştirmek için yaygın mikrobiyal boya Kongo Kırmızısı kullanılır; öncelikle hücreler bir endo glukonaz kütüphanesi ile transforme edilir ve tekil koloniler için seçici olarak ekilir. Ardından, münferit klonlar seçilir ve 96 kuyuklu plakalarda gece boyunca büyütülür. Sonrasında, endo glukonaz ekspresyonunu indüklemek için IPTG içeren CMC plaklarına replika ekim yapılarak enzimatik tarama gerçekleştirilir.Son olarak, -80 °C'de saklanan ana plaktan klonlar seçilir. Bu analiz, koloni bölgesindeki degradasyon zonları şeklinde net sonuçlar üretir; burada halo boyutu enzimatik aktivite ile ilişkilidir ve göreli protein uygunluğunun kalitatif değerlendirmesine olanak tanır. Bu tekniğin overlay yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok düşük yanlış pozitif oranıyla yüksek kapasiteli analize imkan sağlamasıdır.Bir litre distile suya 25 gram LB büyüme besiyeri, 15 gram agar ve 1,5 gram karboksimetilselüloz substratı ekleyin ve sterilize etmek için otoklavlayın. Besiyeri soğuduktan sonra, uygun antibiyotikleri ve final konsantrasyonu 100 micromolar olacak şekilde IPTG ekleyin. Şimdi, beş büyük kare Petri kabına veya biyolojik deneme tepsisine her birine 200 mililitre besiyeri dökün ve plakaların tamamen kurumasını bekleyin.Öncelikle, Novagen'den PET 22 B plus gibi, lak operatörlü T7 promotörü ve periplazmaya hedefleme için PAL LV sinyal dizisi içeren uygun bir vektöre endo glukonat katalitik domain kütüphanesi oluşturun. Endo glukonat kütüphanesini, cam boncuklar kullanarak tek koloniler elde etmek için e. coli suşu BL 21 DE3 plaklarına transformasyon yapın ve transformasyonu 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Steril kürdanlar kullanarak klonları 96'lı plaklara inoküle edin.Uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 400 µL LB besiyeri içeren derin kuyucuklu plaklar kullanın. 250 RPM çalkalamayla 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Uzun süreli saklama için -80 °C'de muhafaza edilecek 96 kuyucuklu gece boyu kültürlerine steril gliserol ekleyin.Bu, 96 pinli bir damgalama aparatı kullanılarak oluşturulacak ana plaka olacaktır; gece boyunca büyütülen kültürleri, her bir tarama plakası için IPTG ve CMC içeren tarama plakalarına replike edin. Gece boyunca büyütülen kültürlerden beş set damgalayın, etiketleyin ve görünür koloniler oluşana kadar oda sıcaklığında inkübe edin. Kolonilerin tüm izleri temizlenene kadar plakayı distile su ile durulamaya devam edin.Yıkanmış plakayı kaplayacak kadar 0.5% Kongo kırmızısı dökün ve oda sıcaklığında maksimum 15 dakika inkübe edin. Boyayı dökün, bol miktarda bir molar sodyum klorür ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, CMC degradasyon halelerini ortaya çıkarmak için sodyum klorürü dökün.Steril bir kürdan kullanarak, daha detaylı karakterizasyon için ana plakadan aktif enzimleri seçin. Bu örnekte, endo glukonat ekspresyon vektörleri, lac operasyonu ile T7 promotörü kontrolü altında pET 22b(+) içerisinde oluşturulmuştur. Ardından, endo glukonat eksprese eden BL21 kolonilerinin T performansı, CMC degradasyon haloları oluşturmak üzere taranmıştır. Kongo Kırmızısı ile yıkama ve geliştirme işlemlerinden sonra, bu tarama plakalarındaki klonlar tipik olarak degradasyon zonlarının boyutuna göre inaktif, düşük aktif ve yüksek aktif olarak tanımlanabilir.Burada, aktif enzimlerin tanımlanması güvenilir ve tekrarlanabilirdir. Ana plakadaki pozitif klonların doğru şekilde tanımlanabilmesi için tarama plakalarının uygun şekilde etiketlenmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır.

high-throughput-screening-fungal-endoglucanase-activity-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, Escherichia coli olarak ifade metagenomic kütüphane selülolitik faaliyetleri için yüksek kapasiteli ekran açıklanmıştır. Ekran, çözüm odaklı ve yüksek otomasyonlu ve absorbans ölçümü gibi son okuma ile 384 iyi mikropleytin bir pot kimya kullanır.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Kaynak: Kim, H. ve ark., Yüksek verimli Genetik Enzim Tarama Sistemi Kullanarak Çok Enzimli Tarama. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, metagenomik fosmid kütüphaneleri ve kromojenik substratlar kullanılarak enzim ifadesini tespit etmek için genetik tarama yöntemini göstermektedir. Akış sitometrisi, renkli ürünler üreten tek hücreleri tanımlar ve izole eder; böylece aktif enzim eksprese eden hücrelerin yüksek verimlilikte seçimini sağlar.

Genetik olarak Değiştirilmiş Bakteri Hücrelerinde Hedef Enzim İfadesinin Tespiti

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik polimer hidrojel substratları kullanılarak karbonhidrat aktif enzim taraması için yüksek verimli bir test gösteriyoruz. Enzim, bu substratları, ürünün renk yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilen çözünür renkli bir ürüne indirger.

Kromojenik Polimer Hidrojel Bazlı Enzim Tarama Testi: Sentetik Substratlar Kullanarak Karbonhidrat Aktif Enzimleri Taramak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Öğrenin, Escherichia coli'de fungal endoglukanaz aktivitesini yüksek verimli taramak için görsel okumalı, düşük yanlış pozitifli ve ölçeklenebilir bir yöntem. Bu teknik, enzim kütüphanelerinin hızlı değerlendirilmesini sağlar.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli

Daha fazla video keşfet