Yenidoğan Hipoksi Biyokimyasal Ölçüm

Neonatal hipoksi-iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşım, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanmaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, neonatal hipoksik iskeminin biyokimyasal belirteçlerini ölçmektir. Bu, plazmayı izole etmek için önce bebeklerden kan örnekleri toplanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, plazmanın bir kısmı süzülür, dahili bir standartla birleştirilir ve HPLC ikisinde hipoksantin, santin ve ürik asit konsantrasyonları için analiz edilir.

Daha sonra daha fazla plazma alikotu diferansiyel olarak işlenir ve ayrı ayrı analiz edilir. GCMS'deki allantoin konsantrasyonu ve MDA seviyeleri için, prosedürün son adımı, reaksiyonu söndürdükten sonra enzimatik reaksiyonu başlatmak için plazmanın bir kısmını bir substrat ile birleştirmektir. Ksantat oksidazın aktivitesi, bir floresan dedektörü ile donatılmış bir HPLC üzerinde belirlenebilir.

Sonuç olarak, standart eğriler aracılığıyla istenen biyokimyasal belirteçlerin veya enzim aktivitesinin molar konsantrasyonlarına dönüştürülebilen tepe alanlarının kromatogramlarını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin etkileri, neonatal hipoksi iskemisi tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü bu yöntem, enerji yoksunluğu, oksidatif stres, oksidatif hasar ve enzim aktivitesi belirteçlerinin ölçümlerini birleştirerek varlığın genel bir biyokimyasal resmini oluşturur ve hatta hipoksik iskemi derecesi Bu prosedürün başlamasından önce. Doğumdan hemen sonra yeni doğmuş bir bebekten beş dakikadan daha kısa bir sürede altı mililitrelik bir EDTA tüpünde bir insan kanı örneği alınır.

Toplandıktan sonra, numuneyi 10 dakika boyunca dört santigrat derecede ve 1.500 kez G'de santrifüjleyin. Supinatta bulunan plazmayı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika santrifüjleyin. Numuneleri kırmızı kan hücreleri ile kontamine etmemeye dikkat ederek supinatı çıkarın.

Pürinlerin her PLC ölçümü için pürin lanin, MDA ve ksantat oksidaz analizi için numuneleri ayrı mikro santrifüj tüplerine Eloqua edin. 200 mikrolitre plazmayı bir santrifüj filtre cihazına aktarın. Plazmayı dört santigrat derecede ve 1.5 saat boyunca 14.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süzüntüyü çıkarın ve iki aino pürin içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Konsantrasyonu doğru bir şekilde belirlemek için iki AP.To içeren mikro santrifüj tüpüne eklenen filtrat hacmini kaydettiğinizden emin olun. Tüpü 10 ila 20 saniye boyunca vorteksleyin.

Elde edilen kromatogramlardan her numune için üç adet 50 mikrolitrelik enjeksiyon kullanarak numuneleri yazılı protokolde açıklandığı gibi bir HPLC ile analiz edin. Numunedeki pürin konsantrasyonunu belirleyin. Hipoksantin, ksantin ve ürik asidi, karşılık gelen tutma süreleri ve dalga boylarında tepe alanları elde ederek nicelleştirin.

Ardından, iki ap'nin tepe alanını ölçün. Bu bilgilerden, hiper ksantin ve ürik asidin iki AP'ye alan oranları hesaplanabilir. Daha sonra standart eğrileri kullanarak oranları mikromolar konsantrasyonlara dönüştürün Lanin ölçümünü gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre plazmaya 50 mikrolitre dahili standart ve 100 mikrolitre aseto nitril ekleyin.

Karışımı 10 ila 20 saniye vorteksledikten sonra. Santrifüjlemeyi takiben 10 dakika santrifüjleyin. Supinatı çıkarın ve bir GCM S şişesine yerleştirin.

Sıvıyı nitrojen gazı altında kurutun. Sıvı kuruduktan sonra, 25 mikrolitre izleştirici ajan M-T-B-S-T-F-A ve 25 mikrolitre piridin ekleyin. Şişeyi kapatın ve iki saat boyunca 50 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından numuneyi 300 mikrolitrelik bir ek parçaya sahip başka bir GCMS şişesine aktarın. Bir otomatik örnekleyici kullanarak GCMS'deki örnekleri analiz edin. Dakikada 1,5 mililitrelik bir akış hızı olarak taşıyıcı gaz olarak helyum kullanarak bileşik ayırma işlemi gerçekleştirin.

GCMS analizine başlamak için çalıştırmanın parametrelerini girin. İlk sütun sıcaklığını 100 santigrat dereceye ayarlayın ve dakikada 10 santigrat derece hızında 180 santigrat dereceye çıkarmadan önce bu sıcaklığı iki dakika tutun. Sıcaklığı dört dakika tutun, ardından dakikada 20 santigrat derece oranında 260 santigrat dereceye yükseltin.

Çalışmanın sonuna kadar bu sıcaklığı koruyun. DERIVATIZED ürününün bir mikrolitresini bölünmüş modda enjekte etmek için otomatik numune alma cihazını kullanın ve her numune çalışması arasında çalışmayı gerçekleştirin. Otomatik örnekleyicinin sütunu iki ila bir M-T-B-S-T-F-A piridin enjeksiyonu ile temizlemesini sağlayın.

Bir LAN toinini ölçmek için, iyon izleme modunu seçer ve atlanto girişi için 3 98 ana şarj oranını ve ağır atlanto girişi için 400 ana şarj oranını izlersiniz. Daha sonra, MDA ölçümünden önce hazırlanmış bir standart eğri kullanarak atlanto'nun iyon bolluk oranlarını ağır atlanto'ya mikromolar atlanto konsantrasyonlarına dönüştürün, yazılı protokolde açıklandığı gibi bütillenmiş hidroksil toluen ve 50 milimolar fenil hidrazin çözeltileri hazırlayın. 100 mikrolitrelik plazma örneğine M-M-D-A-B-H-T ve sodyum sitrat ekleyin.

Damıtılmış deiyonize su ekleyerek son karışımı 480 mikrolitreye seyreltin. 20 mikrolitre 50 milimolar fenol hidrazin ekleyerek çözeltiyi türetize edin. Şişeyi kapattıktan sonra, çözeltiyi bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, karışımı bir dakika boyunca bir mililitre hekzan girdabı ekleyin ve 10 dakika boyunca dakikada 3000 dönüşte santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, organik tabakayı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra çözeltiyi bir nitrojen gazı akışı altında buharlaştırarak 100 mikrolitreye konsantre edin ve 300 mikrolitrelik bir ek ile AGCMS eğesine aktarın.

Ardından, yazılı prosedürde açıklandığı gibi MDA'nın bileşik ayrımını ve miktar tayinini gerçekleştiren otomatik örnekleyiciyi kullanarak numuneleri AGCMS üzerinde analiz edin. Plazma örnekleri için iki şişe hazırlayarak santhe oksidaz aktivitesinin tespitine başlayın. Biri kontrol olarak substrat ile sıfır dakika inkübe etmek ve diğeri dört saat inkübe etmek için.

Deney olarak, her tüpe tampon ve substrat ekleyin. Numuneleri 37 santigrat derecede beş dakika önceden inkübe edin. Her tüpe 60 mikrolitre plazma ekleyerek enzim reaksiyonunu başlatın.

Hemen sıfır inkübasyon tüpüne klorik asit başına 300 mikrolitre% 4 ekleyin. Tersine, klorik asit ilavesinden sonra reaksiyonu söndürmeden önce diğer karışımın 37 santigrat derecede dört saat inkübe etmesine izin verin. Sıfır inkübasyon kontrol tüpünü girdaplayın ve santrifüjleme ile takip edin.

500 mikrolitre supinatı çıkarın ve reaksiyonu nötralize etmek, nötralize edilmiş numuneyi girdaplamak ve ikinci kez santrifüjlemek için 20 mikrolitre beş molar potasyum karbonat içeren bir tüpe ekleyin. Daha sonra 350 mikrolitre nötralize edilmiş çözeltiyi iki ap içeren bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Dört saatlik numuneyi inkübe ettikten sonra, klorik asit başına 300 mikrolitre% 4 ekleyerek reaksiyonu söndürün.

Numunenin kontrol numunesi için gerçekleştirildiği şekilde işlenmesine devam edin. Numuneleri, taramalı floresan dedektörü ile donatılmış bir HPLC'de analiz edin. Dakikada bir mililitre akış hızında Sokratik koşulları kullanarak parametreleri girin.

Yeterli tepe ayrımı ve tanımlaması elde etmek için, floresan dedektörü uyarma dalga boyunu 340 nanometre ve emisyon dalga boyunu 410 nanometre üç 50 olarak ayarlayın. HPLC çalışmasını takiben her numune için HPLC üzerinde mikrolitre enjeksiyonlar yapılır. Floresan dedektör spektrumundan tepe alanları elde ederek ISO terin'in iki AP'ye oranını belirleyin.

Spektrumdaki yaklaşık beş dakikalık ilk zirve iki ap'ye karşılık gelir. İkinci ve en büyük zirve terran olacak. ISO anteroterin zirvesi en son yükselir, sıfır ve dört saatlik inkübasyon zaman noktaları arasındaki ISO ANTOIN iki AP tepe alanı oranlarındaki farkı elde edin.

Standart eğrilerden ksantin oksidaz aktivitesini hesaplamak için bu değeri kullanın. Temizleme bileşiklerinin HPLC miktar tayininin bir örneği, ürik asit, hipoksantin ve ksantinin spesifik alıkonma süreleri ve emisyon dalga boylarının, pürin bileşiklerinin aynı anda miktar tayinine izin verdiği gösterilmiştir. Tahlil doğru bir şekilde çalıştırıldığında, bileşikler yeterli ayrıma sahip olacak ve tepe şekli keskin ve tek modlu olacaktır.

HPLC sisteminde hava kabarcıkları varsa, tutma süreleri değişecek ve HPLC basıncı önemli ölçüde dalgalanacaktır. Koruma kartuşunun değiştirilmesi gerekiyorsa, basınç artacak ve tepe noktaları genişleyecek ve buradaki örnekte gösterildiği gibi by veya trimodal hale gelecektir. Laninin GCMS miktar tayininin bir örneği gösterilmiştir çünkü masif türetilmiş, lanin ve türetilmiş, ağır lanin bilinmektedir.

Kütle spektrometresinde bu bileşikleri tanımlamak için iyon modu seçilebilir. Test doğru yapılırsa, aynı tutma süresinde iki tepe noktası gözlenecektir. Bir tepe Alan Toin'e, diğeri ise ağır toin'e karşılık gelir.

MDA'nın nicelleştirilmesi için elde edilen sonuçlar, iki zirvenin farklı tutma sürelerinde gözlemlenmesi dışında, Alan Toin'in sonuçlarıyla benzerdir. Burada, MDA için 144 ana şarj oranı tepe noktası ve MMDA için 158 ana şarj oranı tepe noktası gözlenir. Ksant oksidaz fonksiyonunun HPLC bazlı miktar tayininin bir örneği, sıfır dakikalık inkübasyon süresinde ve dört saatlik inkübasyon süresinde gösterilmiştir.

Test doğru bir şekilde çalıştırılırsa, floresan dedektörü ile biri iki ap, biri Terran için ve biri ISO terin için olmak üzere üç tepe noktası gözlemlenmelidir. Artan santhe oksidaz enzim aktivitesine bağlı olarak dört saatlik inkübasyon süresi için daha yüksek ISO terin zirvesine dikkat edin. Bu tahlil enzim fonksiyonunu ölçtüğü için, numunenin tekrar tekrar dondurulması ve çözülmesi bunu değiştirebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan hipoksi iskemisinin çeşitli biyokimyasal belirteçlerinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamalısınız.