Name: Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin, kısmen pankreatektomili hastalardan insan adacık hücrelerinin izolasyonu için enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyon yöntemini. Bu protokol diyabet araştırmalarında fonksiyonel analizler için canlı hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz projenin çeşitli aşamalarında yardım, tavsiye ve kritik giriş birçok meslektaşları teşekkür etmek istiyorum. Bu video makalenin Üretim, Eğitim ve Araştırma (BMBF), Diyabet Araştırma (DZD, Alman Merkezi Alman <a href="http://www.dzd-ev.de">Bakanlığı</a> fon http://www.dzd-ev.de), <a href="http://www.imidia.org">IMIDIA</a> (http://www <a href="http://www.imidia.org">imidia.org</a> ) ve Teknoloji Dresden Üniversitesi, Üniversite Hastanesi Carl Gustav Carus. Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n ° 115.005 altında Yenilikçi Tıp Girişimi, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı.

1. Pankreas doku toplama ameliyathanede <ol><li> Cerrah, pankreas kısmi rezeksiyon gerçekleştirir. </li><li> Patolog, buz üzerinde bir kutu içinde pankreas örnek yerleştirdikten sonra, hemen teslim. </li></ol> 2. Adacık izolasyonu için doku seçimi <ol><li> Patolog tanısal amaçlı hasarlı dokuyu koruyarak, yumuşak ve sağlıklı görünen doku seçer. Fibrotik doku ve kullanılabilir dokusunun az 2 g sunan örneklerinden adacık izolasyon dışındadır. </li><li> Euro Collins Çözüm pankreas dokusu daldırın ve laboratuvara buz üzerinde teslim. </li></ol> 3. Insan adacık izolasyonu <ol><li> Pankreas dokusu tartılır, daha sonra 10 cm çanak içine yerleştirin. </li><li> 500 ml cam şişe içinde 150 ml RPMI medya koyun. </li><li> 250 ml cam şişe içinde, 100 mg / ml DNaz ve 5mg/ml Liberase RI 20 ml, 130 ml RPMI medya birleştirerek sindirim enzimi solüsyon hazırlanır. Bu çözümün pankreas dokusu enjekte etmek için bir şırınga içine 10 ml çizin. </li><li> Homojen bu gerilmek amaçlayan sindirim enzimi çözümü, pankreas dokusu içine enjekte edilir. Fibrozis önlenir, sindirim muhtemelen başarısız olacaktır. Daha sonra, yaklaşık 4 mm içine buz üzerinde 3 adet doku kıyma. </li></ol> 4. İnsan pankreas sindirim devre <ol><li> Şekil 1'de gösterildiği gibi sindirim devre birleştirin. Ricordi odasında odasının üst kısmında alt ve dışarı akış yönü. </li><li> Toplam hacmi 300 ml, 500 ml balona kalan sindirim enzim çözeltisi ekleyin ve bir termometre yerleştirin. </li><li> Odasına, pankreas dokusu transfer örgü (gözenek çapı: 600 mikron) yerleştirin ve üç Silikon Nitrür Mermerler (çap: 15 mm), oda kapatın ve 140 ml / dk akış ile pompa start. </li><li> Devre sıcaklığı 37 ulaştığında ° C, zamanlama başlangıç ​​ve periyodik olarak sindirim durdurmak için ne zaman belirlemek için numune almak. Dithizone (2 mg / ml) ile boyanarak sindirilir doku 4 içinde adacıklar mikroskopik görüntüleme sağlar. </li><li> Asiner doku çevresindeki adacıklar ayrılır sonra, buz üzerinde yerleştirerek ve ısıtma rezistansı devre soğuk yıkama medya 200 ml (900 ml RPMI 1640 5.5 mM glukoz ve% 10 FBS) ekleyerek sindirim hemen durdurmak. </li><li> 250 ml konik tüpler adacık çözüm örnek tüp çıkıyor toplayın. Devre boşalana kadar devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Ve üç silisyum nitrür mermerler (çap: 15 mm): insan pankreas sindirim devresi insan pankreas sindirim devre örgü (600 mikron gözenek çapı) içeren bir Ricordi odasına içerir. Odasından Çıkış peristaltik pompa (140 ml / dk) doku toplama şişesi sürülür. Oklar, akış yönünü gösterir. Enzimatik sindirim için en uygun sıcaklık 37 ° C su banyosunda ısıtma rezistansı çeker tarafından yapılmaktadır. 5. Çamaşır-sindirim sonrası <ol><li> 5 dakika süreyle 1000 rpm'de adacık çözümü, 4 ° C içeren 250 ml konik tüpler santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS ile 900 ml RPMI 1640) yıkama medya adacık pelet tekrar süspansiyon ve 50 ml konik tüpler eşit kesirler dağıtmak. (Opsiyonel: yıkama artırmak için ek konik tüpler içine dağıtın) 1000 rpm'de Santrifüj, 4 ° C 5 dk. </li><li> Supernatant atın ve yavaşça el sallayarak pelet gevşetin. </li></ol> 6. Ficoll degrade saflaştırılması <ol><li> Yoğunluğu 1.125 g / ml, pH 7.4 Ficoll medya ile pelletini tekrar ve yavaş yavaş 1.080, 1.060 ve 1.037 g / ml yoğunlukları ile 10 ml alikotları Ficoll medya kaplaması. </li><li> 20 dakika için 4 ° C, 2400 rpm Ficoll gradyanlar santrifüjleyin. </li></ol> 7. Islet Toplama ve Kültür <ol><li> Santrifüj sonra, farklı doku bileşenleri degrade bölümleme tarafından ayırt edilmelidir. </li><li> Yağ ve bağ dokusu oluşan üst tabaka atın. </li><li> 1,037-1,060 g / ml interfaz adacık agregaların ilk katman dikkatlice hasat. Bu tabaka, en saf izole adacıklar içerir. Kesirler verimli izolasyon için ayrı ayrı toplayın. </li><li> 1,060-1,080 g / ml interfaz adacık agrega, ikincisi daha az saf fraksiyon toplayın. </li><li> 50 ml toplam hacmi her konik tüp (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS ile 900 ml RPMI 1640) yıkama medya ekleyerek Ficoll degrade sulandırınız. 1000 rpm'de santrifüj, 4 ° C 5 dk. </li><li> Emme ile süpernatantı atın. Pelet Ficoll degrade gevşek bağlı olabileceği gibi dikkatli kullanın. </li><li> Pelet yıkayın with yıkama medya (5.5 mM glukoz ve% 10 FBS 900ml RPMI 1640) ve 1000 rpm az santrifüj, 4 ° C de 5 dakika. Adacık kültür ortamı kullanarak tekrarlayın. </li><li> Kültür ortamı içinde adacıklar süspanse edin ve% 5 CO 2 ile 37 kuvöz koyun ° C daha fazla işlem 24-48 saat önce için. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bizim protokolünü kullanarak, insan adacıklar kısmi pankreatektomi alınan pankreas dokusundan izole edilebilir. Bu protokolün başarı birkaç kritik noktaları sırasında alınan bakım dayanır. Beta-hücre canlılığını korumak için, numune laboratuvara buz üzerinde hızla taşınması olması esastır. Ayrıca, doku sindirim süresi, doku fibrozis ve medya enzimatik aktivite derecesine göre ampirik olarak optimize edilmiş olmalıdır. Bu Ricordi odasına elle uygulanan mekanik kuvvet derecesi için de geçerlidir. Böylece iyi bir adacık verimi elde etmek için, protokol en iyi özel bir bilim adamı ya da teknik yardımcısı tarafından yapılır. Takım zaten adacık izolasyonu yaşanan sürece İlk başarısızlık norm. Adacık izolasyon protokolü ve standart insan adacık izolasyon yöntemi arasında önemli farklılıklar vardır: 1) cerrahi işlem sırasında birkaç saat iskemi maruz pankreas dokusu kullanmasına rağmen, hemen sitesinde işlenir. Bu tahsisi ve adacık izolasyonu tesisi teslim sırasında birkaç saat için iskemik kalan pankreas / adacık nakli için beyin-ölü donörler, eksplante pancreata aksine. Standart bir protokol pankreatik kanal içine demlenmeye 2) ise, doğrudan pankreas dokusu içine enjekte kollajenaz. 3) Biz COBE hücre işlemci kullanarak sürekli bir Ficoll degrade adacıklar toplama yerine süreksiz Ficoll degrade kullanarak adacıklar ayırın. Cerrahi numune çok fibrotik veya yeterli sayıda adacık izole etmek için kıt olduğu durumlarda, doku hala lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) 10 tarafından alınacak. Bu gen ekspresyonu verileri adacık izolasyon başarısız ya da verim çok düşük olsa bile, hemen hemen her numune tahsil edilecek sağlar. Ne yazık ki, LCM fonksiyonel çalışmalar için canlı hücreler üretmek değildir ve bunların tutarı proteomik analiz için genellikle yetersiz kalmaktadır. Böylece, adacıklar almak için kollajenaz sindirim protokolü ile paralel olarak LCM kullanarak cerrahi örnekleri işlemek için en etkili yolu olabilir. Kısmi pancreatectomies adacık izolasyonu için doku toplarken, hastanın klinik öykü ve metabolik durumunu dikkatle incelemek için önemlidir. Kısmen pancreatectomized bir hasta tip 3c diyabet yani şeker hastalığı, cerrahi 6 yol açan pankreas bozukluğu ikincil tarafından etkilenmiş olabilir . Kliniğimizde 2010 yılında bu ameliyat geçiren 43 katılan hastalar arasında, 32 non-diyabetik, 5 tip 2 diyabet ve 6 etkilendi tipi 3c diyabet vardı. Bu veriler, daha önceki çalışmaları ile bozulmuş glikoz metabolizması ve diyabet pankreas kanser veya kronik pankreatit 6 muzdarip hastaların büyük bir kısmını işaret kabul etmiş sayılırsınız. Biz birincil kökenli 7 pankreas ameliyatı olan semptomların başlangıcından önce en az bir yıl tanısı kondu diyabet olarak kabul edilecek. Adacık otoantijenler karşı antikor düzeyleri de potansiyel bir diyabet 8 otoimmün kökenli değerlendirmek için ölçülmelidir. Pankreatektomi geçiren bir hastanın, tanı konmamış diyabet muzdarip veya glukoz hoşgörüsüz olabileceğinden, tüm non-diyabetik hastalarda oral glukoz tolerans testi önce 9 pankreatektomi verilmelidir .

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><th> Ekipman </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml Serolojik pipet (CELLSTAR) </td><td> greiner biyo-bir </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml Serolojik pipet (CELLSTAR) </td><td> greiner biyo-bir </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml Serolojik pipet (CELLSTAR) </td><td> greiner biyo-bir </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10 ml Şırınga </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ml Şırınga </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 ml Şırınga </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 İğne Microlance 3 </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 İğne </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 İğne Microlance 3 </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 cm hücre kültürü çanak 2x2 mm ızgara </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 cm Doku kültürü çanak </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 cm Kolay tutuş petri </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml şişe depolama </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml&#39;lik şişeler Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml&#39;lik şişeler Erlenmeyer </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Vidalı Kapak Konik Alt Santrifüj Tüpü </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon konik tüp </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask Sigara tedavi </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Filtre Ünitesi Duropore (0,22 mm) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Filtre Şişe En Vakum (PES 70 mm Çap Membran, 0,22 mikron gözenek boyutu, 45 mm boyun boyutu, 500 ml hacim) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Dansitometre (Densito 30px) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Hızlı PES Filtre Ünitesi 0,2 mikron </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Isıtma Bataryası </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Hidrolik Typ PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi kamara (600 mikron gözenek çapı metal örgü) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> Model 50-U-01, Seri 0503-001 </td></tr><tr><td> Hazırlık Standı </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Ringler </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> YA-50-U-01 </td></tr><tr><td> Silikon Nitrür Mermerler (15 mm set 9) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Silikon Boru </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Cerrahi forseps </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Cerrahi makaslar (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Su banyosu, 200 EKK </td><td> Hibe </td><td> EKK 200 </td></tr><tr><th> Reaktifler </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Kollajenaz -&gt; Liberase RI (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D-Glukoz (+) </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimethylsülfoksit (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNaz I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratuvarları </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> PAA Laboratuvarları </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Fetal Sığır serum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-hidroksietil) - 1-piperazinyl) ethansulfons ‰ ure (Hepes) </td><td> Roth </td><td> 9105,3 </td></tr><tr><td> 5 M NaOH </td><td> klinik eczane, hastane </td><td> - </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin (100x) </td><td> PAA Laboratuvarları </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (AÇIK) </td><td> BD (Becton Dickinson ve Şirket) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate susuz </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Orta 1640 [-] D-Glukoz [+] L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Orta 1640 [+] L-Glutamine </td><td> PAA Laboratuvarları </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Medya ve Çözümler Dithizone Çözüm <ul><li> 10 ml DMSO 100 mg DTZ çözülür ve 40 ml PBS içinde sulandırmak </li><li> Steril filtre solüsyonu (0.22 mikron) </li></ul> Enzim Çözüm <ul><li> 100 mg 20 ml RPMI 1640 medya Liberase RI (takviyesi olmadan) çözülür </li><li> (Takviyesi olmadan), 1 ml RPMI 1640 medya 100 mg DNaz çözülür </li><li> Steril filtre solüsyonu (0.22 mikron) ve enzim buz üzerinde tutmak </li></ul> Yıkama medya (1000ml/5.5mM Glikoz) <ul><li> 100 ml FBS (ısı inaktive) çözülür </li><li> 450 ml RPMI 1640 (glikoz) </li><li> 450 ml RPMI 1640 (11 mM glikoz) </li><li> Steril filtre solüsyonu (0.22 mikron) </li></ul> Islet kültür ortamı (500ml / 5,5 mM Glukoz) <ul><li> 10 ml 1M Hepes (pH, 7.4 &#39;) çözülür. </li><li> 50 ml FBS ekle </li><li> 5 ml penisilin / streptomisin (100x) </li><li> 2.75 ml 1 M Glikoz Çözüm ekle </li><li> 432,25 ml RPMI 1640 (glikoz) </li><li> Steril filtre solüsyonu (0.22 mikron) </li></ul> Euro Collins Çözümü <ul><li> 4083 g potasyum hidrojenfosfat </li><li> 70,0 g glukoz </li><li> 2237 g potasyum klorür </li><li> 14,80 g potasyum monohydrogenphosphate </li><li> 1.680 g sodyum hidrojen karbonat </li><li> 40 ml elektrolit solüsyonu (E 154) </li><li> pH: 7.4 </li><li> 2000 ml distile su ekleyin </li><li> Steril filtre solüsyonu (0.22 mikron) </li></ul> Ficoll Stok Çözümü <ul><li> 500 g Ficoll Euro Collins Çözüm 1000 ml </li><li> 8.94 g Hepes ekle </li><li> Ficoll çözüldü kadar gecede karıştırın. </li><li> pH: 7.4 </li><li> Tedbir yoğunluğu </li></ul> Ficoll Degradeler <ul><li> Yoğunluğuna göre FBS miktarı, Euro Collins Çözüm ve Ficoll Stok Çözümü hesaplayın </li><li> 3 çözümler birleştirin ve bir dansitometresi ile yoğunluk ölçümü </li><li> Yoğunluğu ayarlanır kadar Euro Collins Çözüm ya da Ficoll Stok Çözüm </li><li> 4 Steril filtre çözümü (0.22 mm) ve mağaza ° C </li></ul>

kısmen pancreatectomized hastalar İnsan islets izolasyonu

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

, Tip 2 diyabet ve Langerhans arıza 1 adacık patogenezinde soruşturmalar organ bağışına 2 tip 2 diyabetik adacıklar sınırlı sayıda engel var . Burada adacıklar tip 2 diyabetik ve non-diyabetik hastalarda farklı pankreas hastalıkları (iyi veya kötü huylu pankreas tümörleri, kronik pankreatit ve koledok veya duodenal tümörlerin) nedeniyle kısmi pankreatektomi geçirmiş elde İnsan pankreas dokusundan izole etmek için protokol paylaşmak . Katılan tüm hastalara aynı zamanda yerel etik komitesi tarafından onaylanmış olan bu çalışma, onların rızasını verdi. Cerrahi örneklerin hemen tanısal amaçlı hasarlı doku istinat yumuşak ve sağlıklı görünmesini pankreatik doku, adacık izolasyonu için seçilen patolog teslim edildi. 1.000 &#39;den fazla adacıkları izole için, pankreas dokusunun en az 2 g ile başlamak zorundaydık. Ayrıca bizim protokol gerekli enzim içeren medya enjekte gözle görülür bir doku gerilmek ve daha sonra yüzey alanını artırarak sindirime yardımcı olmak için kıyma oldu. İnsan pankreas dokusu büyük miktarda (&gt; 15g) kullanılabilir olduğu zaman zaman durum dahil etmek için protokol uygulanabilirliği genişletmek için, doku sindirmek için bir Ricordi odası (50 ml). Sindirim sırasında, elle numune ile doku fibrozis seviyesine göre değişen bir yoğunlukta Ricordi kamara 3 salladı. Bir süreksiz Ficoll degrade sonra asiner doku adacıkları ayırmak için kullanılır oldu. Biz doku pelet kadar küçük homojen Ficoll ortamda 1.125 g / ml &#39;lik bir yoğunluk ile yeniden süspanse olması gerektiğini kaydetti. Izolasyondan sonra, biz onların fonksiyonel iyileşmeyi kolaylaştırmak için en az 48 saat süreyle% 5 CO 2 ile 37 ° stressiz koşulları (hiçbir sallayarak veya rotasyon) ° C altında adacıklar kültür. Protokol ve gelecekteki gelişme yaygın uygulama, tip 2 diyabet araştırma büyük ölçüde ilerleyen, diyabetik insan adacık büyük miktarlarda zamanında hasat ve non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu sağlayabilir.

Bu büyük ölçüde fibrozis ve kollajenaz aktivitesi büyük ölçüde farklılıklar nedeniyle hazırlıklar arasında değişmektedir rağmen protokol, pankreas dokusu gram başına ~ 500 adacık ortalama vermiştir. Daha sonra 24 saat sonra izolasyon Ayıklama, doku işleme sırasında Dithizone ilk boyama ile&gt;% 90 adacık saflık elde etti. Arındırılmış adacıklar kalitesini belirlemek için, 25 mM glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması için 2 saat boyunca durağan koşullar altında test edilmiştir. Biz ECIT adacık izolasyonu ve organ nakli merkezleri elde adacık insülin salgılanması Benzer bulundu. Olarak kısmen pancreatectomized pancreata izole adacıklar adacık nakli, kritik bir faktör olarak kabul edilmez toplam iEQ değerlendirilmesi anlamına gelmez. Önemlisi, yöntem bize, 2005 ve 2008 5 arasında 25 kısmi pancreatectomized hastalarda fonksiyonel çalışmalar için adacıkları izole etmek için etkin . Bu adacıklar batı blot ve immünohistokimya glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması ve özel protein ekspresyonu analiz edilmiştir. Kısmen pancreatecomized pancreata izole adacıklar da gen ve protein ekspresyon profilleri, ultrastrüktürel görünüm ve non-diyabetik ve diyabetik adacıklar fonksiyonel yanıtları karşılaştırmak için kullanılan olabilir. Daha fazla hasta organ bağışına daha kısmi pankreatektomi geçiren olduğundan, protokol yeterince örnekler ve veriler sağlam bir istatistiksel analiz için toplanan izin verebilir.

Araştırma için tip 2 diyabetik adacık kaynağı yetersiz. Burada kısmi pankreatektomi geçiren hastalardan izole adacıklar için protokol paylaşın. Bu yaklaşım, tip 2 diyabetik adacıklar elde etmek için eşsiz bir mekan temsil eder ve temel ve klinik çalışmalar için yeterli sayıda non-diyabetik hastalarda klinik olarak uyumlu.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Tip 2 diyabetin patogenezi ve Langerhans adacıklarının işlev bozukluğu üzerine yapılan araştırmalar, tip 2... erişilebilirliğinin sınırlı olması nedeniyle engellenmiştir.

Merhaba, ben Triton'daki Teknik Üniversite Cerrahi Bölümü'nden Florian Al. Merhaba, ben de Grayston'daki Üniversite Hastanesi Cerrahi Bölümü'nden Gregor Cher.Göz kapağı fizyolojisi ve diyabet patogenezine dair anlayışımızı geliştirmek için göz kapağı biyolojisi ve fonksiyonu üzerine araştırmalar yapılmasına büyük ihtiyaç vardır. Ne yazık ki, diyabetik olmayan ve tip iki diyabetli hastalardan insan göz kapağı örneği elde etmek oldukça zordur. Aşağıdaki video dizisi, parsiyel pankreatik optimiz hastalarından insan göz kapaklarının nasıl izole edileceğine dair bir protokol gösterecektir.Bu şekilde elde edilen adaleler, fonksiyonel analiz için in vitro bir sistem olarak kullanılabilir. İnsan pankreas adalelerinin izolasyonu için ön koşul, insan pankreas dokusunun cerrahi rezeksiyonudur. Belirli pankreas patolojileri nedeniyle pankreasın parsiyel rezeksiyonu yapılan hastaları temel alıyoruz.İnsan pankreas dokusu kaynağı olarak, cerrah pankreasta kesi yapar ve parsiyel rezeksiyonu gerçekleştirir. Ardından, pankreas parçaları buz üzerine konur ve Patoloji Bölümü'ne taşınır. Patolog, temin edilecek sağlıklı görünümlü ve yumuşak pankreas dokusunun miktarını belirler.Ada hücresi izolasyonu için, izolasyon işlemi adına en az iki gram pankreas dokusu gereklidir. Doku, ucon solüsyonuna yerleştirilir ve buz üzerinde laboratuvara taşınır. Ada hücresi izolasyon sürecindeki ilk adım, pankreas dokusunun ağırlığının ölçülmesidir.Ardından örnek, 10 santimetrelik bir kaba yerleştirilir. Daha önceden 150 mililitre RPMI medyum içeren bir adet 500 mililitrelik erlen ve 130 mililitre RPMI medyum içeren bir adet 250 mililitrelik erlen hazırladık. Daha sonra, bir mililitre DNase ve 20 mililitre kollajenaz içeren sindirim enzimi çözeltisini 250 mililitrelik erlene ekleyip 10 mililitrelik bir şırınga ile çekeriz.Ardından, temizlenmiş pankreas dokusu, enzim içeren medyum enjekte edilerek genişletilir ve yüzey alanını artırmak ve sindirim sürecini kolaylaştırmak için küçük parçalar halinde kıyılır. Bu kıyma adımı kritik öneme sahiptir çünkü tek başına enjeksiyonla yapılan genişletme, enzimin doku içinde uygun şekilde dağılmasına izin vermez. Buna paralel olarak, sindirim devresini kurduk.Bu şekilde gösterildiği üzere, kayıt odasındaki akış yönü odanın alt kısmından girişe ve üst kısmından çıkışa doğrudur. Ardından, kalan enzim içeren medyayı 500 mililitrelik erlene 300 mililitre hacme ulaşana kadar ekliyoruz ve ardından termometreyi yerleştiriyoruz. Kayıt odası, 600 mikrometre gözenek çapına sahip bir metal ağı ve her biri 15 milimetre çapında serbest silikon nitrür bilyeler içermektedir.Pankreas dokusunu hazneye aktarıyoruz, fileyi yerleştiriyoruz, hazneyi kapatıyoruz ve pompayı dakikada 140 mililitre hızla çalıştırıyoruz. Devrenin sıcaklığı 37 °C'ye ulaştığında, sindirim süresini ölçmeye başlıyoruz. Kayıt altındaki hazne, doku kompozisyonuna göre elle çalkalanır.Sindirimi durdurmak için optimal zaman noktasını belirlemek amacıyla periyodik numuneler alır, bunları boyar ve ayrışmış gözlemleri mikroskop altında inceleriz. Gözlemlerin çevre dokulardan ayrıldığı görüldüğünde, ısıtma bobinini buza yerleştirip devreye 200 ml soğuk yıkama medyumu ekleyerek sindirimi hızla durdururuz. Ardından, devre boşalana kadar numune tüpünü 250 ml'lik falcon tüplerine yerleştirerek göz kapağı solüsyonunu toplarız.Aşağıdaki yıkama prosedürü, 4 °C'de beş dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifügasyon adımıyla başlar. Bir sonraki adımda, süpernatantı uzaklaştırıp çökelek çözeltisini yıkama medyasında resüspande ederiz ve eşit fraksiyonlar halinde 50 ml'lik falcon tüplerine paylaştırırız. Yıkama işlemi, 4 °C'de beş dakika boyunca 1000 RPM hızındaki başka bir santrifügasyon adımıyla devam eder.Opsiyonel bir adım olarak, paletin boyutuna bağlı olarak, paleti orijinal dördünün dışındaki ek falcon tüplerine paylaştırırız. Yıkama işlemini iyileştirmek için tekrar süpernatanı atarız ve göz kapağının bağ dokudan ayrılması için paleti nazikçe gevşetiriz. İki kısmın farklı doku yoğunlukları, fekal gradyan uygulamasını mümkün kılar.Öncelikle, pellet'i 1.125 g/mL yoğunluktaki fekal medyumda yeniden süspande ediyoruz. Pellet, homojen bir resüspansiyona izin verecek kadar küçük olmalıdır. Ardından, bunun üzerine 1.081,060 ve 1.037 yoğunluktaki fekal medyumları, her biri 10 mL hacimde olacak şekilde yavaşça ekliyoruz.Ardından, gradiyentleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 2.400 RPM'de santrifüj ediyoruz. Artık fraksiyonlarda yoğunluklarına göre ayrılan farklı bileşenleri ayırt edebilirsiniz. İlk olarak, yağ ve bağ dokusundan oluşan üst tabakayı atıyoruz.Şimdi topladığımız fraksiyon, temel olarak izole edilmiş gözlemleri içeren 1,037 ve 1,06'daki ilk göz kapağı agregat katmanıdır. Verimli bir izolasyon için fraksiyonların ayrı ayrı toplanması önemlidir. Daha sonra, ilk katmana göre daha az saf gözlemler içeren 1,060 ve 1,080 ara yüzündeki ikinci göz kapağı agregat fraksiyonunu toplarız.Ardından, fekal gradyenti seyreltmek için yıkama medyasını toplam hacim 50 milliliter olacak şekilde ekliyoruz ve beş dakika boyunca 1000 RPM hızında santrifüj ediyoruz. Düşük sıcaklık nedeniyle pellet çok gevşek olabileceğinden, supernatant kısmını vakumla uzaklaştırıyoruz. Bu nedenle, yıkama adımını göz kapağı kültür medyası ile dört derece Celsius'ta, 1000 RPM hızında beş dakika boyunca tekrarlamamız gerekmektedir.Son adımda, insan gözlemlerini ve gözlemi kültürü, medyum ve kültürü yeniden süspande ediyoruz. Toplanan gözlemler, 37 derece Celsius'taki inkübatörde 24 ila 48 saat boyunca tutulur. Bu kültürleme adımından sonra, göz kapakları ileri işlemlere hazır hale gelir.Bu protokol, parsiyel pankreatektomi sonrası pankreas dokusundan insan adalelerini izole etmenizi sağlayacaktır. Hücre canlılığını en iyi şekilde korumak için pankreas örneklerinin izolasyon tesisine hızlı ve soğuk şekilde taşınması önemlidir. İzolasyon ekibinin, sindirim sürecinin oldukça dinamik bir prosedür olduğunu göz önünde bulundurması gerekir.Sindirimin süresi, doku kompozisyonuna güçlü bir şekilde bağlıdır. Örneğin, fibrozis derecesi ve pankreas dokusuna yeterli enzim enjekte edebilme kapasitesi etkileyicidir. Kayıt odası içindeki mekanik kuvvetin ve sindirim sürecinin uzunluğunun bireysel olarak ayarlanması, iyi bir adaçayı verimi elde etmek için kritiktir.

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Burada, olası karışıklıkların azaltılması ile endokrin pankreas fonksiyonunu değerlendirmek için ek bir teknik olarak, sağlam bir pankreas ile fare damar sistemi yoluyla perfüzyon yoluyla glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) gerçekleştirme hakkında ayrıntılar sunuyoruz.

Sağlam Bir Pankreas ile Farelerin Damar Sisteminden Perfüzyon Yoluyla Glikozla Uyarılan İnsülin Sekresyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, kısmen pankreatektomili hastalardan insan adacık hücrelerinin izolasyonu için enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyon yöntemini. Bu protokol diyabet araştırmalarında fonksiyonel analizler için canlı hücre elde edilmesini sağlar.

Kısmen Pancreatectomized hastalar İnsan Islets izolasyonu

Daha fazla video keşfet