Ultrason Hedeflenen Mikro İmha Tekniği Giriş

UTMD, ultrasonla yönlendirilmiş mikro kabarcık yıkımı (ultrasound targeted microbubble destruction) anlamına gelir. UTMD; terapötik genler dahil olmak üzere biyoaktif moleküllerin, kalp ve karaciğer gibi ultrasonla erişilebilir hedef organlara bölgeye özgü şekilde iletilmesini sağlamak için kullanılabilir. UTMD'de, hedef bir geni kodlayan negatif yüklü plazmid DNA vektörleri gibi biyoaktif moleküller, lipid mikro kabarcık kontrast ajanlarının katyonik kabuklarına eklenir; vektör bağlı mikro kabarcıklar intravenöz olarak veya doğrudan kalbin sol ventrikülüne uygulanabilir.

Daha büyük hayvanlarda, bunlar koroner bir kateter aracılığıyla, bir bekleme süresiyle veya bekleme süresi olmaksızın da iletilebilir. Dolaşımdan hedef organa gerçekleşen sonraki iletim, mikrobaloncukların rezonans frekansındaki akustik kavitasyon yoluyla optimal şekilde gerçekleşir. Mikrobaloncuk yıkımıyla üretilen mekanik enerjinin, hedeflenen bölgenin mikrovaskülatüründeki endotel hücrelerinde veya hücreler arasında geçici gözenek oluşumuna yol açması muhtemel görünmektedir.

Bu sauna parion etkisinin bir sonucu olarak, endotel hücrelere ve hücreler arasından geçişe yönelik transfeksiyon verimliliği artar ve transgen kodlayan vektörler ilgilenilen çevre dokuya yerleştirilebilir. Dolaşımda kalan plazma DNA'sı, kan mikrobaloncuk hazırlığındaki nükleazlar tarafından hızla degrade edilir. Glikoz fosfat tamponlu salin, diol gliserol üç fosfatidilkolin ve diol gliserol üç içeren hazırlanmış bir mikrobaloncuk stok çözeltisinden bir alikvot.

Fosfatidiletanolamin önce 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edilir. Isıtılan mikrobaloncuk solüsyonu daha sonra, gliserol ile hedef gen için bir ekspresyon konstrüktü kodlayan bir ila iki miligram saflaştırılmış plazma DNA'sı içeren 1,5 ml'lik bir mikrotüpe aktarılır. Final hacmi 500 µL olacak şekilde fosfat tamponlu salin eklenir.

Ardından mikro tüpteki hava, oktafloropropan gazı ile değiştirilir. Daha sonra mikro tüp, bir dental amalgamatörde 20 saniye boyunca şiddetle çalkalanır. İlk kullanım öncesi ekipman kalibrasyonu; uygun mekanik indeks ve darbe tekrarlamasını sağlamak için bir megahertz UTMD kavitasyon transdüserinin kalibre edilmesi gerekir.

Bir megahertz'lik bir daldırılabilir transdüser, bir güç amplifikatörü aracılığıyla bir dalga formu jeneratörüne bağlanır. Transdüser, şarj amplifikatörü üzerinden bir osiloskoba bağlanmış olan bir hidrofolona doğrudan yöneltilmiş, suyla dolu plastik bir kaba yerleştirilir; uygun görev döngüsünü ve mikrobaloncukları kavitasyona uğratmak için optimal olan mekanik indeksi elde etmek amacıyla dalga formu frekansı, genliği, burst döngüsü ve güç amplifikasyonu ayarlanabilir. Bu düzenekte, bir MEGAHERZ MİKROBALONCUK iletiminde yaklaşık 1.3'e eşdeğer bir mekanik indekse göre sistemi kalibre ettik; mikrobaloncuk iletimi öncesinde UTMD ve U-T-M-D-C 57 BL altı fare, IP enjeksiyon yoluyla 100 milligrams per kilogram ketamin ve five milligrams per kilogram ksilazin ile anestezi altına alınır.

Mikrokabarcık iletimi, kalbin sol ventrikülüne doğrudan enjeksiyonla veya kuyruk ven kateterizasyonu yoluyla intravenöz olarak uygulanır; doğrudan kardiyak enjeksiyon işlemi daha sonra gösterilecektir. Plazma DNA yüklü mikrokabarcık çözeltisinden 100 µL'ye kadar olan bir hacim, ultrasonik görselleştirme altında anterior dördüncü interkostal boşluktan yerleştirilen 30 gauge iğne ile kalbin sol ventrikülüne enjekte edilir. Sol interventriküler enjeksiyon sonucunda oluşan mikrokabarcık çözeltisi bolusu, farenin toraksine uzun aks görünümünde sabit bir konumda yerleştirilen Visual Sonics yüksek frekanslı ultrason transdüseri kullanılarak görselleştirilir.

Enjeksiyondan hemen sonra, hedeflenen bölgeye yönelik yıkımı gerçekleştirmek için, istenen organın doğrudan üzerinde tutulan ikinci, daha küçük boyutlu, düşük frekanslı 1,0 megahertz bir transdüser kullanılarak yaklaşık beş dakika boyunca mikrobaloncuk yıkımı gerçekleştirilir. Ultrason, 1,0 megahertz darbe tekrarlama frekansında, yaklaşık 1,3 ile 1,5'e karşılık gelen bir mekanik indeksle ve her 20 döngü için 100 milisaniyelik bir darbe tekrarlama periyoduyla karaciğere uygulanır veya darbe, farenin EKG'sine göre her dört ila altı kalp döngüsünde bir üç karelik ultrason patlamaları şeklinde senkronize edilebilir. Mikrobaloncukların kuyruk veni yöntemiyle iletilmesi için, fare plazmid içeren şırıngada olduğu gibi aynı şekilde anestezi altına alınır.

DNA bağlı mikrobaloncuklar, 27 gauge iğneli bir kuyruk ven kateterine bağlanır. Kuyruk ven kateteri, farenin kuyruğu boyunca uzanan sağ veya sol lateral venlerin distal üçte birlik kısmına yerleştirilir. Mikrobaloncukları içeren şırınga, önceden belirlenmiş bir hacimdeki çözeltiyi önceden belirlenmiş bir süre boyunca otomatik olarak uygulayacak olan bir infüzyon pompasına yerleştirilir.

UTMD'nin biyolüminesans analizi kapsamında, UTMD aracılı plazmid DNA iletiminin etkinliği, konstrükte kodlanmış genlere bağlı olarak çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Özellikle, in vivo biyolüminesans görüntüleme, gen ekspresyonunun varlığını ve süresini izlemenize olanak tanıyan bir yöntemdir. Bu yöntem, lüsiferaz gibi bir biyolüminesans raporlayıcı gen kodlayan plazmidle transfekte edilmiş farelerde kullanılır.

Enogen in vivo görüntüleme sistemi biyolüminesans için kullanılır. Görüntüleme işlemleri genellikle UTMD aracılı transfeksiyondan sonraki ilk gün tüm farelere uygulanır ve biyolüminesans gen ekspresyonu sistem aracılığıyla görsel olarak tespit edilemeyene kadar her üç ila dört günde bir tekrarlanır. Fareleri biyolüminesans görüntülemesine hazırlamak için, farelere öncelikle luciferase raporer probu Lucifer'in IP yoluyla enjeksiyonu yapılır.

Ardından fareler anestezi altına alınır. Yaklaşık üç dakika sonra, hayvan veya hayvanlar Xeno Gen görüntüleme odasına yerleştirilmeden önce Lucifer substratının biyodağılımı için yaklaşık 10 dakika beklenir ve acquisition sırasında tüm vücut görüntüleme taraması yapılır; fireplace'den yayılan fotonlar belirlenir. Her görüntü elde edildikten sonra, Luciferase de Lucifer fotokimyasal reaksiyonu sistem tarafından tespit edilir.

Xeno in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak, görünür lüminesans ilgi alanı ölçülmek ve nicelendirilmek için sistem yazılımı kullanılır.