Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

Bu yöntem, zamansal ve mekansal olarak ayrı ayrı gerçekleştirilen in vivo elektroporasyonun transgenik zebrafish hatlarıyla kombinasyonunun, transgen ekspresyonu için gelişmekte olan embriyonun belirli bölgelerinin nasıl seçici olarak hedeflenebileceğini göstermektedir. Gen ekspresyonunu ve ilgilenilen hücre tiplerini sınırlamak amacıyla enhancer trap yöntemiyle türetilmiş cal TA dört transgenik balık ile başlayın. Bu durumda, gelişimin belirli bir zamanındaki gelişmekte olan olfaktör bulb için, GFP raporlayıcı plazmidini in vivo olarak ön beynin ön ucuna enjekte edin ve DNA iletimini kolaylaştırmak için elektroporasyon gerçekleştirin; in vivo floresan görüntüleme ile elde edilen sonuçlar, transgenin gelişimin belirli bir zamanında ve sürecinde kesin lokalizasyonunu göstermektedir.

Bu tekniğin, tek hücre aşamasında plazmit enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ekspresyonun gelişmekte olan beynin belirli bir bölgesindeki spesifik hücre tiplerine yönlendirilmiş olmasıdır. Gelişmekte olan beynin belirli bölgelerinde hem transkripsiyon faktörü calt A four'un hem de reporter protein M cherry'nin ekspresyonunu sağlamak için, mediyatör güçlendirici tuzak (enhancer trap) yöntemiyle oluşturulmuş transgenik zebra balığı hattını kullanın. Yaklaşık %50 transgenik yavru elde etmek için, transgenik insert için heterozigot olan yetişkin balıkları vahşi tip balıklarla eşleştirin.

Şimdi, döllenmeden altı ila sekiz saat sonra başlayarak transgenik embriyoları 100 µM phenyl threa ile muamele edin. Pigment oluşumunu engellemek ve döllenmeden 24 ila 28 saat sonra floresan görüntülemeyi kolaylaştırmak için embriyoları PTU içermeyen yumurta suyuna aktarın ve bir floresan mikroskop altında, mikrodalgadaki mCherry ekspresyonu aracılığıyla transgenik embriyoları tanımlayın. Elektroporasyon tamponu artı trica içeren %0,5'lik düşük erime noktalı agarose çözeltisi hazırlayın ve ardından çözeltiyi dengeleyin.

34 ila 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre, 60 milimetrelik bir Petri kabının merkezine agro solüsyonundan yaklaşık 500 mikrolitre miktarında büyük bir damla yerleştirin. İnce pensler kullanarak, koriyona zarını transgenik embriyolardan çıkarın. Serbest kalan embriyoları, electroporasyon tamponu ve %0,02 trica anestezik içeren bir Petri kabına iki dakika boyunca aktarın.

Şimdi, altı ila sekiz anestezi altındaki embriyoyu, kesilmiş Michael yükleyici pipet uçlarını kullanarak hazırlanmış aros damlasına aktarın. Embriyoları, hepsinin aynı yöne baktığı ve dikey bir sıra halinde hizalandığı şekilde konumlandırın. İki ila üç milimetre buz içeren geniş bir Petri kabı kullanarak arosu dondurup embriyoları konumlarında sabitleyin.

Çözeltinin katılaşmış aros damlasını tamamen kapladığından emin olarak, trica eklenmiş elektroporasyon tamponu ile kabı doldurun. Enjeksiyon için fenol kırmızısı boyalı saflaştırılmış GFP ekspresyon plazmidini hazırlayın. Şimdi, bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak mikroenjeksiyon pipetlerini imal edin.

Enjeksiyon pipetine bir ila iki mikrolitre DNA plazmid çözeltisi ekleyin, ardından yüklü pipeti basınçlı enjeksiyon sisteminin pipet tutucusuna yerleştirip sabitleyin. Basınç darbeleri, pipet gelişmekte olan beynin ön ucuna bakarken kırmızı DNA çözeltisinin POF salınımını gerçekleştirene kadar, yüklü pipeti ıslatılmış bir kim wipe üzerinden hızla geçirerek geri itin. Plazma DNA çözeltisini, basınçlı enjeksiyon ile gelişmekte olan beynin ventriküllerine enjekte edin.

DNA'yı muhtemel olfaktör bulba komşu bir konuma doğru zorlayın. Ön beyin ventrikülünün anterior ucunda kırmızı boya açıkça görünene kadar DNA enjekte edin. DNA difüzyonunu ve seyreltilmesini önlemek için derhal elektroporasyon adımına geçin.

SD nine stimulator cihazını, 70 volt değerinde, beş milisaniyelik tekli elektroporasyon darbeleri üretecek şekilde ayarlayın. Elektrotları, pozitif elektrot embriyonun iç ucuna bitişik, negatif elektrot ise embriyo başının posterioruna gelecek şekilde konumlandırın.

SD dokuz stimülatörünün tek bir düğmesini kullanarak manuel olarak sekiz elektroporasyon darbesi başlatın. Her bir darbe arasını bir saniye ile ayırın. Embriyoların en az 10 dakika boyunca dinlenmesine izin verin.

Şimdi ince uçlu pens kullanarak, embriyolarla doğrudan temas etmekten kaçınarak nazikçe çevrelerini belirleyin. Ardından embriyoları agarlardan ayırın. Embriyoları yumurta suyuna geri koyun ve GFP ekspresyon analizi yapılana kadar 28 degrees Celsius'ta saklayın.

Embriyoları, daha önce olduğu gibi birkaç dakika boyunca 0,02% trica anestezikli yumurta suyuna, ancak daha küçük bir 35 milimetrelik Petri kabının merkezine aktarın. Büyük bir damla 0,5% düşük erime noktalı agar ve trica içeren yumurta suyu çözeltisi ekleyin. Şimdi, kesilmiş mikro yükleyici pipet uçlarını kullanarak bir adet anestezi altındaki embriyoyu bu agar damlasına ekleyin.

Dik bir mikroskop altında gelişmekte olan beynin dorsal görünümünü kolaylaştırmak için embriyoyu dik konuma getirin. Aro'yu buz üzerinde dondurun ve embriyo yönelimini korumak için kesilmiş mikro yükleyici uçlar kullanın. Son olarak, solüsyonun donmuş aro damlasını tamamen kapattığından emin olarak, kabı yumurta suyu ve trica karışımıyla doldurun.

Bu örnek, gelişmekte olan olfaktör bulbu hedeflemek için in vivo elektroporasyonun zamansal çözünürlüğünü, enhancer trap transgenik hatlar aracılığıyla sağlanan hücre tipine özgü ekspresyon ile birleştirmektedir. Transgenik enhancer trap hattı, fertilizasyon sonrası beşinci gündeki embriyoların hindbrain, cerebellum, forebrain ve olfaktör bulb bölgelerinde konstitütif m cherry ve calt A dört ekspresyonu göstermektedir. Önemli bir nokta olarak, elektroporasyondan dört gün sonra, GFP eksprese eden hücreler, olfaktör bulb mitral hücrelerinin tipik aksonal projeksiyonlarını sergilemektedir.

M Cherry sinyalleri ile GFP'nin daha düşük pozlama süreli görüntülerinin karşılaştırılması, GFP ekspres eden hücre gövdelerinin kısa saç tokası RNA (short hairpin RNA) konstrüktları kullanılarak gerçekten olfaktör bulba lokalize edildiğini göstermektedir. Bu prosedür, gelişmekte olan beyindeki belirli hücre tiplerinde fonksiyon kaybı indüklemek için de kullanılabilir.