Name: Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T14:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin, zebrafish koku soğanı nöronlarında hedefli gen ifadesi için in vivo elektroporasyon ve Gal4 tabanlı enhancer trap hatlarını nasıl birleştireceksiniz. Bu yöntem, gelişimsel sinirbilimde hassas hücre tipi spesifik manipülasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, John Horne (R15MH083221 NIMH) NIH R15 ALANI hibe yoluyla finanse edildi.

1. Transgenik embriyolar <ol><li> Burada zebrafish transpozon-aracılı arttırıcı tuzak yöntemi 8 yoluyla oluşturulan bir transgenik hattı kullanıyor. KalTA4, Gal4 transkripsiyonel aktivatör bir zebrafish optimize edilmiş sürümü ve kırmızı floresan proteini, mCherry: transgenik eklemek iki kodlama dizileri içerir. Endojen bir arttırıcı sırası kontrolü altında bu transgenik kaset ifade transgenik zebrafish arttırıcı tuzak yöntemi verim hatları. Böylece, belirli bir arttırıcı dizisi kimliğini bağlı olarak, her iki KalTA4 ve mCherry ifade, gelişmekte olan beynin belirli bölgelerde lokalize olur. Et (: Gal4TA4, UAS: zic4 mCherry) hzm5 doğrultusunda biz burada kullanmakta olduğunuz, burada özel bir önem ifade, arka beyin, ön beyin, çeşitli sitelere lokalize ve koku ampulü 8 (Şekil 1 bkz.) . Bu model, ifade ve genom içinde kaset lokalizasyonu göz önüne alındığında, transgenlerin (ayrıca bkz. Zic4 organizatörü 8 kontrolü altında olması tahmin edilmektedir <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ nörogörüntüleme / lines_distel / ana</a> ). </li><li> Yetişkin Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) transgenik eklemek için heterozigot hzm5 balıkları genellikle yaklaşık% 50 oranında transgenik yavrular önde gelen WT balık (AB) ile evlendirilen. (Transgenik yavruların daha yüksek bir yüzdesi, iki heterozigot evlendirilen olabilir.) </li><li> Pigment oluşumunu engellemek ve floresan görüntüleme kolaylaştırmak, transgenik embriyolar 6-8 hpf az 100 mcM N-phenylthiourea (PTU) başında tedavi için. </li></ol> 2. Montaj embriyolar <ol><li> 24-28 hpf, yumurta su PTU olmadan embriyo transferi. MCherry floresan mikroskop kullanılarak ifade transgenik embriyolar belirleyin. Ince forseps kullanılarak transgenik embriyolar koryonik membran çıkarın. 4: Transfer embriyolar elektroporasyon tampon artı% 0,02 tricaine [180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 5 mM Hepes, pH 7.2 Elektroporasyon Tampon] içeren Petri koryon kurtulmuş. Anestezi için 2 dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin. </li><li> Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek,% 0.5 'lik düşük erime noktalı agaroz elektroporasyon tampon artı tricaine bir çözüm hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 60 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 500 ul) yerleştirin. 6-8 anestezi embriyolar agaroz bu damla ekleyin. </li><li> Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu, hepsi aynı yöne bakan ve dikey bir satır dizilen bu tür embriyoların. Agaroz katılaşmaya ve pozisyon embriyolar tuzak için, 2-3 mm buz büyük bir Petri kabı üzerine çanak yerleştirin. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak, tabak elektroporasyon tampon artı tricaine sel. </li></ol> 3. Plazmid DNA ifade mikro-enjeksiyon <ol><li> Midi ve maxi-hazırlık plazmid izolasyon kiti (örneğin Qiagen) kullanılarak plazmid GFP ifade hazırlayın. Nihai konsantrasyonu 0.5 mg / ul steril su artı% 0.03 fenol kırmızısı plazmid askıya alınması. Burada anlatılan koku ampul hedef deney için, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (14 tandem UAS dizileri ve bazal balık organizatörü E1b) kontrolü altında EGFP kodlama sırası ile plazmid bir ifade kullanıyor. GFP ifade etmek mümkün olacak, transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade bu plazmid, sadece hücreleri kullanarak, bu yüzden, GFP hedeflenen ifade aracılık. Not: burada biz DNA enjeksiyonları, gelişmekte olan beynin diğer bölgeleri hedefleyen için geçerli olmalıdır görünüm için fenol kırmızısı kullanarak sürece bölgede ventriküller erişilen olabilir. Bodipy veya Quantam Nokta boyalar, floresan görselleştirme gerektiren diğer hücre türleri hedef için potansiyel floresan aydınlatma altında enjeksiyon görselleştirmek için kullanılan olabilir. </li><li> Mikroenjeksiyon pipetler ya yatay veya dikey bir pipet çektirmenin kullanılarak imal edilebilir. Isı ve çekme gücü ayarları çektirme, gözü tipi türüne bağlı olarak değişir ve cam kapiller tüplerin türü. Sutter P-30 dikey çektirmenin kullanarak, uzun, sivri, keskin pipetler filamentler ile ince duvarlı kapiller borosilikat cam üretmek için bir ısı ayarı 980 ve 960 çekme kuvveti [Sutter Enstrüman # BF100-78-10]. Bu ayarlar ile çekilmiş Microinjetion pipetler kapatılır ve enjeksiyondan önce kırık olmalı. </li><li> DNA plazmid çözüm 1-2 ul enjeksiyon pipet eklemek için bir Microloader pipet kullanın. </li><li> Mount vebasınçlı enjeksiyon sistemi pipet tutucu içine yüklenen pipet güvenli. </li><li> Basınç bakliyat, kırmızı DNA çözüm kabarık sürüm, çıkarana kadar ince forseps ile yüklenen pipet geri kırın. Alternatif olarak, ipuçları, hızlı bir şekilde bir batık, katlanmış laboratuvar Kimwipe nüfuz ederek geri kırılmış olabilir. Not: enjeksiyon pipetler başlangıçta kapatılır ve elle geri kırık olması gerekir, çünkü ucu boyutu ve enjeksiyon hacmi değişkendir. İdeal enjeksiyon pipetler 24 hpf embriyolar (40 psi az 100 ms enjeksiyon bakliyat) gelişmekte olan önbeyin ventrikül tamamen doldurmak için 3-5 enjeksiyon bakliyat gerektirir. </li><li> Plazmid DNA çözümü gibi DNA komşu zorla ve beynin koku alma ampul formu mukadder bölge içine ardalanmalı gelişmekte olan beyin ventriküller içine enjekte edilir. Olfaktör bulb önbeyin ventrikül en ön duvarı hücrelerinden elde edilir. Böylece, gelişmekte olan beynin anterior sonuna doğru pipet işaret olduğu gibi ventriküller içine enjeksiyon pipet takarak, basınçlı enjeksiyon DNA'sına ve ileriye dönük bir koku alma ampul komşu zorlar. Kırmızı boya önbeyin ventrikül anterior sonunda açıkça görünür oluncaya kadar DNA enjekte edilir. DNA DNA seyreltilmesi, hemen diffüz başlar, çünkü enjeksiyondan sonra mümkün olduğunca çabuk elektroporasyon adım (örneğin, 10 saniye içinde) devam etmek önemlidir. </li></ol> 4. Elektroporasyon <ol><li> Elektroporasyon Çim platin subdermal elektrotlar (Çim Teknoloji # E2) yapılan kendini inşa elektrotlar kullanılarak yapılmaktadır. Elektrotlar, elde tutulan bir prob ve son platin elektrot arasındaki mesafe 1 mm (inşaat ile ilgili detaylar için 9) olmalıdır. Kare dalga elektroporasyon bakliyat Çim SD-9 Stimülatör (Çim Teknolojisi, Model SD-9) elektrotlar bağlayarak üretilmektedir. </li><li> 70 volt tek, 5 ms elektroporasyon darbeleri üretmek için SD-9 stimülatörü ayarlayın. Elektrot, negatif elektrot embriyo kafasının arka ise pozitif elektrot, embriyo ön sonuna kadar yanında konumlandırılmış gibi yerleştirin. El ~ 1 sn her darbe ayıran, SD-9 stimülatörü tek mod anahtarı kullanılarak ~ 7-8 elektroporasyon bakliyat başlatın. Uygun gerilimler embriyoların yaş ve kullanılan gerilim kaynağı bağlı olarak değişecektir. Eski embriyolar elektroporasyon 7 başlatmak için yüksek gerilimi ise Genç embriyolar, embriyo zarar vermemek için daha düşük voltaj gerektirir. </li><li> Embriyoların agaroz onları kurtararak elektroporasyon sonra en az 10 dakika önce kurtarmak için izin verin. </li><li> Ince forseps kullanarak, embriyoların kendileri ile fiili temas kaçınarak nazikçe embriyoların anahat izleme agaroz embriyoların serbest. </li><li> Bir kere serbest (PTU ile gerekirse) embriyoların yumurta su geri. 28 saklayın ° C GFP ifade için görüntülü kadar. </li></ol> 5. Görüntüleme için Montaj embriyolar <ol><li> Yumurta su artı PTU yumurta su artı% 0,02 tricaine embriyo transferi. Anestezi için birkaç dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin. </li><li> Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek, yumurta su artı tricaine düşük erime noktası agaroz% 0.5 çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 35 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 300 ul) yerleştirin. Agaroz Bu düşüşün bir anestezi embriyo ekleyin. </li><li> Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu mümkün dik bir mikroskop (ters kapsamları farklı bir embriyo geometrisi gerektirir, gelişmekte olan beynin dorsal görselleştirmek için, dik olduğunu embriyolar ve görselleştirme izin aşağıdan farklı bir çanağı; 12). Buz 2-3 mm büyük bir Petri kabı üzerine çanağı yerleştirerek agaroz katılaşmaya. Re-yönelim ince forseps ile büyük olasılıkla yan embriyo üzerine düşmemesi sağlamak için katılaşma sırasında istenecektir. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, sel, tabak, yumurta su artı tricaine ile çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: GFP ifade elektroporasyon 6 saat sonra gibi erken olarak görülebilir olmasına rağmen, biz burada hedeflenen hücrelerin neurite yapısı yeterince gelişmiş olduğu gibi elektroporasyon 4 gün sonra bir embriyodan görüntüleri gösteriyor. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry (ve KalTA4) kurucu ifade görüntüler Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul embriyolarda 5 gün sonrası fertilizasyon (Şekil 1A ve 1C.) Embriyolar hedeflenmiş elektroporasyon (yukarıda açıklandığı gibi), gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri (Şekil 1B, 1D, 1E) ile sınırlı olduğunu göstermek GFP ifade tarafından kurulmuştur plazmid UAS-GFP ifade vardı. Sadece hücreleri transgenically ifade KalTA4 transkripsiyon faktörü UAS-GFP plazmid ifade etkinleştirmek için edebiliyoruz. Transgenik olmayan embriyolara plazmid bu Incorporation saptanabilir GFP ifadesi yol açmaz. Böylece, UAS-GFP ve gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri GFP münhasır ifade KalTA4 sürücü yerelleştirilmiş transgenik ifade hedeflenen elektroporasyon kombine eylem. GFP ifade hücreleri, koku alma ampul mitral hücreleri (Şekil 1B ve 1D) 10 tipik aksonal projeksiyonlar göstermektedir . Akson projeksiyonları görselleştirmek için, rakam 1B ve 1D görüntüleri hücre gövdeleri bölgenin aşırı maruz kalmış olduğu gibi yüksek düzeyde maruz kalan gerekiyordu. Daha düşük bir seviyede maruz kalma (Şekil 1E) GFP ifade hücre gövdeleri gerçekten koku ampul (gri çizgi koku ampul sınır işaretleri Şekil 1C ve 1E karşılaştırmak) lokalize olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. 5 dpf'e zebrafish embriyo koku ampul GFP ifade Hedeflenen. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul (A ve C, mCherry floresan kırmızı ile gösterilen) kurucu ifade görüntüler. MCherry Bu ifade, transgenik Gal4 ifade aracılık. UAS-GFP ekspresyon vektörü ile 28 hpf electroporated edilmiştir Embriyolar, A, yeşil gösterilen hedef, GFP 5 gün sonrası döllenme koku ampul (B, D ifadesi, ve E, GFP floresans aynı embriyo ekran ve C). Alt kısmında daha düşük bir pozlama görüntü (E) bu GFP ifade koku ampul hücre gövdeleri ile sınırlıdır. Gri çizgi koku ampul sınır gösterir. Parlak alan (gri ölçek), yeşil floresan (yeşil) ve kırmızı floresan (kırmızı) görüntüleri Olympus BX60 floresan mikroskobu ile.

<ol><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li>
<li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ways+to+admire+zebrafish%3A+progress+in+functional+genomics+research+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish%3A+a+method+for+time-resolved+loss-of-function%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li>
<li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers%3A+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li>
<li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li>
<li>Distel, M., Kö, ster, W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li>
<li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li>
<li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Schärer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada electroporated transgen ifade gelişmekte olan koku alma ampul hücrelerin belirli bir nüfus hedef arttırıcı tuzak Gal4 transgenik hat kullanan zebrafish in vivo elektroporasyon yöntemi bir tarif var. Bu yaklaşım arttırıcı tuzak transgenik hatları 8 aracılı hücre türüne özgü bir ifade ile, in vivo elektroporasyon 7 mükemmel zamansal çözünürlüğü birleştiriyor . Rağmen in vivo elektroporasyon koku ampul hedefleme açıklanan gelişmekte olan sinir sistemi 2-7 diğer bölgeleri hedef için kullanılabilir ve birçok farklı özel hücre tipleri veya dokuların Gal4 hedeflenen ifade arttırıcı tuzak hatlarına mevcuttur 8, 11. Tabii ki, bu elektroporasyon teknik Lexa veya Tet sistemleri 13, 14, 15 gibi diğer combinatioral genetik yaklaşımlar için de uygun olmalıdır. Elektroporasyon önemli bir avantajı, uygun bir Gal4-line kullanılabilir olduğunu verilen ek transgenik hatları yapmaya gerek olmadığını. Bu altı ay kaydeder. In vivo elektroporasyon nöronlar ve bunların öncüleri olan, sinir sistemi gelişimi belirli bir aşamasında ilgi 7 ne olursa olsun içine oligonükleotidler birleştirmek için sağlar. Bu temporal çözünürlük, önceki gelişim aşamalarında önemli işlevlere sahiptir hedef genleri ile ilgili sorunları aşmak için-fonksiyon kaybı analizi için özellikle avantajlıdır. Biz burada açıklamak yöntemi de RNAi oligonükleotidler veya yapıları ve morfolino anlamda anti-oligonükleotidler 4, 7 de dahil olmak üzere-fonksiyon kaybı reaktifler dahil etmek için kullanılabilir. Plazmid odaklı reaktifler, dominant-negatif protein ifade plazmid veya kısa saç tokası RNAi plazmid gibi hassas hücre tipine özgü ifade GFP ifade için buraya göstermiştir için izin Gal4 UAS kontrol altına olabilir.

Reaktifler: <ul><li> Agaroz, düşük erime noktası (Sigma, A9414) </li><li> Plazmid, midi ve maksi-hazırlık seti (örneğin Qiagen, # 12643] </li><li> Fenol kırmızı (Sigma, P3532) </li></ul> Ekipman: <ul><li> Kılcal cam filament ile; ID = 0.78 mm, OD = 1,0 mm (Sutter Instruments, # BF100-78-10) </li><li> Çim SD-9 Stimülatör (Grass Teknolojisi, Model SD-9) </li><li> Çim platin subdermal elektrotlar, düz iğne (Çim Teknoloji, # E2) </li><li> Micro-yükleyici pipet uçları (Eppendorf, # X22703R) </li><li> Pipet çektirmesi (örneğin Sutter, Model P-30) </li><li> Pipet çektirmesi (örneğin Sutter, Model P-30) </li></ul>

kombine kullanımı hedefleme koku ampul nöronlar in vivo elektroporasyon ve gal4 tabanlı enhancer trap zebra balığı hatları

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo elektroporasyon C olanlar da dahil olmak üzere, gelişmekte olan embriyolar belirli bölgelere ifade plazmid DNA, RNAi reaktifleri ve morfolino anti-sense oligonükleotidler sunmak için güçlü bir yöntemdir elegans, civciv, Xenopus, Zebra balığı, 1 ve fare. Zebra balığı, in vivo elektroporasyon bu reaktifler 2-7 teslimat için mükemmel bir mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip olduğu gösterilmiştir. Belirli bir gelişme aşamasında, bu reaktiflerin birleştirmek için izin verdiğinden bu yöntem zamansal çözünürlüğü önemlidir. Electroporated vektörleri ifade 6 saat içinde 7 nedeniyle oluşur Dahası, bu yöntem, transgenik yaklaşımlar daha zamanında . Tek bir hücrenin 2, 6 hedefleyen mekansal çözünürlüğü son derece hassas olabilir reaktifler, bir doku ya da yapı içinde belirli bir hücre popülasyonu içine dahil etmek için sık sık tercih edilir . Birden fazla hücreyi hedef, in vivo elektroporasyon embriyo belirli bir bölgeye teslimat için verimli Bununla birlikte, özellikle gelişmekte olan sinir sistemi içinde, bu özel hücre tipleri yalnızca mekansal ayrık elektroporasyon yoluyla hedef zordur. Alternatif olarak, artırıcı tuzak transgenik hatları transgenlerin 8 mükemmel hücre türüne özgü ifade sunuyoruz. Burada, özellikle zebrafish koku alma ampul nöronların gelişmekte olan hedef, in vivo elektroporasyon 7, 9 mekansal ayrık transgenik Gal4 tabanlı arttırıcı tuzak hatları 8 birleştiren bir yaklaşım açıklar . Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 (eski GA80_9) arttırıcı tuzak hattı daha önce bir zebrafish Beyin de dahil olmak üzere gelişmekte olan beynin birden fazla bölgede mCherry aracılı hedefli transgenik ifade görüntüler, optimize Gal4 (KalTA4) transkripsiyonel aktivatör 8 tarif serebellum, ön beyin, ve koku ampul. Özellikle GFP ifade koku ampul, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (UAS) kontrolü altında GFP kodlama sırası ile plazmid hedef için 24-28 saat sonrası fertilizasyon (hpf) önbeyin ön ucunu electroporated oldu. Bu yöntem önbeyin birden fazla bölgeye plazmid DNA içeriyor olsa da, GFP ifadesi yalnızca transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade hücrelerinde meydana gelir. Böylece GA080_9 transgenik hattı kullanarak, bu yaklaşım sadece gelişmekte olan koku alma ampul GFP ifade açtı. Koku ampul 10 mitral hücreler için daha önce açıklandığı gibi, bu yaklaşım ile hedeflenen GFP ifade hücreleri, tipik aksonal projeksiyonlar gösterdi . Bu yöntem aynı zamanda mekansal ve zamansal ayrık-fonksiyon kaybı analizi için bir yöntem sağlayacak kısa saç tokası RNA girişim ifade plazmid da dahil olmak üzere diğer reaktiflerin hedeflenen teslim için kullanılan olabilir.

Genetik manipülasyon zamansal ve mekansal çözünürlükte karıştırmayı ki biyolojik olayların spektrum belirler. Burada zamansal ve mekansal ayrık<em&gt; In vivo</emZebrafish transgenik hatları ile birlikte, özellikle gelişmekte olan koku alma ampul nöronlarda GFP transgen ifadesi neden&gt; elektroporasyon,.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

In vivo elektroporasyon; DNA ekspresyon plazmidlerini, RNAi reaktiflerini ve morfolino anti-sens oligonükleotidlerini spesifik bölgelere iletmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir...

Bu yöntem, zamansal ve mekansal olarak ayrı ayrı gerçekleştirilen in vivo elektroporasyonun transgenik zebrafish hatlarıyla kombinasyonunun, transgen ekspresyonu için gelişmekte olan embriyonun belirli bölgelerinin nasıl seçici olarak hedeflenebileceğini göstermektedir. Gen ekspresyonunu ve ilgilenilen hücre tiplerini sınırlamak amacıyla enhancer trap yöntemiyle türetilmiş cal TA dört transgenik balık ile başlayın. Bu durumda, gelişimin belirli bir zamanındaki gelişmekte olan olfaktör bulb için, GFP raporlayıcı plazmidini in vivo olarak ön beynin ön ucuna enjekte edin ve DNA iletimini kolaylaştırmak için elektroporasyon gerçekleştirin; in vivo floresan görüntüleme ile elde edilen sonuçlar, transgenin gelişimin belirli bir zamanında ve sürecinde kesin lokalizasyonunu göstermektedir.Bu tekniğin, tek hücre aşamasında plazmit enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ekspresyonun gelişmekte olan beynin belirli bir bölgesindeki spesifik hücre tiplerine yönlendirilmiş olmasıdır. Gelişmekte olan beynin belirli bölgelerinde hem transkripsiyon faktörü calt A four'un hem de reporter protein M cherry'nin ekspresyonunu sağlamak için, mediyatör güçlendirici tuzak (enhancer trap) yöntemiyle oluşturulmuş transgenik zebra balığı hattını kullanın. Yaklaşık %50 transgenik yavru elde etmek için, transgenik insert için heterozigot olan yetişkin balıkları vahşi tip balıklarla eşleştirin.Şimdi, döllenmeden altı ila sekiz saat sonra başlayarak transgenik embriyoları 100 µM phenyl threa ile muamele edin. Pigment oluşumunu engellemek ve döllenmeden 24 ila 28 saat sonra floresan görüntülemeyi kolaylaştırmak için embriyoları PTU içermeyen yumurta suyuna aktarın ve bir floresan mikroskop altında, mikrodalgadaki mCherry ekspresyonu aracılığıyla transgenik embriyoları tanımlayın. Elektroporasyon tamponu artı trica içeren %0,5'lik düşük erime noktalı agarose çözeltisi hazırlayın ve ardından çözeltiyi dengeleyin.34 ila 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre, 60 milimetrelik bir Petri kabının merkezine agro solüsyonundan yaklaşık 500 mikrolitre miktarında büyük bir damla yerleştirin. İnce pensler kullanarak, koriyona zarını transgenik embriyolardan çıkarın. Serbest kalan embriyoları, electroporasyon tamponu ve %0,02 trica anestezik içeren bir Petri kabına iki dakika boyunca aktarın.Şimdi, altı ila sekiz anestezi altındaki embriyoyu, kesilmiş Michael yükleyici pipet uçlarını kullanarak hazırlanmış aros damlasına aktarın. Embriyoları, hepsinin aynı yöne baktığı ve dikey bir sıra halinde hizalandığı şekilde konumlandırın. İki ila üç milimetre buz içeren geniş bir Petri kabı kullanarak arosu dondurup embriyoları konumlarında sabitleyin.Çözeltinin katılaşmış aros damlasını tamamen kapladığından emin olarak, trica eklenmiş elektroporasyon tamponu ile kabı doldurun. Enjeksiyon için fenol kırmızısı boyalı saflaştırılmış GFP ekspresyon plazmidini hazırlayın. Şimdi, bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak mikroenjeksiyon pipetlerini imal edin.Enjeksiyon pipetine bir ila iki mikrolitre DNA plazmid çözeltisi ekleyin, ardından yüklü pipeti basınçlı enjeksiyon sisteminin pipet tutucusuna yerleştirip sabitleyin. Basınç darbeleri, pipet gelişmekte olan beynin ön ucuna bakarken kırmızı DNA çözeltisinin POF salınımını gerçekleştirene kadar, yüklü pipeti ıslatılmış bir kim wipe üzerinden hızla geçirerek geri itin. Plazma DNA çözeltisini, basınçlı enjeksiyon ile gelişmekte olan beynin ventriküllerine enjekte edin.DNA'yı muhtemel olfaktör bulba komşu bir konuma doğru zorlayın. Ön beyin ventrikülünün anterior ucunda kırmızı boya açıkça görünene kadar DNA enjekte edin. DNA difüzyonunu ve seyreltilmesini önlemek için derhal elektroporasyon adımına geçin.SD nine stimulator cihazını, 70 volt değerinde, beş milisaniyelik tekli elektroporasyon darbeleri üretecek şekilde ayarlayın. Elektrotları, pozitif elektrot embriyonun iç ucuna bitişik, negatif elektrot ise embriyo başının posterioruna gelecek şekilde konumlandırın.SD dokuz stimülatörünün tek bir düğmesini kullanarak manuel olarak sekiz elektroporasyon darbesi başlatın. Her bir darbe arasını bir saniye ile ayırın. Embriyoların en az 10 dakika boyunca dinlenmesine izin verin.Şimdi ince uçlu pens kullanarak, embriyolarla doğrudan temas etmekten kaçınarak nazikçe çevrelerini belirleyin. Ardından embriyoları agarlardan ayırın. Embriyoları yumurta suyuna geri koyun ve GFP ekspresyon analizi yapılana kadar 28 degrees Celsius'ta saklayın.Embriyoları, daha önce olduğu gibi birkaç dakika boyunca 0,02% trica anestezikli yumurta suyuna, ancak daha küçük bir 35 milimetrelik Petri kabının merkezine aktarın. Büyük bir damla 0,5% düşük erime noktalı agar ve trica içeren yumurta suyu çözeltisi ekleyin. Şimdi, kesilmiş mikro yükleyici pipet uçlarını kullanarak bir adet anestezi altındaki embriyoyu bu agar damlasına ekleyin.Dik bir mikroskop altında gelişmekte olan beynin dorsal görünümünü kolaylaştırmak için embriyoyu dik konuma getirin. Aro'yu buz üzerinde dondurun ve embriyo yönelimini korumak için kesilmiş mikro yükleyici uçlar kullanın. Son olarak, solüsyonun donmuş aro damlasını tamamen kapattığından emin olarak, kabı yumurta suyu ve trica karışımıyla doldurun.Bu örnek, gelişmekte olan olfaktör bulbu hedeflemek için in vivo elektroporasyonun zamansal çözünürlüğünü, enhancer trap transgenik hatlar aracılığıyla sağlanan hücre tipine özgü ekspresyon ile birleştirmektedir. Transgenik enhancer trap hattı, fertilizasyon sonrası beşinci gündeki embriyoların hindbrain, cerebellum, forebrain ve olfaktör bulb bölgelerinde konstitütif m cherry ve calt A dört ekspresyonu göstermektedir. Önemli bir nokta olarak, elektroporasyondan dört gün sonra, GFP eksprese eden hücreler, olfaktör bulb mitral hücrelerinin tipik aksonal projeksiyonlarını sergilemektedir.M Cherry sinyalleri ile GFP'nin daha düşük pozlama süreli görüntülerinin karşılaştırılması, GFP ekspres eden hücre gövdelerinin kısa saç tokası RNA (short hairpin RNA) konstrüktları kullanılarak gerçekten olfaktör bulba lokalize edildiğini göstermektedir. Bu prosedür, gelişmekte olan beyindeki belirli hücre tiplerinde fonksiyon kaybı indüklemek için de kullanılabilir.

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Bu videoda, genetik olarak modifiye edilmiş somatosensoriyel nöronları aktive ederek ve ortaya çıkan davranışsal yanıtı yüksek hızlı bir video kamera ile kaydederek optogenetik teknikler açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Optogenetiği: Larva Davranışsal Tepkilerini İncelemek için Genetik Olarak Değiştirilmiş Somatosensoriyel Nöronun Aktive Edilmesi

Bu video, floresan kalsiyum indikatör komplekslerini eksprese eden nöronları ile kalsiyum indikatör tabanlı floresan görüntüleme kullanarak transgenik zebra balığı larvalarında görsel av tespitini inceleme yöntemini göstermektedir.

Transgenik Zebra Balığı Larvasında Av Tarafından Uyarılan Nöronal Aktivitenin İncelenmesi

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra...

Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Optogenetic teknikleri mümkün davranışına özgü nöronların katkısı çalışma yaptık. Biz bir diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer ile channelrhodopsin varyant (şef) ifade ve yüksek hızlı video kamera ile ortaya çıkardı davranışların kaydedilmesi tek somatosensoriyel nöronlar aktive larva zebrafish bir yöntem açıklanmaktadır.

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Öğrenin, zebrafish koku soğanı nöronlarında hedefli gen ifadesi için in vivo elektroporasyon ve Gal4 tabanlı enhancer trap hatlarını nasıl birleştireceksiniz. Bu yöntem, gelişimsel sinirbilimde hassas hücre tipi spesifik manipülasyon sağlar.

Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

Daha fazla video keşfet