Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

Bu prosedürün genel amacı; elektromotilite, yavaş motilite ve akustik frekanslarda bükülme dahil olmak üzere dış tüy hücresi (OHC) motil yanıtlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bu işlem, öncelikle Gine domuzları, fareler veya diğer memeli hayvanlardan temporal kemiklerin hasat edilmesi ve kokleayı açığa çıkarmak için bullanın açılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda koklea Lebovits L 15 içerisine daldırılır; kemik kabuğun apikal bölgesi, spiral ligament ve stria vascaya çıkarılır ve Corti organı uzaklaştırılır.

Cort organının 1 mg/mL kollajenaz içinde beş dakika inkübe edilmesinin ardından, organ 50 µL'lik bir Hamilton şırıngası kullanılarak kayıt haznesine aktarılır ve hücreler, iğne üzerinden geri akış yaptırılarak ayrıştırılır. Daha sonra kayıt haznesi, dışsal bir alternatif elektrik alanı ile hücre stimülasyonu ve izole dış tüy hücrelerinin motil yanıtlarının yüksek hızlı bir kamera ile video kaydı için mikroskoba taşınır. Son olarak; dış tüy hücreleri, elektromotilite, yavaş motilite ve akustik frekanslardaki bükülme, bilgisayar destekli görüntü analizi ile değerlendirilebilir.

Bu prosedüre, Guinea pigleri, fareler veya diğer memeli hayvan modellerinden temporal kemikleri hasat ederek başlayın. Ardından, temporal kemikleri yan keski kullanarak açın. Kokleayı açığa çıkarmak için fazla kemiği dikkatlice uzaklaştırın, kokleanın kemik kabuğunu sağlam tutun ve bunu livi L 15 içine daldırın.

Mikroskop altında, kokleanın apikal bölgesini açın. Kurutucuyu, VASI'leri ve spiral ligamenti bir skalpel ucu, mikro uçlu bir prob veya ince bir cımbızla uzaklaştırın. Organ of Corti'yi koklear modius'tan cımbızla çıkarın.

Ardından kokleayı, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1 mg/mL kollajenaz içerisinde bekletin. Eğer kokleanın bazal kıvrımlarından tüy hücreleri gerekiyorsa, kokleanın tabanını örten kemikli kabuğu kürdanla çıkarın ve skalpel bıçağını kullanarak spirali temporal kemikten ayırın. Corti organını çıkarmadan önce, Corti organını 50 µL'lik bir Hamilton şırıngası kullanarak kayıt odasına aktarın. Daha sonra, hücreleri iğne aracılığıyla geri akıtarak (reflux) disosiye edin.

Burada, harici alternatif elektrik alanı jeneratörünün şeması ile görüntü yakalama sistemi, kontrol devreleri ve House Ear Institute'un mühendislik merkezinde özel olarak uygulanan yazılım arasındaki bağlantılar yer almaktadır. Bu deneyde kullanılan deneysel düzenek, alternatif LED tabanlı bir aydınlatma sistemine ve iki elektronik mikro manipülatöre sahip bir Axia vert 1 3 5 TV ters mikroskobundan oluşmaktadır. Mikroskop üzerinde üç kamera raporu bulunmaktadır; teleport kısmında, yüksek çözünürlüğe sahip olan ve 100,000 FPS'ye kadar yüksek frekanslarda görüntü yakalayan, PC kontrollü ultra yüksek hızlı bir photo tron, fast cam X 10 24 PCI kamera yer almaktadır.

Yüksek hızlı kamera tarafından sağlanan görüntüler doğrudan bilgisayar monitöründen izlenir. Oküler portundaki ek bir standart CCD kamera, yüksek çözünürlüklü bir monitöre bağlıdır. Ön porttaki geleneksel bir dijital fotoğraf makinesi, sabit karelerin yakalanmasını sağlar; aynı bilgisayarda çalışan yerel yazılım ise yüksek hızlı kameranın tetikleyicisini, aydınlatma sistemini ve harici alternatif elektrik alanı düzeneğini kontrol eder.

Elektrikli bir mikromanipülatör üzerindeki uç mesafesi 0,8 milimetre olan, 0,25 milimetre çaplı iki gümüş telden oluşan iki elektrot. Ardından, harici bir elektrot kullanarak elektrik alanını kalibre edin. Bu elektrot, farklı noktalardaki elektrik potansiyelini ölçerek elektrik alanının bir haritasını oluşturur.

Tek bir izole dış tüy hücresi, boyuna ekseni uygulanan alternatif elektrik alanına paralel olacak şekilde elektrot uçları arasına yerleştirilirse, elektrik alanıyla aynı frekansta uzayıp kısalacak şekilde hareket eder. Örneğin, burada 50 hertz ile stimüle edilen ve saniyede 1000 kare hızında kaydedilen bir hücre gösterilmektedir. Bir sonraki görüntü ise dört kilohertz ile stimüle edilen ve saniyede 18.000 kare hızında kaydedilen bir hücreyi göstermektedir.

Hücre alana dik olarak yerleştirilirse, farklı bir dış tüy hücresi yanıt bükülmesi gözlemlenebilir ve incelenebilir. Örneğin bu hücre, uzun eksenine dik bir elektrik alanla 50 hertz ile stimüle edildiğinde bükülmektedir. Dış tüy hücreleri, elektriksel olmayan stimülasyonlara yanıt olarak şekil değişiklikleri gösterebilir.

Bu yanıta yavaş motilite denir ve bu teknikle incelenebilir. Dört farklı protokol arasından farklı stimülasyonlar seçin. Birincisi sürekli tek frekanstır.

Kendi yapımımız olan kontrol yazılımında kırmızı dairelerle belirtilen uyaran modu, frekansı, genliği ve dalga tipinin seçilebildiğine dikkat edin. İkinci stimülasyon protokolü, burst uzunluklarının ve burstler arasındaki boşlukların ayarlanabildiği burstlü tek frekanstır. Üçüncüsü ise başlangıç ve bitiş frekanslarının ayarlanabildiği lineer taramadır.

Dördüncü stimülasyon protokolü, farklı stimülasyon modlarının kombinasyonuna olanak tanıyan çoklu stimülasyondur. İlgili parametreler seçildikten sonra, kontrol yazılımı sistemi yapılandırır ve operatörün bilgisayar ekranındaki tek bir düğmeye tıklayarak ışıkla senkronize video kaydını ve hücre stimülasyonunu başlatmasına imkan tanır. Bu videoda, izole dış tüy hücreleri, boyuna eksenlerine sırasıyla paralel veya transversal olan harici bir alternatif elektrik alanla stimüle edildiklerinde uzunluk veya eğriliklerinde değişiklikler göstermektedir.

Dış tüy hücrelerinin yanıtları, pro analysts yazılımının özellik izleme fonksiyonu kullanılarak çevrimdışı olarak analiz edilir; burada 50 hertz frekansta uyarılmış ve saniyede 1000 kare hızında kaydedilmiş bir dış tüy hücresi gösterilmektedir. Yazılım, burada hücre kısalması sırasında gösterildiği gibi, iki nokta arasındaki mesafeyi kare kare sağlar. Kırmızıyla işaretlenmiş kutiküler plak olarak belirtilen apeks ile yeşil ile işaretlenmiş bazal pol olarak belirtilen hücre tabanı arasında seçilen noktalar arasındaki mesafe daha küçüktür ve hücre uzamasıyla birlikte artar; yazılım, dış tüy hücresi uzunluğundaki değişimlerin kare kare analizini gerçekleştirir.

Görüntünün altındaki panel, hareketin izini göstermektedir. Bu örnekte, toplam değişim uzunluğu yaklaşık 6,5 pikseldir. Burada, hücre kenarının tespit edilebildiğini ve optik kesit alanının pro analys yazılımındaki kontur takip fonksiyonu ile otomatik olarak ölçülebildiğini gösteren bir örnek yer almaktadır.

Bu deneyde, polistiren mikroküreler banyo çözeltisine rastgele eklenir ve plazma membranına sıkıca tutunur. Farklı mikroküreler eş zamanlı olarak seçilebilir ve yazılım bunların tamamını kare kare otomatik olarak takip edebilir. Bu sayede hücreler bölümlere ayrılabilir ve her bir bölümün hareketliliği bağımsız olarak değerlendirilebilir.

Hücrenin yan kenarlarında yer alan mikro küreler seçilerek, her bir segmentin uzunluğundaki değişimler ve bir segmentin diğerine göre açısındaki değişimler bağımsız olarak değerlendirilebilir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde üç saat içinde tamamlanabilir.

Elbette, kaydedilen videoların çevrimdışı analizi için ek süre gereklidir. Ancak, uygun bir yazılımla bu analiz, video başına yaklaşık üç saat daha sürede tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; elektromotilite, yavaş motilite ve akustik frekanslarda bükülme dahil olmak üzere, dış tüy hücresi motil yanıtlarının nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.