İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan karaciğer biyolojisini in vitro olarak incelemek için homojen seviyelerde insan hepatositleri üretmektir. Bu, insan embriyonik kök hücrelerinin veya insan ESC'lerinin A ve WINT'te aktif olan fizyolojik uyaranları kullanarak kesin endoderme sürülmesiyle başlatılır, A.As ikinci adım kesin endoderm, hepatik endoderme oldukça verimli bir şekilde sürülür. Daha sonra, insan ESC'den türetilmiş hepatik endoderm, fonksiyonel insan hepatositleri üretmek için in vitro olarak olgunlaştırılır.

PCR Western blotlama, immünofloresan, Eliza ve ilaç metabolizmasından elde edilen sonuçlar, bu yöntemin hepatositleri insan ESC'lerinden yaklaşık %90'lık bir verimlilikle elde ettiğini göstermektedir. Bu teknikle, teorik olarak, kayda değer düzeyde insan karaciğer fonksiyonu sergileyen tükenmez birincil insan hepatositleri üretebiliriz. Gelecekte, bu, ilaç toksisitesinin doğru bir şekilde tahmin edilmesine fayda sağlayacak ve insan karaciğeri desteği sağlayacaktır. İşin püf noktası, güneş farklılaşmasını ve insan hücrelerinin çekirdek yoğunluğunu sağlamaktır.

Homojen hücre popülasyonu oluşturmak için çekirdek hücre yoğunluğu gerekli olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için uluslararası alanda dört tesiste 15'ten fazla kişiyi eğittik. Bir insan embriyonik kök hücre kültürü ile başlayın ve temel FGF ile desteklenmiş fare embriyonik fibroblastları şartlandırılmış ortam ORM cm ile matrigel kaplı plakalar üzerinde çoğaltın.

Hepatik farklılaşmadan önce muhafaza edilen insan ESC'lerini dikkatli bir şekilde karakterize etmek önemlidir. Örneğin, bu hücreler insan ESC morfolojisi sergiler. Ayrıca pluripotent kök hücre belirteçlerini, OCT dört ve nano'yu pozitif kontrol H yedi insan ESC hattı ile karşılaştırılabilir seviyelerde ifade ederler.

Ek olarak, insan ESC'leri SS EEA dört için pozitiftir. İnsan E ESC'leri %30 ila %60 co akıcılığına ulaştığında, ME CM'yi yeni hazırlanmış farklılaşma ortamıyla değiştirin. Hepatik farklılaşmayı başlatmak için, ortam üç gün boyunca her 24 saatte bir değiştirilmelidir.

Üç gün sonra, hücreler endodermal bir fenotipe doğru farklılaşmaya başladıklarında üçgen bir görünüm alırlar. Ortamı SR DMSO farklılaşmasına geçirin. Dört ila beş gün boyunca orta kültür.

Ortamı her 48 saatte bir değiştirmek. Bu beş günlük süreyi takiben hücreler, hepatik hücrelerin karakteristik özelliği olan poligonal bir görünüm almaya başlayacaktı. İnsan ESC'sinin hepatik endoderm'e farklılaşması, dokuzuncu güne kadar bir dizi derin morfolojik değişiklikle yansıtılır.

Ayrıca, dokuz günlük zaman seyri boyunca Octa dördün ifadesi giderek azalır. Buna karşılık, bir FP ve albüminin karaciğer transkriptleri yedinci günden itibaren artar. Hücreleri olgunlaştırarak ve her 48 saatte bir taze besiyeri ile dokuz gün boyunca son besiyerinde hepatik fenotipi koruyarak devam edin.

Son olarak, hepatik endoderm fonksiyon testini kantitatif olarak değerlendirmek için dikenli üçgen bir şekilden poligonal bir görünüm sergileyen karakteristik bir karaciğer morfolojisine kademeli morfolojik değişiklikler için kültürlenmiş hücreleri faz kontrast mikroskobu ile izleyin. Sitokrom P dört 50 enzimatik aktivite için, özellikle SIP üç A dört veya SIP bir A iki. İlk kuluçka günü 17.

İnsan ESC'den türetilmiş hepatik endoderm hücreleri, üçlü reaksiyonlar gerçekleştiren spesifik substrat ile. Doku kültürü ortamını negatif kontrol inkübasyonu olarak 37 santigrat derecede beş saat boyunca kullanmayı unutmayın. Süpernatanları toplayın ve üreticinin talimatlarında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bazal enzimatik aktivitenin nispi seviyelerini ölçün.

Şimdi, her numune için, A-B-C-A-S tarafından belirlenen miligram protein başına enzimatik aktiviteyi hesaplayın. Hepatik endodermin in vitro olgunlaşması için bu yöntemle türetilen tipik kültürlerin immün boyaması. Üç insan karaciğer belirtecinin, albümin a FP ve ein'in homojen ekspresyonunu gösterin.

Bu videoyu izledikten sonra, insan ve öğrenme kök hücrelerini hepatositlere nasıl verimli bir şekilde ayırt edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, milyon hücre başına yaklaşık iki buçuk dakikalık bir taahhütle günlük olarak yapılabilir. Farklılaşma sürecinde morfolojik değişiklikleri günlük olarak kontrol etmek çok önemlidir.