Name: İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden hepatosit üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirmeyi. Bu teknik, karaciğer biyolojisi ve ilaç toksisitesi araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr Hay RCUK Bursu tarafından desteklenen Dr West Cerrahi Anabilim Dalı tarafından desteklenen, Dr Medine BHF Core Fonundan hibe tarafından desteklenen, Sayın Baltasar Lucendo-Villarin bir MAM Doktora Studenship tarafından desteklenmiştir. Dr Zhou, Çin Hükümeti bursu ile desteklenmiştir.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz insan HLCs ölçeklenebilir seviyelerini oluşturmak için basit, homojen ve in vitro yüksek oranda tekrarlanabilir bir model geliştirdik . Bizim modelimiz bir dizi dış işbirliği laboratuarları tarafından onaylanmıştır. Biz rutin olarak gelişim belirteçler ve karaciğer özel fonksiyonel testlerinin (çoğu ticari olarak mevcuttur) ev araç kutusu kullanılarak kök hücre elde edilen HLCs karakterize eder. Sürecinde önemli aşamaları şunlardır: bakım pluripotency kök hücre, kök hücre farklılaşması kesin endoderm yönlen...

Matrigel kaplama plakaları ve şişeler <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, İngiltere); -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C. </li><li> Doku kültürü plakaları (iyi 6, 12 iyi, Corning, İngiltere) </li><li> Doku kültürü şişesi (Bacalı 25 cm2, Corning, İngiltere) </li></ol> hESC Bakım <ol><li> Fare embriyonik fibroblast klimalı ortamda (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, ABD); mağaza -20 ° C </li><li> BSA solüsyonu (50 ml, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); 4 mağaza ° C </li><li> İnsan temel fibroblast büyüme faktörü (100 mikrogram, Peprotech, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li></ol> Kollajenaz ile Pasajlanması hESC <ol><li> HESC konfluent iyi veya şişesi. </li><li> Uygun olarak Matrigel kaplı kuyulardan veya cam şişeler. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (MgCl 2, CaCl 2) (500 mL Gibco, Invitrogen, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Kollajenaz IV (1 g, Gibco, Invitrogen, Birleşik Krallık), 4 mağaza ° C </li><li> Fare embriyonik fibroblast klimalı ortamda (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, ABD). </li><li> İnsan temel fibroblast büyüme faktörü (100 mikrogram, Peprotech, ABD). </li></ol> Hepatik endoderm hESC farklılaşma <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); mağaza, 4 ° C </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, İngiltere); mağaza -20 ° C </li><li> Aktivin A (2 mg, Peprotech, ABD); -20 mağaza ° C </li><li> Rekombinant fare Wnt3a (2 mcg, R &amp; D Systems, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Sigara esansiyel amino asitleri (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C </li><li> β-mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); 4 mağaza ° C </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın </li><li> Leibovitz L-15 kültür vasatı (500 ml, SigmAldrich, İngiltere); 4 mağaza ° C </li><li> Tryptose fosfat suyu (100 ml, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); 4 mağaza ° C </li><li> Fetal sığır serumu, inaktive ısı (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Hidrokortizon 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, İngiltere); -20 ° C&#39;de muhafaza </li><li> İnsülin (sığır pankreas) (100 mg, Sigma Aldrich, İngiltere); mağaza -20 ° C </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Askorbik asit (25 g, Sigma Aldrich, Birleşik Krallık); mağaza -20 ° C </li><li> İnsan HGF (10 mg, Peprotech, ABD), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> Rekombinant İnsan onkostatin M (OSM) (50 mikrogram, R &amp; D Systems, ABD); -20 mağaza ° C </li><li> Şırınga filtre ünitesi 0.22 mikron (Millipore, Birleşik Krallık) tahrik </li></ol> HESC türetilmiş Karaciğer Endoderm Karakterizasyonu Immün <ol><li> Fosfat buffer salin (MgCl 2, CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); stooda sıcaklığında yeniden. </li><li> PBST, PBS 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK) ile yaptı. </li><li> Paraformaldehit (PFA) (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), mağaza -20 ° C, PBS içinde oluşur </li><li> Gliserol (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Tris Bankası (Sigma-Aldrich, Birleşik Krallık), oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Etanol </li><li> Serum (Serotech ABD, Birleşik Krallık), -20 ° C&#39;de saklayın </li><li> İkincil Antikor, Alexa Fluorophores (Moleküler Probları, Invitrogen, Birleşik Krallık). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) üretici talimatlarına göre Tris HCL ve gliserol oluşur. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK), bir 1:1000 dilüsyon MOWIOL çözüm eklenir. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> İlköğretim antikorlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antijen * </td><td> Tip </td><td> Satıcı </td><td> Seyreltme </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-Cadherin </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> alfa-fetoprotein </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonal Fare </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonal Fare </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekonder antikorlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare FITC konjuge </td><td> Monoklonal Keçi </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). HESC kaynaklı karaciğer endoderm immün için kullanılan antikorlar, konsantrasyonları ve şirketlerin geliştirdiği türlerin satın alınır. Karaciğer Endoderm ve Normale Fonksiyonel Analiz (mg protein başına) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kitleri ve luminometre (Promega, USA). </li><li value="1"> Beyaz düz dipli 96 iyi tahlil plaka (BD Biosciences, Birleşik Krallık). </li><li> BCA Testi Kiti (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Şeffaf 96 iyi tahlil plaka (Iwaki, İngiltere) </li></ol>

İnsan embriyonik kök hücre popülasyonlar hepatosit gibi hücreleri sağlam nesil

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Modelleme insan ilaç zehirlenmesi ilerlemelere rağmen, birçok bileşikleri klinik çalışmalar sırasında beklenmeyen yan etkiler nedeniyle başarısız olur. Klinik çalışmaların maliyeti büyük, bu nedenle daha fazla öngörü toksikoloji ekranlarında geliştirilen ve ilaç geliştirme (Greenhough ve ark 2010) başlarında konuşlanmış olması çok önemlidir. İnsan hepatositler ilaç toksisitesinin değerlendirilmesi için altın standart model temsil eder, ancak değişken fonksiyon gösteren sınırlı bir kaynaktır. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiştir hücre hatları ve hayvansal doku modelleri kullanımı rutin bolluğu nedeniyle istihdam edilmektedir. Iki kaynaktan bilgilendirici olsa da, yetersiz fonksiyonu, türün değişkenliği ve / veya kültür istikrarsızlık (Dalgetty ve ark 2009) sınırlıdır. Pluripotent kök hücreler (PSC&#39;leri) hücreleri gibi insan hepatosit cazip bir alternatif kaynak (HLCs) (Medine ve ark 2010). PSC&#39;ler yetişkin bulunan tüm somatik hücre türleri için kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve böylece temsilfarklılaşmış hücrelerin bir potansiyel olarak bitmez tükenmez bir kaynak. Biz otomasyon ve verim fonksiyonel insan HLCs (Fletcher ve ark 2008; Hannoun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 ve Hay ve ark 2011 Hay ve ark 2008) için uygun, yüksek verimli, basit bir prosedür geliştirdik. Biz teknoloji, hastalık modelleme, ekstra bedensel cihazlar inşaat ve muhtemelen hücre nakli tedaviler ilaç keşfi için HLCs ölçeklenebilir üretimine yol olacağına inanıyorum.

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan karaciğer biyolojisini in vitro olarak incelemek için homojen seviyelerde insan hepatositleri üretmektir. Bu, insan embriyonik kök hücrelerinin veya insan ESC'lerinin A ve WINT'te aktif olan fizyolojik uyaranları kullanarak kesin endoderme sürülmesiyle başlatılır, A.As ikinci adım kesin endoderm, hepatik endoderme oldukça verimli bir şekilde sürülür. Daha sonra, insan ESC'den türetilmiş hepatik endoderm, fonksiyonel insan hepatositleri üretmek için in vitro olarak olgunlaştırılır.PCR Western blotlama, immünofloresan, Eliza ve ilaç metabolizmasından elde edilen sonuçlar, bu yöntemin hepatositleri insan ESC'lerinden yaklaşık %90'lık bir verimlilikle elde ettiğini göstermektedir. Bu teknikle, teorik olarak, kayda değer düzeyde insan karaciğer fonksiyonu sergileyen tükenmez birincil insan hepatositleri üretebiliriz. Gelecekte, bu, ilaç toksisitesinin doğru bir şekilde tahmin edilmesine fayda sağlayacak ve insan karaciğeri desteği sağlayacaktır. İşin püf noktası, güneş farklılaşmasını ve insan hücrelerinin çekirdek yoğunluğunu sağlamaktır.Homojen hücre popülasyonu oluşturmak için çekirdek hücre yoğunluğu gerekli olduğundan, bu yöntemin görsel gösteri

robust-generation-hepatocyte-like-cells-from-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makalede, uzun vadede polimer kaplı yüzeylere geliştirilmesi üzerinde durulacak, kök hücre istikrarlı kültür, insan hepatositleri türetilmiş.

Optimize Sentetik Yüzeyler Hepatosellüler Fenotip kullanma Stabilize

Burada sunulan yöntem, pluripotent kök hücrelerinden insan hepatosit benzeri hücreler üretmek için ölçeklenebilir ve iyi üretim uygulamaları (GMP) 'ya hazır farklılaşma sistemini anlatmaktadır. Temel ve Uygulamalı İnsan karaciğer araştırma için insan hepatosit benzeri hücrelerin oluşturmak için bir düşük maliyetli ve standart bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Burada sunulan Protokolü küçük moleküller karaciğer hastalığının tedavisi için tanımlamak için bir platform açıklar. Adım adım açıklamasını nasıl iPSCs hücrelere 96-şey plakaları hepatosit özellikleri ile ayırt etmek ve küçük moleküller için potansiyel terapötik etkinlik ile ekran için hücreleri kullanmak için ayrıntılı sunulmaktadır.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerden tanımlanan kültür sistemi ve hücre kendi kendine montaj kullanarak hepatospheres üretmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu protokol, hücre çizgilerinin bir dizi tekrarlanabilir, maliyet etkili ve Biyomedikal uygulama için istikrarlı insan hepatospheres üretimi sağlar.

Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi

Bu makalenin amacı, insan hepatik progenitörlerin pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasına neden olmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlamaktır. Bu prosedürün kullanıma hazır ortam formülasyonları ile geliştirilmesi, kullanıcıya biyomedikal araştırma ve çeviri için insan karaciğer hücreleri üretmek için bir facile sistemi sunmaktadır.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Bu makalede, hESC farklılaşması sırasında Activin A ve CHIR99021'in kesin endoderm (DE) olarak sürekli olarak takviye edilmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC' ler) fonksiyonel hepatosit benzeri hücrelere (HLC) farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Mevcut pluripotent kök hücre (PSC)-fonksiyonel hücre farklılaşma sistemleri şu anda ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Burada, kardiyak farklılaşmayı ana örnek olarak kullanarak, görüntü tabanlı makine öğrenimine dayalı PSC farklılaşma sürecini akıllıca izlemek ve modüle etmek için bir protokol sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden hepatosit üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirmeyi. Bu teknik, karaciğer biyolojisi ve ilaç toksisitesi araştırmalarında kullanılabilir.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Daha fazla video keşfet