Mitokondriyal İzolasyon: İnsan Yumurtalık Kanseri Doku Örneğinden Mitokondriyi İzole Etme Tekniği

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 5:09 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrenin güç merkezleri olarak bilinen sitoplazmik organeller olan mitokondri, kanserin ilerlemesi sırasında ciddi yapısal ve fonksiyonel değişikliklere uğrar.

Mitokondriyi izole etmek için, temiz kanserli dokuyu bir cam tabağa alın ve küçük parçalar halinde kıyın. Parçaları mitokondriyal izolasyon tamponu içeren bir tüpe aktarın. Hücreleri parçalamak ve organeller de dahil olmak üzere içeriklerini serbest bırakmak için numuneyi homojenize edin.

Karışımı düşük hızda santrifüjleyin. Bu, çekirdekler, doku kalıntıları ve herhangi bir sağlam hücre gibi daha yoğun bileşenleri peletleyerek süpernatantta mitokondri, mikrozomlar, peroksizomlar ve lizozomlar gibi daha az yoğun bileşenler bırakır. Süpernatanı toplayın ve yüksek hızda santrifüjleyin. Nispeten daha hafif olan mikrozomlar süpernatantta kalırken, ham mitokondri içeren fraksiyon altta peletlenir.

Süpernatanı çıkarın ve peleti uygun bir yoğunluk gradyan ortamında yeniden süspanse edin. Ham mitokondriyal fraksiyonu farklı yoğunluktaki ortamlar içinde katmanlayarak, bunları aşağıdan yukarıya doğru azalan yoğunluk sırasına göre düzenleyerek süreksiz bir yoğunluk gradyanı oluşturun. Çok yüksek hızda santrifüjleyin. Organeller, bağıl yoğunluklarına bağlı olarak bir denge konumu benimsemek için tüp içinde ayrılır. Peroksizomlar ve lizozomlar içeren yoğunluk ortamı arasındaki arayüzde oluşan mitokondriyal fraksiyonu toplayın.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 250 mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu hazırlayın. Yaklaşık 1,5 gram yumurtalık kanseri dokusunu temiz bir cam kaba koyun. Kanı doku yüzeyinden hafifçe yıkamak için 2 mililitre önceden soğutulmuş mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın.

Ardından, dokuyu yaklaşık bir milimetreküp olan parçalara ayırmak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıyılmış dokuları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Mililitre başına 0.2 miligram konsantrasyonda nagarse içeren 13.5 mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. Kıyılmış dokuları 4 santigrat derecede iki dakika homojenize etmek için elektrikli bir homojenizatör kullanın.

Bundan sonra, doku homojenatlarına 3 mililitre daha mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Hazırlanan doku homojenatını 1.300 x g'da ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Peletleri çıkarın ve süpernatanı saklayın.

Daha sonra, süpernatanı 10.000 x g'da ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Mikrozom içeren süpernatanı çıkarın ve peleti saklayın. 2 mililitre mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile peleti iyice yeniden süspanse edin.

Bu pelet süspansiyonunu 7.000 x g'da ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve ham mitokondriyi içeren peleti saklayın. Ekstrakte edilen ham mitokondriyi yeniden süspanse etmek için 12 mililitre %25 yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, yeniden süspanse edilmiş ham mitokondriyi içeren süreksiz bir yoğunluk gradyanı yapın ve 52.000 x g'da ve 4 santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin.

Saflaştırılmış mitokondriyi %25 ve %30 gradyan ortamları arasındaki arayüzde toplamak için uzun ve kör bir şırınga kullanın ve bunu temiz bir tüpe aktarın. Toplanan mitokondriye üç kat hacme seyreltmek için mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. 15.000 x g'da ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti saklayın. Saflaştırılmış mitokondriyi içeren son peleti toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın.

11:27

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:12

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:40

Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:45

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:36

Mezotelyal Hücre İzolasyonu: İnsan Omentum Dokusu Örneğinden Birincil Mezotelyal Hücreleri İzole Etme Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:35

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:27

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:51

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:11

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:04

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026