Proksimal Kültür Sistemi: Hücreler Arasındaki Parakrin Sinyalleşmeyi İncelemek İçin Bir İn Vitro Kültür Tekniği

Parakrin sinyallemede hücreler, komşu hücrelerde tepkileri indükleyen sinyal molekülleri üretir ve salgılar. Parakrin sinyalini taklit etmek için, yumurtalık kanseri hücrelerinin ve mezotelyal hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını uygun ortamlarında hazırlayarak başlayın.

Daha sonra, steril bir kültür kabına ters çevrilmiş gözenekli bir membranöz ek alın. Sıvı bir kubbe oluşturmak için kanser hücresi süspansiyonunu ekleme zarının alt yüzeyine pipetleyin. Hücrelerin yerleşmesine ve zara yapışmasına izin vermek için kuluçkaya yatırın.

Ortamı boşaltmak için ek parçayı ters çevirin. Zarın alt yüzeyine yapışan kanser hücrelerini beslemek için eki büyüme ortamı içeren taze bir kültür kabına aktarın. Şimdi, mezotelyal hücre süspansiyonunu ek parça kuyusuna ekleyin. Hücrelerin zarın karşı tarafına yapışmasına izin vermek için inkübe edin ve iki hücre tipi arasındaki herhangi bir doğrudan teması reddedin.

Kültür sırasında, her iki hücre tipi de sinyal faktörleri salgılar. Bu moleküller gözenekli zardan komşu hücrelere doğru yayılır. Spesifik hücre reseptörlerine bağlanırlar ve her iki hücre tipinde de karmaşık sinyal kaskadlarını indüklerler.

Yumurtalık kanseri hücrelerini 40 ila 60 saniye boyunca 1 mililitre% 0.25 tripsin içeren% 80 birleşik bir karışımdan ayırarak başlayın, ardından reaksiyonun 6 mililitre tam büyüme ortamı ile nötralize edilmesini izleyin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 5 mililitre taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri tam büyüme ortamı konsantrasyonunun mililitresi başına 100.000 yumurtalık kanseri hücresine seyreltin ve deney koşulu başına üç ters çevrilmiş 0.4 mikrometre gözenekli doku kültürü ile muamele edilmiş polikarbonat membran hücre kültürü ekini uygun boyutta bir steril doku kültürü kabına yerleştirin. Ekleri deney durumuna göre etiketleyin ve kanser hücrelerini, 800 mikrolitrelik bir kubbe oluşturmak için zarın ortasından başlayıp dışa doğru hareket ederek eşmerkezli daireler halinde her bir ekin altına dikkatlice pipetleyin.

Hücreleri ekin alt yüzeyine tohumlarken son derece dikkatli olun, böylece orta içeren hücrelerin kubbesi inkübasyon sırasında ekin kenarlarından akmaz.

Tüm ekler tohumlandığında, tabağı örtün ve ekleri dikkatlice hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Yaklaşık 4 saat sonra, HPMC'yi bir ila iki dakika boyunca 2 mililitre% 0.25 tripsin ile ayırın, ardından reaksiyonun 12 mililitre tam büyüme ortamı ile nötralizasyonu izleyin.

HPMC'yi santrifüjleme ile toplayın ve peleti sayım için 10 mililitre tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri, mililitre tam büyüme ortamı başına 300.000 HPMC'ye seyreltin ve 6 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 2,5 mililitre taze tam büyüme ortamı ekleyin.

Steril forseps kullanarak, her bir parçayı sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yerleştirin, böylece alt yumurtalık kanseri hücresine bağlı yüzeyler ortama daldırılır. Daha sonra, her bir ekin kuyucuğuna 1,5 mililitre HPMC tohumlayın ve plakayı 72 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).