JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:34 dk • April 30th, 2023
Periton veya karın boşluğunu kaplayan zar, bir fibrovasküler bağ dokusu tabakası üzerinde desteklenen peritoneal mezotelyal hücreleri oluşturur. Metastaz yapan yumurtalık kanseri hücreleri bu peritoneal astara yapışır ve kanserli büyümelere çoğalır.
Yumurtalık kanseri metastazını modellemek için, insan fibroblastlarını konik bir tüpte alarak başlayın ve bunları hücre dışı bir matris proteini olan kollajen ile karıştırın. Süspansiyonu bir kültür kabına yerleştirin. Fibroblastları gömmek ve peritonun bağ dokusunu taklit etmek için kollajen matris katılaşmasını kolaylaştırmak için inkübe edin.
Daha sonra, fibroblast-kollajen tabakası üzerine bir mezotelyal hücre süspansiyonu ekleyin. Mezotelyal hücrelerin yapışmasına ve fibroblast-kollajen tabakasının yüzeyinde bir tek tabaka oluşturmasına izin vermek için plakayı inkübe edin. Bu 3D organotipik kültür şimdi bir in vivo peritoneal astarın bileşimini ve mimarisini taklit ediyor.
Son olarak, bu organotipik kültürü yumurtalık kanseri hücreleri ile tohumlayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. Yumurtalık kanseri hücreleri, in vivo metastatik koşulları taklit ederek mezotelyal tabakayı değiştiren, kanser hücresi yapışmasını ve istilasını artıran belirli sinyal moleküllerini serbest bırakır.
Normal omentum fibroblastlarını kültürden serbest bırakmak için, kültür şişesini 10 mililitre PBS ile ve ardından 3 mililitre tripsin ile 5 dakikadan fazla olmamak üzere durulayın. Hücreler ayrıldığında, tripsini tam büyüme ortamının hacminin en az üç katı ile nötralize edin ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri aşağı doğru döndürün ve peleti 5 mililitre tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri sayın ve 100 mikrolitre tam büyüme ortamı konsantrasyonu başına 2 ila 4 kez 10 ila üçüncü fibroblasta seyreltin.
Daha sonra, hücrelere 100 mikrolitre sıçan kuyruğu kollajen I başına 0.5 mikrogram ekleyin ve 100 mikrolitre hücreyi siyah, şeffaf bir alt 96 oyuklu plakaya yerleştirin. Daha sonra, plakayı en az 4 saat boyunca veya hücreler plaka yüzeyine yapışana kadar bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Normal omentum fibroblastları çökelirken, HPMC'yi kültür şişelerinden ayırın ve bu hücreleri 50 mikrolitre tam büyüme ortamı başına 1 ila 2 kez 10 ila dördüncü HPMC'ye seyreltin.
Daha sonra, ekli normal omentum fibroblastlarına oyuk başına 50 mikrolitre HPMC ekleyin ve plakayı deneysel kullanımdan önce en az 18 saat hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi gün, 3D organotipik ko-kültürleri, yumurtalık kanseri hücrelerini eksprese eden GFP ile, istenen aşağı akış tahlili için uygun seyreltmede% 80 ila% 90 birleşik kültürden tohumlayın.