$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan birincil mezotelyal hücreleri veya HPMC'ler, omentum veya periton boşluğunda bulunan yağ dokusu tabakası gibi birçok iç organı kaplar.
Mezotelyal hücreleri izole etmek için, fazla kırmızı kan hücrelerini veya RBC'leri çıkarmak için bir insan omentum örneğini uygun bir tampona batırarak başlayın. Ardından, omentumu bir cam tabağa koyun ve parçalara ayırın. Bu, dokuyu ayrıştırır ve HPMC'leri kontamine edici RBC'lerle birlikte serbest bırakır.
Parçaları konik bir tüpe aktarın ve istenen süre boyunca hareketsiz kalmalarına izin verin. Düşük yoğunluklu yağ bakımından zengin kıyma dokusu üste çıkarken, yoğun hücresel bileşenler dibe çöker. Ardından, HPMC'leri ve RBC'leri içeren alttaki sıvıyı yeni bir tüpe aspire edin.
Hücreleri toplamak için santrifüjleyin. Tampon içeren süpernatanı çıkarın. Peletleri mezotelyal bir büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve istenen süre boyunca inkübe edin. Medya, HPMC'lerin RBC'lere göre seçici büyümesini kolaylaştırır.
Küboid şeklindeki insan mezotelyal hücrelerinin büyümesini doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanarak hücreleri gözlemleyin.
Cerrahi bir insan omentum örneği alındıktan sonra, örneği hemen oda sıcaklığında PBS'ye daldırın. Daldırmadan sonraki 2 saat içinde, omentumu 20 mililitre taze PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Birincil insan mezotelyal hücrelerini veya HPMC ve kırmızı kan hücrelerini içeren kalan PBS yıkamasını yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün.
Daha sonra, tüp içeriğini 10 santimetrelik steril bir kültür kabına dökün ve dokuyu 5 milimetreküp parçaya ayırmak için iki neşter kullanın. Birincil insan mezotelyal hücrelerini veya HPMC'yi izole etmek için, omentum parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve katı parçaların üste çıkması için 1 dakika bekleyin. HPMC, kırmızı kan hücreleri ile tüpün dibine yerleşecektir.
Mezotelyal hücreler ve kırmızı kan hücreleri içeren PBS yıkamasını peletlenmiş hücreleri içeren tüpe aktarmak ve hücreleri döndürmek için bir pipet kullanın. Daha sonra, omentuma 20 mililitre taze PBS ekleyin ve PBS içeren HPMC ve RBC'yi orijinal peletlenmiş hücrelere gösterildiği gibi üç kez daha toplayın.
Son döndürmeden sonra, hücreleri 15 mililitre tam büyüme ortamında 75 santimetre karelik bir şişeye yerleştirin. Omentum örneğinden ek HPMC'yi izole etmek için, kalan katı dokuyu 20 RPM ve 37 santigrat derecede 20 mililitre PBS'de çalkalayın. 10 dakika sonra, katı dokunun tüpün tepesine yükselmesine izin vermek için numuneyi 1 dakika dinlendirin.
Ardından, HPMC ve RBC'yi az önce gösterildiği gibi tüpün altından toplayın. Şimdi, hücreleri ikincil yıkamadan aşağı doğru döndürün ve 15 mililitre tam büyüme ortamında 75 santimetre karelik ayrı bir şişeye koyun. Kalan HPMC'yi izole etmek için, dokuyu bu kez PBS ve 10 mililitre tripsin-EDTA karışımında 10 dakika daha çalkalayın ve bu HPMC ve RBC'yi 75 santimetre karelik bir şişeye koyun.
Daha sonra kültürleri nemlendirilmiş bir ortamda 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kaplanmış hücreleri, harcanan ortamı çıkarmadan 3. ve 5. günlerde 15 mililitre taze tam büyüme ortamı ile beslemek. HPMC, küboidal şekilleri ve sitokeratin-8 ve vimentin ekspresyonu ile tanımlanabilir.