Mezotelyal Klirens Testi: Over Kanseri Sferoidlerinin Mezotelyal Hücre Tek Tabakalarına İnvazyon Yeteneğini Ölçmek İçin İn Vitro Bir Teknik
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:34 dk • April 30th, 2023
Yumurtalık kanseri metastazı sırasında, kötü huylu hücreler primer tümör bölgesinden ayrılır ve periton boşluğu içinde dolaşmaya başlar. Bu hücreler daha sonra periton boşluğunu kaplayan mezotelyal hücre tek tabakasına yapışan kümeler veya sferoidler oluşturabilir. Tümör büyüdükçe, istilayı kolaylaştırmak için alttaki mezotelyal hücreleri temizler.
Mezotelyal açıklığı modellemek için, yeşil floresan proteini veya GFP eksprese eden mezotelyal hücreleri fibronektin kaplı bir cam tabanlı kültür kabına tohumlayarak başlayın. Fibronektin kaplama, hücre bağlanmasını destekleyen bir matris sağlar. Mezotelyal hücrelerin yayılmasına ve tek tabaka oluşturmasına izin vermek için çanağı kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, kırmızı floresan proteini eksprese eden yumurtalık kanseri hücresi sferoidlerinin bir süspansiyonunu mezotelyal tek tabakaya aktarın. Hızlandırılmış floresan mikroskobu kullanarak kültürü uzun süre görüntüleyin. Kırmızı floresan sferoidler yerleşecek ve yeşil floresan mezotelyal tek tabakaya yapışacaktır.
Kanser hücreleri mezotelyal hücrelere kuvvet uygulayarak hücre bağlantılarını bozar ve mezotelyal tabaka bütünlüğünü değiştirir. Kuvvet aynı zamanda alttaki mezotelyal hücrelerin yerini alarak bir delik oluşturur. Ortaya çıkan deliği görüntüde siyah bir boşluk olarak görselleştirmek için uygun bir GFP filtre ayarı seçin. Mezotelyal açıklığın derecesini ölçmek için alanı ölçün.
Bu işleme başlamak için, 6 oyuklu cam tabanlı bir MatTek kabının kuyularını fibronektin ile önceden kaplayın. Yemeğin her bir oyuğuna 2 mililitre fibronektin / PBS çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bir mezotelyal hücre tek tabakası oluşturmak için yeşil floresan proteini ifade eden mezotelyal hücreler, %10 baz ortamında kültürlenir. Bir mezotelyal hücre plakasını deneyin ve üç dakika boyunca 900 RPM'de bir masa üstü santrifüjde döndürün.
Süpernatanı aspire edin ve hücreleri% 10 baz ortamında yeniden süspanse edin. %10 baz ortam ile istenen konsantrasyona ayarlayın. MatTek kabının 30 dakikalık fibronektin inkübasyonu tamamlandığında, kuyuları 2 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 6 oyuklu MatTek kabının her bir oyuğunda oyuk başına 10 ila beşinci mezotelyal hücreleri 6 kez aspire edin. Mezotelyal hücrelerin tabağa yapışmasını ve bir tek tabaka oluşturmasını sağlamak için MatTek kabını gece boyunca 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
Yumurtalık kanseri sferoidlerini 96 oyuklu poli-HEMA kaplı plakadan toplamak için bir pipet kullanın. Ortamı, bir mezotelyal hücre tek tabakası içeren 6 oyuklu MatTek kabının bir oyuğundan aspire edin. 2 mililitre PBS ile bir kez yıkayın. 96 oyuklu plakadaki tüm sferoidleri MatTek kabının bir kuyusuna ekleyin. Bu, çanağın görüntülenemeyen kısmına inen sferoidleri hesaba katmak için görüntülenecek olan sferoid sayısının yaklaşık üç katıdır.
Görüş alanı başına yalnızca bir sferoid görüntülemek istediğimizden, sferoidlerin toplanmasından kaçınılmalıdır. Sferoidleri yapışmadan önce tek katman boyunca eşit olarak dağıtmak için kalıbı bir yandan diğer yana nazikçe sallayın.
MatTek çanağını, en az sekiz saat süreyle hızlandırılmış görüntüleme yapabilen ters çevrilmiş geniş alanlı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. Tek bir deneyde birden fazla küresel interkalasyon olayıyla çanaktaki birden fazla konumu görüntülemek için motorlu bir aşama kullanın. Yumurtalık kanseri hücresi sferoidleri tabağın dibine yerleşecek ve mezotelyal hücre tek tabakasına yapışacaktır. Sekiz saat boyunca her on dakikada bir 20'den fazla sferoid/tek katmanlı etkileşimin GFP, RFP ve faz görüntülerini toplayın.
Genel Bakış
Bu çalışma, metastaz sırasında over kanseri sferoidleri ile mezotelyal hücreler arasındaki etkileşimi araştırmaktadır. Metodoloji, mezotelyal temizleme mekanizmalarını anlamak için bu etkileşimlerin görüntülenmesini içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- Over kanseri hücreleri primer tümörlerden kopabilir ve periton boşluğunda dolaşabilir.
- Bu hücreler, mezotelyal hücre tabakalarına tutunan kümeler oluşturabilir.
- Mezotelyal temizlemenin anlaşılması, kanser metastazı hakkında bilgi edinmek için kritik öneme sahiptir.
- Bu hücresel etkileşimleri görselleştirmek için zaman atlamalı görüntüleme teknikleri kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Over kanser hücreleri tarafından gerçekleştirilen mezotelyal temizleme sürecini modellemek.
- Kanser hücresi sferoidlerinin neden olduğu mezotelyal tabaka bozulmasının düzeyini nicelendirmek.
- Hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı gözlemi için floresan mikroskobisi kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- GFP eksprese eden mezotelyal hücreler, fibronektin ile kaplanmış kaplarda kültüre edilir.
- RFP eksprese eden over kanseri sferoitleri, mezotelyal tek tabakaya eklenir.
- Sekiz saatlik etkileşimleri kaydetmek için zaman ayarlı floresan mikroskobu kullanılır.
- Hücre bağlantısı bütünlüğü ve mezotelyal temizlenme durumu görüntüleme yoluyla değerlendirilir.
Temel Sonuçlar
- Over kanseri sferoidleri mezotelyal monokatmana başarıyla tutunur.
- Kanser hücrelerinin uyguladığı kuvvet, mezotelyal hücre bağlantılarını bozar.
- Mezotelyal hücrelerin temizlenmesi, görüntülerde siyah boşluklar olarak görselleştirilir.
- Mezotelyal temizlenmenin miktarı, görüntü analizi yoluyla belirlenir.
Sonuçlar
- Çalışma, over kanseri hücrelerinin metastatik davranışına ilişkin bilgiler sunmaktadır.
- Mezotelyal temizliğin anlaşılması, terapötik stratejilere ışık tutabilir.
- Zaman atlamalı görüntüleme, kanser araştırmalarında hücre etkileşimlerini incelemek için etkili bir yöntemdir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Ovaryum kanseri sferoidlerinin mezotelyal tek tabakalı hücrelere invazyonunun kantitatif değerlendirmesi, metastatik ilerlemedeki kritik bir erken aşamaya odaklanarak, onkoloji geliştirme süreçlerinde hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma çalışmalarına doğrudan bilgi sağlar. Bu analiz, metastatik yayılım ile ilgili hücre-hücre etkileşimlerinin yüksek içerikli ve tekrarlanabilir ölçümüne olanak tanıyarak, keşiften preklinik aşamaya geçiş noktasında öngörülebilir güvenilirliği destekler. Kantitatif görüntüleme çıktılarının entegrasyonu, anti-metastatik terapötik stratejiler için portföy ayıklama ve önceliklendirme süreçlerini güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Kontrollü ve hastalıkla ilgili bir sistemde, metastatik invazyon mekanizmalarının doğrudan sorgulanmasını sağlar.
- Hücre adezyonu, migrasyonu ve klirensi ile ilişkili aday hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Genetik veya farmakolojik perturbasyonların invazyon üzerindeki etkisini nicelleştirerek mekanistik risk azaltma sağlar.
- Anti-metastatik ilaç keşfi için hedef seçimine yönelik prediktif güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Sferoid invazyonu üzerindeki bileşik etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, kantitatif bir analiz platformu oluşturur.
- Farklı koşullar arasında karşılaştırmalı analize uygun, tekrarlanabilir, görüntü tabanlı sonuçlar sunar.
- Metastatik süreçleri hedefleyen inhibitörlerin orta ölçekli taramaları için ölçeklenebilirlik sağlar.
- Onkoloji araştırma programlarında analiz aktarılabilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Over kanseri progresyonu ile translasyonel ilişkisi olan erken metastatik olayları modeller.
- Biyobelirteç ve etkinlik doğrulamasında süreklilik sağlamak için in vitro bulguları preklinik modellerle hizalar.
- Anti-metastatik adaylar için riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına temel oluşturur.
- Keşif biyolojisi ile preklinik değerlendirme arasında mekanistik bir köprü kurar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu mezotelyal temizleme testi, keşiften preklinik aşamaya geçiş sürecinde yer alarak hipotez testine, hedef doğrulamasına ve metastatik inhibisyon için erken dönem bileşik taramasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Metastatik invazyondaki hücre-hücre etkileşim dinamiklerini ve yolak katılımını nicelleştirir.
- Tarama: Bileşik ve genetik pertürbasyon değerlendirmesi için standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analizler: Güçlü istatistiksel karşılaştırma için mezotelyal temizliğin görüntü tabanlı ölçümlerini sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalık bağlamıyla uyumlu olduğunda, in vitro mekanistik içgörüleri in vivo metastatik modellerle birleştirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Metastazı hedefleyen çeşitli onkoloji Ar-Ge girişimleri için yeniden kullanılabilir bir analiz platformu olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Metastatik hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Programlar arası dağıtım için analiz standardizasyonunu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği teşvik eder.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/durdurma kararlarına ve anti-metastatik stratejilerin sermaye açısından verimli önceliklendirilmesine olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Metastatik ilerlemeyi hedefleyen onkoloji varlıklarının riske göre ayarlanmış ilerlemesini ve ayıklanmasını destekler.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, floresan mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Time-lapse görüntüleme platformlarına ve veri kantifikasyonu için analitik yazılımlara erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilirlik için analiz kurulumunun ve görüntüleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Araştırma odağına bağlı olarak farklı kanser hücresi türleri veya mezotelyal kaynaklar için adaptasyon gerektirebilir.
- İşlem kapasitesi ve ölçeklenebilirlik, görüntüleme kapasitesi ve manuel işlem adımları ile sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde
İlgili videolar
0 Görüntüler
Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış
İlgili videolar
0 Görüntüler
TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi
İlgili videolar
0 Görüntüler
In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller
İlgili videolar
0 Görüntüler
Periton Boşluğu Astarında Yumurtalık Kanseri Metastazının Modellenmesi: Periton Astarının İn Vitro 3D Modelini Oluşturmak İçin Bir Yöntem
İlgili videolar
0 Görüntüler
Mezotelyal Hücre İzolasyonu: İnsan Omentum Dokusu Örneğinden Birincil Mezotelyal Hücreleri İzole Etme Tekniği
İlgili videolar
0 Görüntüler
Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki
İlgili videolar
0 Görüntüler
Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için
İlgili videolar
0 Görüntüler
İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026