JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:26 dk. • April 30th, 2023
Tavuk koryoallantoik zarı veya CAM, tavuklar gibi bazı omurgalıların yumurtalarında bulunan oldukça vaskülarize bir zardır. Bu ekstra embriyonik zar, vasküler olmayan bir kabuk zarını kaplar ve embriyo ile çevre arasında gaz halindeki oksijen ve karbondioksit değişim yeri olarak işlev görür.
Bir CAM kanser modeli oluşturmak için, dallanan vaskülatürünü açığa çıkaran kısmen açılmış bir kabuğa sahip, tamamen gelişmiş bir CAM taşıyan canlı, döllenmiş bir tavuk yumurtası ile başlayın. CAM'ın kabuk zarından ayrıldığını onaylayın.
Bir kan damarı dal noktasının üzerine steril bir yapışmaz halka yerleştirin. Bir cam çubuk kullanarak, dış epitel tabakasını kazımak ve vaskülatürü taşıyan alttaki mezodermal tabakayı ortaya çıkarmak için halkanın içindeki zarı hafifçe ovalayın. Uygun bir hücre dışı matris ile karıştırılmış soğutulmuş bir kanser hücresi süspansiyonunu halkaya pipetleyin. Halka hücresel yayılmayı kısıtlar.
İçindeki hücreleri sabitlemek için matrisin katılaşmasına izin verin. Yumurta kabuğu ağzını kapatın ve yumurtayı uygun koşullarda kuluçkaya yatırın. Mezodermal tabaka içindeki yoğun damar sistemi, kanser hücrelerine oksijen ve temel besinleri sağlar, böylece büyümeleri ve genişlemeleri için uygun bir mikro ortam sağlar.
Transplantasyon için bir kanser hücresi süspansiyonu hazırlamak için, ilgilenilen kanser hücresi kültüründen hücreleri hasat edin ve hücreleri santrifüjleme ile çökeltin. Süpernatanı aspire edin ve artık ortamdaki hücreleri mekanik olarak yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin ve ortamdaki hücrelerin hacmini ölçmek için bir pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri 20 ila 100 mikrolitre ortamda 1 ila 2 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin, mililitre hücre dışı matris başına 2.7 ila 4 miligram ve herhangi bir büyüme faktörü veya diğer ilgili katkı maddeleri ile desteklenmiştir.
Kanser hücresi implantasyonu için, yapışmaz bir halka kullanarak, yumurta rafına implante edilecek 6 adede kadar yumurta yerleştirin ve filmi kabuklardan çıkarmak için şeffaf film sargısının kenarlarını açık pencereye doğru yuvarlayın. Yumurtaların canlı ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurtalar, açılan alanın merkezinde daha küçük dallanma damarlarına sahip büyük bir kaba sahip olacaktır.
Kavisli iris forsepsleri kullanarak, damarın üzerinde, ideal olarak bir dallanma noktasının üzerinde, CAM'a steril bir yapışmaz halka yerleştirin. CAM'yi nazikçe aşındırmak için steril bir cam karıştırma çubuğu kullanın ve kanser hücresi süspansiyonunu halkanın ortasına pipetleyin. Tüm hücreler teslim edildiğinde, açıklığı 6 x 7 santimetrelik şeffaf bir film sargısı ile kapatın ve yumurtayı uygun bir implant ataması ile etiketleyin. Ardından, yumurtayı, kabuğun açıklığı dik bakacak şekilde kuluçka makinesine güvenli bir şekilde yerleştirin.