Agaroz Spin Down Testi: Histolojik Analiz için Organoidleri Gömme Tekniği

Kanser hücrelerinin 3D organoid kültürleri, insan kanserlerinin birçok patofizyolojik özelliğini özetlemektedir. Bu nedenle, bu in vitro kültürler kanser araştırmaları için mükemmel bir model oluşturur.

Bu organoidleri işlemek için, uygun bir bazal membran matrisinde büyütülen önceden oluşturulmuş 3D organoidlerin bir kültürüyle başlayın. İstenilen bir hücre geri kazanım ortamını ekleyin ve inkübe edin. Ortam, matris jelinin depolimerizasyonunu kolaylaştırır ve 3D organoidleri çözeltiye bırakır.

Organoidleri peletlemek için bu karışımı santrifüjleyin. Matris bileşenlerini içeren geri kazanım ortamı süpernatantta kalır. Süpernatanı atın. Ardından, organoid pelete paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Kimyasal, organoid hücrelere girer ve amino asitlere bağlanarak protein çapraz bağlanmasına ve numune fiksasyonuna neden olur. Bu adım, herhangi bir aşağı akış histolojik uygulaması için hayati önem taşır.

Paraformaldehit içeren süpernatanı ayırmak ve çıkarmak için organoidleri peletleyin. Organoidlere ılık eritilmiş agaroz ekleyin. Peletlenmiş organoidleri sıvı agarozun içine ayırmak ve dağıtmak için bir iğne kullanın. Agarozun katılaşmasına ve organoidleri gömmesine izin verin. Aşağı akış histolojik tahliller için organoid içeren agaroz tıkacını kullanın.

Organoidleri histoloji için işlemek için, bazal membran kubbelerini aspire etmemeye dikkat ederek mevcut ortamı kuyudan çıkarın. Eşit hacimde hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin ve plakayı 4 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bir pipet kullanarak bazal membran kubbesini yerinden çıkarın ve pipet ucuyla ezin. Ayrışmış kubbeyi ve hücre geri kazanım çözeltisini 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüpü 300 x g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın ve bir kenara koyun.

Organoidlerin varlığı onaylandığında son adıma kadar tüm süpernatanı saklayın. İstenilen hacimde soğuk PBS ekleyin ve organoidleri bozmadan peleti mekanik olarak çıkarmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın.

Peleti oda sıcaklığında 60 dakika boyunca eşleşen %4 PFA hacminde sabitleyin. Sabitlemeden sonra, santrifüj adımını tekrarlayın ve PBS yıkayın. Ardından, yavaşça 200 mikrolitre ılık %2 agaroz ekleyin ve 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğne kullanarak hücre peletini tüp duvarından bozmadan hemen ama nazikçe ayırın.

Agaroz döndürme yöntemi için, 25 gauge bir iğne kullanarak agaroz eklendikten hemen sonra hücre peletini tüpün duvarından ayırmak çok önemlidir.

Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge iğne ile tüpten ayırın ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü% 70 etanol ile doldurun ve doku dehidrasyonu ve parafin gömme için geleneksel protokole devam edin.