Agaroz Spin Down Testi: Histolojik Analiz için Organoidleri Gömme Tekniği

Kanser hücrelerinin 3D organoid kültürleri, insan kanserlerinin birçok patofizyolojik özelliğini özetlemektedir. Bu nedenle, bu in vitro kültürler kanser araştırmaları için mükemmel bir model oluşturur.

Bu organoidleri işlemek için, uygun bir bazal membran matrisinde büyütülen önceden oluşturulmuş 3D organoidlerin bir kültürüyle başlayın. İstenilen bir hücre geri kazanım ortamını ekleyin ve inkübe edin. Ortam, matris jelinin depolimerizasyonunu kolaylaştırır ve 3D organoidleri çözeltiye bırakır.

Organoidleri peletlemek için bu karışımı santrifüjleyin. Matris bileşenlerini içeren geri kazanım ortamı süpernatantta kalır. Süpernatanı atın. Ardından, organoid pelete paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Kimyasal, organoid hücrelere girer ve amino asitlere bağlanarak protein çapraz bağlanmasına ve numune fiksasyonuna neden olur. Bu adım, herhangi bir aşağı akış histolojik uygulaması için hayati önem taşır.

Paraformaldehit içeren süpernatanı ayırmak ve çıkarmak için organoidleri peletleyin. Organoidlere ılık eritilmiş agaroz ekleyin. Peletlenmiş organoidleri sıvı agarozun içine ayırmak ve dağıtmak için bir iğne kullanın. Agarozun katılaşmasına ve organoidleri gömmesine izin verin. Aşağı akış histolojik tahliller için organoid içeren agaroz tıkacını kullanın.

Organoidleri histoloji için işlemek için, bazal membran kubbelerini aspire etmemeye dikkat ederek mevcut ortamı kuyudan çıkarın. Eşit hacimde hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin ve plakayı 4 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, bir pipet kullanarak bazal membran kubbesini yerinden çıkarın ve pipet ucuyla ezin. Ayrışmış kubbeyi ve hücre geri kazanım çözeltisini 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüpü 300 x g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın ve bir kenara koyun.

Organoidlerin varlığı onaylandığında son adıma kadar tüm süpernatanı saklayın. İstenilen hacimde soğuk PBS ekleyin ve organoidleri bozmadan peleti mekanik olarak çıkarmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın.

Peleti oda sıcaklığında 60 dakika boyunca eşleşen %4 PFA hacminde sabitleyin. Sabitlemeden sonra, santrifüj adımını tekrarlayın ve PBS yıkayın. Ardından, yavaşça 200 mikrolitre ılık %2 agaroz ekleyin ve 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğne kullanarak hücre peletini tüp duvarından bozmadan hemen ama nazikçe ayırın.

Agaroz döndürme yöntemi için, 25 gauge bir iğne kullanarak agaroz eklendikten hemen sonra hücre peletini tüpün duvarından ayırmak çok önemlidir.

Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 25 gauge iğne ile tüpten ayırın ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü% 70 etanol ile doldurun ve doku dehidrasyonu ve parafin gömme için geleneksel protokole devam edin.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.