Prostat Organoid Testi: Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesini İncelemek İçin Matris Jel Halka Bazlı Ex Vivo Kültür Tekniği

Prostat epiteli esas olarak bazal epitel ve luminal epitel hücrelerini içerir. Tek katmanlı bir bazal hücre, bezin dış astarını oluşturur ve luminal hücre sağkalımını destekler. Tersine, luminal hücreler lümeni kaplar ve prostata özgü proteinleri salgılar.

Prostat epitel farklılaşmasını ex vivo incelemek için, bazal prostat epitel hücrelerinin süspansiyonu ile başlayın. Süspansiyonu istenen oranda soğutulmuş bir bazal membran matrisi ile karıştırın. Bu karışımı, hücre itici bir kültür plakasının iç duvarının tabanının yanına pipetleyin. Karışımın kuyu çevresi boyunca bir halka oluşturması için plakayı döndürün.

Matrisin katılaşmasına izin vermek için plakayı inkübe edin. Kültürü tercih edilen bir medya ile destekleyin. Ortamdaki büyüme faktörleri bazal epitel hücrelerinin çoğalmasını destekler. Aynı zamanda, kültür kabının hücre itici doğası, hücreleri matris içinde 3D sferoidler oluşturmaya teşvik ederek herhangi bir hücre bağlanmasını önler.

Zamanla, sferoidler çok katmanlı epitel ile sınırlanmış lümenler geliştirir. Lümen astarlı bazal epitel hücreleri sonunda farklılaşır ve salgı luminal hücreleri oluşturur, bu da 3D glandüler yapılara yol açar.

Bu prosedüre, metin protokolünde tarif edildiği gibi fare bazal ve luminal prostat epitel hücrelerinin hazırlanması ile başlayın. Hücre peletini 500 mikrolitre fare organoid ortamında yıkayın. Daha sonra, peleti mikrolitre başına 1.000 hücre hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edin. Ana karışımları hazırlamak için, fare organoid ortamında süspanse edilmiş epitel hücrelerini matris jel ile karıştırarak ortamda %25 hücre ve %75 matris jel içeren nihai bir karışım oluşturun. Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak, bazal hücreler tipik olarak 80 mikrolitre başına 100 ila 2.000 hücre konsantrasyonunda kaplanırken, luminal hücreler 80 mikrolitre başına 2.000 ila 10.000 hücre konsantrasyonunda kaplanır.

Her hücre karışımı için, 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 80 mikrolitre matris jeli ekleyin. Poly-HEMA kaplama ile doğrudan temastan kaçınırken kuyu duvarının alt yarısına bir damlacık pipetleyin. Matris jeli ekledikten sonra, matris jel hücresi karışımının kuyunun kenarı etrafında bir halka oluşturmasına izin vermek için plakayı döndürün. 24 oyuklu plakayı, matris jelin kısmen sertleşmesini sağlamak için sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 37 santigrat derece %5 CO2 inkübatörüne 10 dakika yerleştirin.

10 dakika inkübe ettikten sonra, 24 oyuklu plakayı ters çevirin ve matris jelinin tamamen sertleşmesini sağlamak için 50 dakika daha inkübe edin. Ardından, her bir oyuğun ortasına 350 mikrolitre önceden ısıtılmış fare organoid ortamı ekleyin. Ortamı ekledikten sonra, 24 oyuklu plakayı inkübatöre geri koyun.

Fare organoid ortamını yenilemek için, 24 oyuklu plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin ve matris jel halkasından kaçınırken bir P1000 pipeti kullanarak mevcut ortamı her bir oyuğun ortasından nazikçe çıkarın. Daha önce olduğu gibi 350 mikrolitre önceden ısıtılmış fare organoid ortamı ekleyin. Temel besin maddelerinin ve büyüme faktörlerinin hızlı bir şekilde tükenmesini önlemek için beş günden daha uzun süre kültürlenen organoidlere daha büyük miktarda ortam eklenmesi önerilir.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.