Protein lizat ekstraksiyonu: hücresel proteinleri toplamak için organoidleri parçalamak için bir teknik

Hücre lizatı veya parçalanmış hücre içeriği içeren sıvı, protein ekstraksiyonları ve analizleri gibi sonraki işlemlerde uygulama bulur. Bu fraksiyonları incelemek, hücrelerin özellikleri ve işlevleri hakkında bilgi verir.

Organoid protein lizatlarını hazırlamak için, istenen bir bazal membran matrisinde yetiştirilen bir organoid kültürü ile başlayın. Harcanan kültür ortamını tabaktan çıkarın. Matrisin üzerine proteaz içeren sıcak ortam ekleyin. Matrisi tabaktan çıkarmak için art arda pipetleyin.

Karışımı inkübe edin. Ortamdaki proteolitik enzimler matrisi bozar ve organoidleri çözeltiye bırakır. Organoidleri enzim içeren süpernatanttan ayırmak için numuneyi santrifüjleyin.

Organoid peleti uygun bir protein lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneyi inkübe edin. Tampondaki deterjanlar, organoidlerin hücre zarlarını bozarak hücre içi içeriği çözeltiye bırakır. Aynı zamanda, tampondaki protein inhibitörleri, salınan proteaz ve fosfataz enzimlerini inaktive ederek substrat proteinlerinin bozulmasını önler.

Ayrıca, hücreleri tamamen bozmak için karışımı sonikleştirin. Nükleer zarf yırtılır ve nükleer proteinleri çözeltiye bırakır. Sonik dalgalar ayrıca salınan nükleik asitleri keserek protein lizatını kirletmelerini önler.

Organoidleri toplamak için, 1 mililitre önceden ısıtılmış dispas içeren ortamı tüm halka yerinden çıkana kadar doğrudan matris jel halkasına pipetleyerek matris jeli tekrar tekrar püskürtün. Yerinden çıkmış matris jel organoid karışımını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tam sindirimin ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi, organoid peletine fosfat tamponlu salin ekleyin ve hafifçe hafifçe vurarak yeniden süspanse edin.

Organoidleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı bir mikropipet kullanarak çıkarın. Organoid peletleri, 10 mikrolitre paketlenmiş hücre hacmi başına 100 mikrolitre protein lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Yeniden askıya almak için hafifçe vurun. Şimdi, tüpleri ıslak buza batırarak ve sonik ayırıcının ucunu mikrosantrifüj tüpünün dışına nazikçe uygulayarak organoidleri sonikleştirin. Yerleşik protokollerle batı blotlamaya geçmeden önce 20 kHz'de 40 saniye boyunca sonikate.