Tam Montajlı İmmünofloresan Görüntüleme: Sağlam Organoidleri Değerlendirmek İçin Bir Sabitleme ve Boyama Tekniği

Prostat organoidleri esas olarak bazal epitel hücrelerinin bir dış katmanını ve merkezi bir lümen etrafında düzenlenmiş luminal epitel hücrelerinin iç katmanlarını oluşturur.

Tam montajlı görüntüleme, morfolojilerini ve heterojenliklerini korurken bozulmamış 3D organoidlerin incelenmesine izin verir. Boyamaya başlamak için, organoidlere hücresel bileşenlerini yerine kilitlemek ve böylece onları korumak için uygun bir fiksatif uygulayın. Fazla fiksatifleri çıkarmak için numuneyi yıkayın.

Bloke edici çözelti ve DNA boyama boyası kokteyli ile inkübe edin. Bloke edici solüsyondaki proteinler, hücrelerin spesifik olmayan bölgelerine pasif olarak bağlanır ve herhangi bir arka plan lekelenmesini azaltır. Aynı zamanda, DNA boyama boyası hücrelerin çekirdeklerini boyar.

İki kurucu hücre popülasyonu tarafından eksprese edilen spesifik antijenleri hedefleyen iki set primer antikor ekleyin. Primer antikorlara bağlanan iki farklı floresan-boya konjuge ikincil antikor ile inkübe edin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için numuneyi yıkayın.

Organoid mimarisinden ödün vermeden doku şeffaflığını artırmak için lekeli organoidleri sırayla artan konsantrasyonlarda yüzey aktif madde içeren şeker çözeltilerine daldırın. Bu işlem, numunenin görüntüleme derinliğini artırır.

Görüntüleme sırasında 3B morfolojilerini korumak için organoidleri bir mikroskop lamı taşıyan ara parçalarına monte edin. Merkezi lümen etrafında düzenlenmiş bazal ve luminal hücre popülasyonlarından gelen floresan emisyonlarını gözlemlemek için konfokal bir mikroskop kullanın.

Prostat organoidlerinin tam montajlı immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek için önce PBS'ye 500 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Organoidleri oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak 2 saat inkübe edin. Peletleri metin protokolünde anlatıldığı gibi yıkadıktan sonra, bloke edici solüsyonda mililitre başına 1 mikrogram DAPI lekesi ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Bu adımdan itibaren inkübasyon sırasında numuneyi ışıktan koruyun. Organoidlerin daha önce olduğu gibi santrifüjlenmesini takiben, birincil antikor ve bloke edici çözelti ekleyin ve hafifçe çalkalayarak gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Organoidleri tekrar pelet haline getirin ve peleti 1 mililitre PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Daha sonra, ikincil antikor ve bloke edici çözelti ekleyin ve hafifçe çalkalayarak gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, organoidleri peletleyin ve peleti iki kez daha yıkayın. Peletlenmiş organoidlere% 1 Triton X-100 ile PBS'de 1 mililitre% 30 sükroz ekleyin. Daha sonra hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.

Organoidleri tekrar peletledikten sonra,% 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mililitre% 45 sükroz ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat hafifçe çalkalayın. Ardından,% 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mililitre% 60 sükroz eklemek dışında prosedürü tekrarlayın. Organoidleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatantın %95'ini çıkarın. Süpernatantın çıkarılması sırasında kaybolmadığını doğrulamak için peleti UV ışığı altında gözlemleyin. Sükroz konsantrasyonu arttıkça pelet daha gevşek hale gelir. Kalan süspansiyonun 10 ila 20 mikrolitresini odacıklı bir lamel üzerine aktarın ve konfokal mikroskoba devam edin.