İşlevselleştirilmiş Tel Tabanlı Hedef Hücre İzolasyonu: Kanser Hücrelerini Çivili Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Ex Vivo Teknik

Epitel hücre adezyon molekülleri veya EpCAM'ler, prostat kanserlerinde hızla çoğalan epitel hücrelerinde aşırı eksprese edilen yüzey transmembran glikoproteinleridir. EpCAM eksprese eden hücreleri izole etmek için, işlevselleştirilmiş altın kaplı bir uç taşıyan tıbbi sınıf bir tel ile başlayın. İşlevselleştirme, kovalent bağlı EpCAM'e özgü antikorlar içeren polimerik bir jeli katmanlar.

Teli, floresan etiketli kanser hücreleri içeren periferik bir kan süspansiyonuna daldırın. İşlevselleştirilmiş parçanın kan süspansiyonuna batırılmış halde kaldığından emin olun. Kanser hücreleri üzerindeki EpCAM'ler, tel üzerinde işlevselleştirilmiş spesifik antikorlarını tanır ve bunlara bağlanır.

Tel yüzeyinden bağlanmamış hücreleri çıkarmak için bir tamponla yıkayın. Kabloyu bükün ve işlevselleştirilmiş kısım tampona daldırılmış halde tampon içeren bir cam kızak üzerine monte edin. Hücre sitoplazmasından ve çekirdeklerinden parlak floresanı kontrol etmek için bir floresan mikroskobu kullanın ve tel üzerinde yakalanan hücrelerin varlığını doğrulayın.

Kabloya bir serbest bırakma tamponu uygulayın. Tampondaki proteolitik enzimler, polimerik jeli parçalayarak antikor-kanser hücre komplekslerini tampona bırakır. Pelette salınan antikor-hücre komplekslerini toplamak için tel tertibatını santrifüjleyin. Teli ve enzim içeren süpernatanı çıkarın. Hedef hücre içeren peleti uygun bir ortamda yeniden süspanse edin.

5 mililitre periferik kanda, yaklaşık 500 ila 500.000 hücre ekleyin ve ardından tüpü ters çevirerek karıştırın. Teli saklama bölmesinden çıkardıktan sonra, teli tutan lastik kapağı çıkarın ve teli 1x fosfat tamponlu tuzlu suda yıkayın ve tüpün kapağına monte edin. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dakikada 5 devirde eğimli bir silindirli karıştırıcı üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, teli 1x fosfat tamponlu tuzlu suda üç kez durulayın. Ardından, teli karanlıkta 1x fosfat tamponlu salin içeren 15 mililitrelik bir tüpte saklayın.

Bir gres kalemi kullanarak bir cam slayt üzerine dikdörtgen bir alan çizin ve üzerine 500 mikrolitre 1x fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin. Telin işlevsel kısmını 1x fosfat tamponlu tuzlu suya batırmak için, telin işlevsel olmayan kısmını bükün ve cam kızağın üzerine yerleştirin. Yakalanan hücrelerin sayısını saymak için, telin her iki tarafını da görsel olarak inceleyin. İnceledikten sonra, teli 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile 15 mililitrelik tüpe geri aktarın ve karanlıkta tutun.

1 mililitre 1x fosfat tamponlu tuzlu su içinde, 4 miligram serbest bırakma tamponu bileşenini çözün. Ardından, kullanıma hazır tamponu elde etmek için çözeltiyi 0,2 mikrometre steril filtreden süzün. Ardından, serbest bırakma tamponunu 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın. Isıtıldıktan sonra, 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünü tamamen doldurmak için 1,6 mililitre serbest bırakma tamponu aktarın. Daha sonra, telin işlevsel kısmını serbest bırakma tamponunda 37 santigrat derecede bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, teli 15 dakika boyunca dakikada 500 dönüşte bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Ardından, teli 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme bittiğinde, teli tüpten çıkarın, kapağı kapatın ve tüpü 10 dakika boyunca 300 x g'da tekrar santrifüjleyin.