JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:45 dk • April 30th, 2023
Otofaji, lizozom adı verilen özel sindirim bölmeleri içinde istenmeyen sitoplazmik bileşenlerin ve organellerin bozulmasını kolaylaştıran hücre içi bir süreçtir. Otofajiyi değerlendirmek için, yeşil floresan proteinlere bağlı LC3 adı verilen otofajik belirteç proteinlerini eksprese eden prostat kanseri hücrelerinin yapışık bir kültürü ile başlayın.
Doğal olarak, prostat kanseri hücreleri, arginin amino asit sentezi için gerekli olan argininosüksinat sentaz enziminden yoksundur. Bu nedenle, bu hücreler, hayatta kalmak ve çoğalmak için ortam yoluyla harici arginin takviyesine bağımlıdır.
Daha sonra, hücreleri arginin deiminaz veya ADI ile tedavi edin. ADI, ortamdaki serbest arginini hidrolize ederek arginin tükenmesine yol açar. Sonuç olarak, hücreler metabolik strese maruz kalır ve dahili olarak otofajik bir tepki başlatır. Aynı zamanda, hücrelere, hücreler içindeki lizozomları etiketleyen kırmızı bir floresan boya uygulayın.
Otofaji sırasında, fagofor adı verilen fincan şeklindeki zarlı yapılar, hasarlı sitoplazmik bileşenlerin etrafında toplanır. Sonunda, çift zarlı veziküller veya otofagozomlar oluşturmak için otofajik işaretleyici proteinler LC3 ile konjuge olurken yüklerini genişletir ve mühürlerler. LC3 proteinleri ayrıca otofagozomlara floresan etiketler sağlar. Veziküller daha sonra otolizozomlar oluşturmak için lizozomlarla birleşir. Otolizozomlar içindeki lizozomal proteazlar, yutulan hücresel bileşenleri bozar.
Gerçek zamanlı olarak, hücreler içindeki dağılımlarını belirlemek için otofagozomlardan ve lizozomlardan gelen parlak floresansı gözlemleyin.
Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi, 35 milimetre poli-D-lizin kaplı cam alt kültür kaplarında yeşil floresan proteine bağlı Işık Zinciri 3 eksprese eden insan prostat kanseri hücrelerini büyütün.
Hücreler, hızlı çoğalmayı kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta kaplanmalıdır, ancak hücrelerin görüntüleme sırasında aşırı büyüyüp kümeleneceği kadar fazla olmamalıdır. Serbest arginin hücrelerini tüketmek ve kanser hücrelerinde metabolik stresi indüklemek için seçilen hücre örneklerini PBS'de arginin deaminaz veya ADI ile tedavi edin.
Görüntülemeden yaklaşık bir saat önce, 1,5 mikrolitre LysoTracker Red'i %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren 20 mililitre RPMI ile seyreltin. İşlem gören seçilmiş numuneler için ADI ile çözeltiler hazırlayın.
Tüm ortamları 37 santigrat dereceye kadar ısıttıktan sonra, her bir kültür kabına uygun ortamı ekleyin. LysoTracker Red içeren RPMI ile hücreleri 37 santigrat derecede 15 ila 45 dakika inkübe edin.
Görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, hava durumu istasyonu çevre muhafazasını açın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile dengelemeye izin verin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve ortamı sadece% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren standart RPMI ile değiştirin.
Belirtildiği gibi örneklere ADI ekleyin. 35 milimetre kapaklı cam alt kültür kaplarını özelleştirilmiş bir adaptöre monte edin. 60X büyütme, 1.42 sayısal diyafram açıklığına sahip objektif merceğinde daldırma yağı kullanın ve monte edilmiş kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin.