Prostat Kanseri Hücrelerinde ADI Tabanlı Otofaji İndüksiyonu: Hücrelerde Otofajik Yanıtı Ölçmek İçin Enzim Tabanlı Bir Teknik

Otofaji, lizozom adı verilen özel sindirim bölmeleri içinde istenmeyen sitoplazmik bileşenlerin ve organellerin bozulmasını kolaylaştıran hücre içi bir süreçtir. Otofajiyi değerlendirmek için, yeşil floresan proteinlere bağlı LC3 adı verilen otofajik belirteç proteinlerini eksprese eden prostat kanseri hücrelerinin yapışık bir kültürü ile başlayın.

Doğal olarak, prostat kanseri hücreleri, arginin amino asit sentezi için gerekli olan argininosüksinat sentaz enziminden yoksundur. Bu nedenle, bu hücreler, hayatta kalmak ve çoğalmak için ortam yoluyla harici arginin takviyesine bağımlıdır.

Daha sonra, hücreleri arginin deiminaz veya ADI ile tedavi edin. ADI, ortamdaki serbest arginini hidrolize ederek arginin tükenmesine yol açar. Sonuç olarak, hücreler metabolik strese maruz kalır ve dahili olarak otofajik bir tepki başlatır. Aynı zamanda, hücrelere, hücreler içindeki lizozomları etiketleyen kırmızı bir floresan boya uygulayın.

Otofaji sırasında, fagofor adı verilen fincan şeklindeki zarlı yapılar, hasarlı sitoplazmik bileşenlerin etrafında toplanır. Sonunda, çift zarlı veziküller veya otofagozomlar oluşturmak için otofajik işaretleyici proteinler LC3 ile konjuge olurken yüklerini genişletir ve mühürlerler. LC3 proteinleri ayrıca otofagozomlara floresan etiketler sağlar. Veziküller daha sonra otolizozomlar oluşturmak için lizozomlarla birleşir. Otolizozomlar içindeki lizozomal proteazlar, yutulan hücresel bileşenleri bozar.

Gerçek zamanlı olarak, hücreler içindeki dağılımlarını belirlemek için otofagozomlardan ve lizozomlardan gelen parlak floresansı gözlemleyin.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi, 35 milimetre poli-D-lizin kaplı cam alt kültür kaplarında yeşil floresan proteine bağlı Işık Zinciri 3 eksprese eden insan prostat kanseri hücrelerini büyütün.

Hücreler, hızlı çoğalmayı kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta kaplanmalıdır, ancak hücrelerin görüntüleme sırasında aşırı büyüyüp kümeleneceği kadar fazla olmamalıdır. Serbest arginin hücrelerini tüketmek ve kanser hücrelerinde metabolik stresi indüklemek için seçilen hücre örneklerini PBS'de arginin deaminaz veya ADI ile tedavi edin.

Görüntülemeden yaklaşık bir saat önce, 1,5 mikrolitre LysoTracker Red'i %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren 20 mililitre RPMI ile seyreltin. İşlem gören seçilmiş numuneler için ADI ile çözeltiler hazırlayın.

Tüm ortamları 37 santigrat dereceye kadar ısıttıktan sonra, her bir kültür kabına uygun ortamı ekleyin. LysoTracker Red içeren RPMI ile hücreleri 37 santigrat derecede 15 ila 45 dakika inkübe edin.

Görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, hava durumu istasyonu çevre muhafazasını açın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile dengelemeye izin verin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve ortamı sadece% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren standart RPMI ile değiştirin.

Belirtildiği gibi örneklere ADI ekleyin. 35 milimetre kapaklı cam alt kültür kaplarını özelleştirilmiş bir adaptöre monte edin. 60X büyütme, 1.42 sayısal diyafram açıklığına sahip objektif merceğinde daldırma yağı kullanın ve monte edilmiş kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.