Protein Ekstraksiyonu ve Proteoliz: Prostat Tümör Dokusu Örneklerinden Protein Elde Etme ve Bunların Peptitlere Enzimatik Sindirimi İçin Bir Yöntem

0 görüntüleme4:03 dk • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir prostat tümör dokusu örneği ile başlayın. Hücre lizizini başlatmak için soğutulmuş bir lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Doku yapılarını daha fazla parçalamak ve hücre içi bileşenlerini serbest bırakmak için bir homojenizatör kullanın. Tam hücre lizizini sağlamak için numuneyi buz üzerinde sonikasyon yapın ve peptit işleme sırasında paraziti önlemek için DNA'yı kesin. Proteinlerin üçüncül yapısını bozmak ve açmak için lizatı ısıtın.

Tampondaki indirgeyici maddeler, sistein kalıntıları arasındaki disülfid bağlarını parçalar. Daha sonra, tampon alkilat içindeki alkilleyici ajanlar, disülfid bağı yeniden oluşumunu önlemek için indirgenmiş sisteinlerin tiyol gruplarını serbest bırakır. Tampondaki ek denatüre edici ajanlar, kontrollü denatürasyonu ve proteinlerin daha fazla açılmasını kolaylaştırır.

Doku kalıntılarını ve herhangi bir kirletici maddeyi peletlemek için santrifüjleyin. Protein karışımını içeren süpernatanı taze bir tüpte toplayın. Lizin kalıntılarının C terminalindeki proteinlerdeki peptit bağlarını parçalamak ve büyük peptitler oluşturmak için lizil endopeptidaz enzimi ekleyin. Ayrıca, lizin ve arginin kalıntılarının C terminalinde peptit bağlarını parçalamak ve daha küçük peptitler oluşturmak için tripsin enzimi ile muamele edin. Karışımı bir santrifüj filtre ünitesine aktarın.

Sindirilmiş peptitlerin filtre zarının gözeneklerinden geçmesine ve akış olarak toplanmasına izin vermek için santrifüjleyin. Daha büyük parçalar retentat olarak kalır.

Tümör dokusunu toplamak için tümörü tartın ve bir kültür test tüpünde, her 100 miligram doku için 2 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Ardından, lizatı homojenize etmek için el tipi veya tezgah üstü bir homojenizatör kullanın.

Numuneyi azaltmak ve alkillemek için, tüpü 95 santigrat derecede 5 dakika ısıtın, ardından numuneyi buz üzerinde 15 dakika soğutun. Hala buz üzerindeyken, lizatı üç kez sonikleştirin. Ardından, numuneyi 95 santigrat derecede 5 dakika ısıtın.

Bu sonikasyon tüpünü sallanan bir kova rotoruna yerleştirin ve lizatı 15 dakika boyunca 3.500 x g ve 15 santigrat derecede santrifüjleyin. Sonra, süpernatanı toplayın ve peleti atın. Lizatı sindirmek için, guanidinyum miktarını azaltmak için numuneyi 12 kat seyreltmek için 100 milimolar Tris kullanın. 5 miligram protein için 10 mikrogram Lysyl Endopeptidaz veya Lys-C ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 5 ila 6 saat inkübe edin.

20 milimolar kalsiyum klorür ve 1 ila 100 tripsin / protein oranında tripsin eklenmiş 1 milimolar HCl'de TPCK ile muamele edilmiş tripsin mililitre başına 1 miligram hazırlayın. Numuneyi 37 santigrat derecede 3 saat inkübe edin. Ardından, tüpe ek bir tripsin alikotu ekleyin ve numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Numuneyi 15 mililitre, 10 kDa'lık bir kesme filtresine ekleyin. Numuneyi sallanan bir kovada veya sabit açılı rotorda 3.500 x g ve 15 santigrat derecede tutma hacmi 250 mikrolitreden az olana kadar santrifüjleyin. Ardından, akışı toplayın ve kalıntıyı atın.

08:09

Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:28

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:03

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:21

Peptit Saflaştırma: Sindirilmiş Protein Lizatlarından Peptitleri Çıkarmak için RP-HPLC Tabanlı Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:33

Fosfopeptitlerin Titanyum Dioksit Bazlı Zenginleştirilmesi: Peptit Kütüphanesinden Fosfopeptitlerin Seçici İzolasyonu İçin Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:20

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:08

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:23

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:13

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:40

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026