Peptit Saflaştırma: Sindirilmiş Protein Lizatlarından Peptitleri Çıkarmak için RP-HPLC Tabanlı Bir Teknik

Peptitleri izole etmek ve saflaştırmak için, sindirilmiş peptitlerin bir karışımını içeren bir protein lizat süspansiyonu ile başlayın.

Karışımı trifloroasetik asit veya TFA bazlı reaktif ile muamele edin. Bu anyonik veya negatif yüklü reaktif, peptitler üzerinde bazik veya pozitif yüklü kalıntılara sahip bir iyon çifti kompleksi oluşturur, böylece yüklerini maskeler ve peptit hidrofobikliğini iyileştirir.

Şimdi, polar olmayan hidrofobik ligandlarla hareketsiz hale getirilmiş, gözenekli silika bazlı sabit faz içeren ters fazlı yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi veya RP-HPLC kolonu monte edin. Numune uygulamasından önce sabit fazı hazırlamak için kolona peptit uyumlu bir dengeleme tamponu ekleyin.

Şimdi, asitlenmiş numuneyi kolona yükleyin. Kolon içinde, hidrofobik peptitler, sabit fazın hidrofobik ligandlarına seçici olarak adsorbe olur. Bağlanmamış veya istenmeyen parçacıkları uzaklaştırmak için kolon boyunca bir yıkama tamponu çalıştırın.

Daha sonra, kolondan yüksek hidrofobikliğe sahip daha az polar bir organik elüsyon tamponu geçirin. Elüsyon tamponuna karşı seçici afiniteleri nedeniyle, bağlı peptitler kolon matrisinden desorbe olur.

Peptit içeren elüatı kolondan toplayın. Su içeriğini gidermek ve saf ve stabil peptitlerden oluşan kuru bir toz elde etmek için elüatı liyofilize edin.

Numuneyi asitleştirmek için, mililitre lizat başına yaklaşık 20 mikrolitre %5 trifloroasetik asit veya TFA ekleyin. Tüpü iyice karıştırın ve pH'ı ölçmek için bir pH şeridi kullanın. Gerekirse, pH'ı 2,5'e ayarlamak için ekstra %5 TFA ekleyin. Ardından, bir C18 kolonunun daha kısa ucuna bir vakum manifolduna bağlayın. Vakumu 17 ila 34 kPa arasında ayarladıktan sonra, sütunu ıslatmak için 3 mililitre %100 asetonitril ve bir cam pipet kullanın.

Bir cam pipet kullanarak ve iki adet 3 mililitrelik %0.1 TFA alikotu uygulayarak sütunu dengeleyin. Ardından, asitlenmiş numuneyi kolona yükleyin. Kolonu yıkamak için üç adet 3 mililitrelik hacimde %0,1 TFA kullanın. Ardından, numuneyi elüte etmek için 2 mililitre% 40 ACN,% 0.1 TFA uygulayın ve iki adet 2 mililitrelik fraksiyonu cam kültür tüplerine toplayın. Parafilm ile eluat tüplerini kapatın ve numuneleri gece boyunca liyofilize etmeden önce kapağa üç ila beş delik açmak için 20 gauge bir iğne kullanın.