JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:50 dk • April 30th, 2023
Tirozin gibi spesifik amino asit kalıntılarının fosforilasyonu, çeşitli hücresel sinyal yollarının düzenlenmesinde kritik rol oynayan fosfopeptitler üretir. Bunları incelemek, kanser tedavisi için potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanmasına izin verir.
Fosfopeptitleri izole etmek için, kanser dokusundan ekstrakte edilen liyofilize edilmiş saflaştırılmış peptit sintileri tozu ile başlayın. Düzgün bir peptit süspansiyonu hazırlamak için tozu uygun bir tampon içinde yeniden süspanse edin. Peptit stabilitesini sağlamak için nötr bir pH koruyun.
İstenen tamponda spesifik anti-fosfopeptit antikorlarına konjuge hidrojel boncuklardan oluşan bir bulamaç hazırlayın. Boncuk bulamacını peptit süspansiyonuna ekleyin. Boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilen antikorlar, fosfopeptitler içindeki spesifik fosforile amino asit kalıntılarını tanır ve bunlara bağlanarak kompleksler oluşturur.
Peletteki fosfopeptit-boncuk komplekslerini toplamak için karışımı santrifüjleyin. Bağlanmamış peptitler veya spesifik olmayan fosfopeptitler içeren süpernatanı çıkarın. Komplekslere uygun bir düşük pH elüsyon tamponu ekleyin ve inkübe edin. Düşük pH, fosfopeptit kalıntıları ile antikor-boncuk kompleksleri arasındaki etkileşimi zayıflatır ve peptitleri çözeltiye bırakır.
Karışımı önceden monte edilmiş bir filtre kartuşuna aktarın. Serbest bırakılan fosfopeptitleri toplama tüpüne atmak için santrifüjleyin. Tamponu çıkarmak ve konsantre bir kuru saf fosfopeptit peleti elde etmek için numuneyi yüksek bir sıcaklıkta vakumla konsantre edin.
Liyofilize tozu, her fraksiyonda 0.5 mililitre buz gibi soğuk immünopresipitasyon veya IP, bağlayıcı tampon ile yeniden süspanse edin. 0,5 mililitrelik yeniden süspansiyon hacmini ikinci fraksiyondan ilk fraksiyonla birlikte tüpe aktarın ve pipet ucunu saklayın. İçeriği kriyotüpe aktarmadan önce her bir liyofilizasyon tüpünü durulamak için 0,5 mililitre başka bir IP tamponu kullanın. Ardından, 2 mililitre IP tamponu kullanarak durulamayı tekrarlayın.
Mililitre başına 0.5 miligram antikor boncuk bulamacını mikrofüj tüpüne aktarmak için kesilmiş uçlu P200'ü kullandıktan sonra, 50 mikrolitre 4G10 antikor boncuk bulamacını yıkamak için 450 mikrolitre buz gibi soğuk IP bağlama tamponu ekleyin ve 25 mikrolitre 27B10.4 antikor boncuk bulamacı bir mikrofüj tüpünde. Tüpü 1 dakika boyunca 100 x g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, boncukları yeniden süspanse etmek için orijinal IP bağlama tamponu bulamacı olarak eşit bir hacim ekleyin. Vidalı kapaklı kriyotüplerde yeniden askıya alınmış numune çözeltisine önceden yıkanmış pY boncukları ekleyin. Ardından, gece boyunca uçtan uca bir döndürücü üzerinde 4 santigrat derecede inkübe edin. Boncukları döndürdükten sonra, pST peptitlerini zenginleştirmek için kullanılacak olan süpernatanı kaydedin.
Daha sonra, boncukları yeniden süspanse etmek ve bunları 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 300 mikrolitre IP bağlama tamponu kullanın. Numuneleri 100 x g ve 4 santigrat derecede 1 dakika boyunca döndürün. Daha sonra 500 mikrolitre IP bağlama tamponu ile boncukları üç kez yıkayın. Boncukları 450 mikrolitre 25 mM amonyum bikarbonat, pH 7.5 ile dört kez yıkayın. Boncuk yüzeyinin biraz altına bir jel yükleme ucu batırın ve süpernatanı tamamen aspire edin. Boncuklara %0,1 TFA'lık boncuk hacminin dört katını ekleyin.
Daha sonra iyice karıştırın ve tüpü 1.000 rpm ve 37 santigrat derecede bir termomikserde 15 dakika inkübe edin. Yeniden süspansiyonu 0,2 mikrometrelik bir spin filtreye aktarın ve filtreyi 1 dakika boyunca 850 x g'da santrifüjleyin. Elüsyonu düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktardıktan sonra, elüatı gece boyunca 300 dakikalık bir ısı süresiyle 40 santigrat derecede kuruyana kadar vakumla konsantre edin.