Fosfopeptitlerin Titanyum Dioksit Bazlı Zenginleştirilmesi: Peptit Kütüphanesinden Fosfopeptitlerin Seçici İzolasyonu İçin Bir Yöntem

Fosfopeptitler, fosforile edilmiş serin, treonin veya tirozin kalıntıları içeren kısa amino asit dizileridir. Fosfopeptitleri bir peptit karışımından izole etmek için, bir tüpte titanyum dioksit boncukları alarak başlayın. Bir su verme maddesi içeren uygun bir asitleştirilmiş bağlayıcı tampon kullanarak boncukları koşullandırmak için dengeleyin. İstenilen konsantrasyonda peptit karışımını boncuk bulamacına ekleyin.

Boncukların çökmesini önlemek için karışımı sürekli çalkalayarak inkübe edin. Asidik durum, titanyum boncuklarla koordinat bağları oluşturmak için fosfopeptitlerin fosfat grubunu teşvik eder. Tampondaki su verme maddesi, fosforile edilmemiş peptitlerin boncuklara spesifik olmayan bağlanmasını azaltır ve bunları süspansiyon içinde bırakır.

Fosforile edilmemiş peptitler süpernatantta kalırken, fosfopeptide bağlı boncukları peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Fosfopeptit bağlı boncukları önceden monte edilmiş bir spin filtre kolonuna aktarın. Bağlayıcı tamponu çıkarmak ve fosfopeptit konjuge boncukları yakalamak için santrifüjleyin.

Filtreyi temiz bir tüpe aktarın ve amonyak içeren bir çözelti ekleyin. Amonyak, süspansiyon bazini döndürür ve fosfopeptitlerin boncuklardan ayrılmasına neden olur. Bağlanmamış fosfopeptitleri elüte etmek ve toplamak için düzeneği santrifüjleyin. Titanyum dioksit boncukları filtre kartuşunda kalır. Amonyak kalıntılarını gidermek için fosfopeptitleri kurutun.

Titanyum dioksiti 500 mikrolitre% 100 ACN ile iki kez ön koşullandırın. Ardından, titanyum dioksiti 500 mikrolitre 0.2 M sodyum fosfat tamponu, pH 7 ile iki kez şartlandırın. Son olarak, boncukları üç kez yıkamak için 300 mikrolitre dengeleme tamponu kullanın. Düşük protein bağlayıcı tüpe 400 mikrolitre% 50 ACN,% 0.1 TFA ekleyin. Ardından 84 mikrolitre laktik asit ekleyin.

Yeniden süspanse edilmiş fosfopeptitleri düşük protein bağlayıcı tüpe aktarın ve 1 saat boyunca uçtan uca bir döndürücü kullanarak oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları peletledikten sonra, iki kez yıkamak ve döndürmek için 300 mikrolitre dengeleme tamponu kullanın. 300 mikrolitre durulama tamponu ile boncukları iki kez durulayın. Ardından, bunları 0,2 mikrometrelik bir döndürme filtresine aktarın.

Döndürdükten sonra, filtre ünitesini temiz 1,5 mililitrelik düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın ve 200 mikrolitre% 0,9 amonyum su ile içeriği iki kez elüte edin. PH'ı kontrol ettikten sonra, amonyağı buharlaştırmak için elüatı gece boyunca kuruyana kadar vakumla konsantre edin.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

• What is the role of phosphopeptides in a peptide mixture?
• How do titanium dioxide beads help in isolating phosphopeptides?
• What is the purpose of phosphopeptide enrichment kits in this experiment?

• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.