Genomik DNA'nın Bisülfit Dönüşümü: Gastrointestinal Kanser Dokusundan Alınan Genomik DNA Örneklerinde DNA Metilasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

DNA metilasyonu, metil-sitozin oluşturmak için DNA'nın sitozin kalıntılarına metil grubu eklenmesini içerir, bu da DNA değişikliğine ve gen ekspresyonunun düzenlenmesine neden olur.

DNA metilasyonunu incelemek için, kanserli hücrelerden ham DNA özü alarak başlayın. Bir seyreltme tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin. Tampon, karışımı seyreltir ve çift sarmallı DNA'yı tek sarmallı DNA'ya denatüre eder, bu da sonraki reaksiyonlar için bazların erişilebilirliğini destekler.

Bir dönüşüm reaktifi ekleyin ve karanlıkta inkübe edin. Reaktifteki sodyum bisülfit, metillenmemiş sitozin kalıntılarının sülfonasyonunu ve ardından deaminasyonunu tetikleyerek urasil-sülfonat oluşumuna neden olur. Bununla birlikte, metillenmiş sitozin kalıntıları değişmeden kalır.

Daha sonra, DNA'yı bir bağlayıcı tampon ile destekleyin ve önceden monte edilmiş bir spin filtre kolonuna aktarın. Tampon, DNA'nın filtreye bağlanmasına yardımcı olur.

Tampon ve bisülfit reaktif karışımını kolonda sıkışmış DNA'dan çıkarmak için santrifüjleyin. Akışı atın. DNA'ya bir alkalin desülfonasyon tamponu ekleyin. Tampon, urasil oluşturmak için urasil-sülfonattan sülfit grubunun uzaklaştırılmasına yardımcı olur.

Kullanılmış tamponu çıkarmak için santrifüjleyin. Şimdi, dönüştürülen DNA'yı elüte etmek için sütuna bir elüsyon tamponu ekleyin. DNA'yı çoğaltmak için PCR gerçekleştirin. Dönüştürülen tüm urasil kalıntıları timin olarak çoğalırken, metillenmiş sitozin kalıntıları sitozinler olarak çoğalır.

Numunenin bir metilasyon profilini oluşturmak için amplifiye edilmiş DNA'nın sitozin kalıntılarını sıralayın.

Bisülfit işlemini, üreticinin talimatlarına göre bir bisülfit dönüştürme kiti kullanarak sindirilmiş dokunun 45 mikrolitresi üzerinde gerçekleştirin. Numuneye 5 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Bu arada, bir tüp CT dönüştürme reaktifine 750 mikrolitre damıtılmış su ve 210 mikrolitre seyreltme tamponu ekleyerek bisülfit dönüşüm reaktifini hazırlayın. Tüpleri 10 dakika vorteksleyerek karıştırın. Daha sonra, hazırlanan CT dönüşüm reaktifinden 100 mikrolitre her numuneye ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.

Numuneleri karanlıkta 50 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 400 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin ve her bir numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her numuneyi bir döndürme sütununa yükleyin ve sütunu 2 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirin. Numuneleri 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin ve akışı atın. Her sütuna 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca tam hızda döndürün, ardından akışı atın.

Her kolona 200 mikrolitre desülfonasyon tamponu ekleyin ve kolonların oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. İnkübasyondan sonra, sütunları 1 dakika boyunca tam hızda döndürün ve akışı atın. Kolonu 200 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra tam hızda 1 dakika santrifüjleyin.

Her sütuna 46 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve yeni bir steril 1,5 mililitrelik tek kullanımlık polipropilen tüpe yerleştirin. DNA'yı çıkarmak ve sütunu atmak için tüpleri 2 dakika döndürün. DNA artık analiz için hazırdır. Her gen analizinde promotör bölgenin metilasyonunu değerlendirmek için kantitatif metilasyona özgü PCR için bir şablon olarak bisülfit modifiye DNA'yı kullanın. Reaktifleri metin el yazmasında açıklandığı gibi birleştirin ve termal döngü protokolünü çalıştırmak için 96 oyuklu gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanın.