JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:00 dk. • April 30th, 2023
Elastik lif boyama, peritoneal elastik lamina veya sub-mezotelyal elastik dokunun ötesinde kanser hücresi istilasını incelemeye yardımcı olur.
Başlamak için, işlenmiş bir doku bölümüne potasyum permanganat çözeltisi ekleyin, ardından oksalik aside daldırın. Potasyum permanganat-oksalik asit kombinasyonunun güçlü oksitleyici özelliği, elastik lif morfolojisini gizleyerek boyama işlemine müdahaleyi önlemek için doku bölümündeki doğal pigmenti ağartır.
Kalan ağartma maddesini çıkarmak için slaytı su ve etanol ile durulayın. Daha sonra, numuneyi bir demir-hematoksilen kompleksi içeren bir elastin boyasında inkübe edin. Ana elastik lif bileşeni olan Elastin, demir-hematoksilen kompleksleri için güçlü bir afiniteye sahiptir.
Kalan lekeyi çıkarmak için slaytı etanol ve suyla yıkayın. Son olarak, numuneye pikrik asit ve Ponceau S içeren bir karşı boya uygulayın. Daha küçük pikrik asit molekülleri tüm doku tiplerine nüfuz eder, ancak yakın dokulu kas ve kanser hücreleri tarafından sıkıca tutulur. Buna karşılık, daha büyük Ponceau S molekülleri, gözenekli dokulu kollajendeki pikrik asidin yerini alarak kollajenin kas ve kanser hücrelerinden farklı şekilde lekelenmesine neden olur.
Mikroskop altında incelendiğinde, elastik lifler mavi-siyah filamentler olarak görünür. Kollajen kırmızıya boyanırken, kas ve kanser hücreleri sarı görünür. Mavi-siyah elastik laminaya nüfuz eden sarı kanser hücreleri metastatik istilayı doğrular.
İlk olarak, slayttaki veya dokunun etrafındaki fazla solüsyonu silmek için kağıt mendil kullanın. Slaytları oda sıcaklığına ve neme uygun koşullara yerleştirin. Oksitlemek için her slayta birkaç damla potasyum permanganat ekleyin, eklenen hacmin her slayttaki doku bölümünü kaplamak için yeterli olduğundan emin olun. 5 dakika sonra, oksitlenmiş slaytları Coplin kavanozlarında damıtılmış suyla durulayın, durulamayı iki ila üç kez tekrarlayın ve her durulama için yeni bir kavanoz su kullanın. Doku gözlemlenebilir bir kahverengi renge sahip olmalıdır.
Şimdi, onları ağartmak için her slayta birkaç damla oksalik asit ekleyin ve eklenen hacmin her slayttaki doku bölümünü kaplamak için yeterli olduğundan emin olun. 5 dakika sonra, çamaşır suyu slaytlarını damıtılmış suyla durulayın, durulamayı iki ila üç kez tekrarlayın ve her durulama için yeni bir kavanoz su kullanın. Slaytları kısaca% 95 alkolle yıkayın.
Yıkanan slaytları 8 ila 24 saat boyunca elastin çözeltisine batırın. Ardından, her doku bölümünü iyi bir şekilde ayırt etmek için slaytları 1 ila 2 dakika boyunca doğrudan% 95 etanole batırın. Slaytları tamamen damıtılmış suyla durulayın.
Mavi-siyah elastik liflerin lekelenmesini ve gri arka planı mikroskobik olarak kontrol edin. Dokuyu biraz daha az ayırt etmek daha iyidir, çünkü sonraki Van Gieson'ın karşı boyası da elastik lekeyi bir şekilde çıkarabilir.
Slaytları bir Van Gieson solüsyonunda 1 dakika boyunca lekeleyin ve kullanılan hacmin her slayttaki doku bölümünü tamamen kaplamak için yeterli olduğundan emin olun. Ardından, her bir doku bölümünü iyi bir şekilde ayırt etmek için doku dilimlerine birkaç saniye boyunca hızla% 95 etanol damlatın.