JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:20 dk. • April 30th, 2023
Sferoidler, üç boyutlu küresel yapılar oluşturmak için kendi kendine bir araya getirilmiş hücrelerin in vitro kültürleridir. Tümör sferoidlerini çoğaltmak için, bir kültür plakasında bulunan uygun bir hücre dışı matris veya ECM içinde kültürlenmiş sferoidlerle başlayın.
ECM'yi mekanik olarak kırmak ve sferoidleri gevşetmek için bir mikropipet kullanarak eziyet edin. Sferoid-ECM karışımını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Sferoidleri peletlemek ve bunları süpernatanttaki ECM'den ayırmak için düşük hızda santrifüjleyin. Kullanılmış ECM içeren süpernatanı atın. Sonraki adımlarda ECM'nin katılaşmasını önlemek için küresel peleti içeren tüpü buz üzerine aktarın.
Peleti taze sıvılaştırılmış ECM ile destekleyin. Alt kültürleme için, sferoid hücreleri ayırmak ve süspansiyona bırakmak için içeriği tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Sferoid oluşturan hücreler ve ECM içeren bu karışımı taze bir kültür kabına tohumlayın. ECM katılaşarak tümör hücrelerinin sıkışmasını sağlar. İstenilen büyüme ortamını ekleyin. Sıkışmış hücrelerin yeni sferoidlere büyümesini kolaylaştırmak için kuluçkaya yatırın.
Nakliye amacıyla, sferoid-ECM karışımını bir kültür şişesine aktarın. ECM'nin katılaşmasına ve içindeki sferoidleri hapsetmesine izin verin.
Hücre kesilmesini önlemek ve sferoidlerin canlılığını korumak için şişeyi büyüme ortamı ile doldurun. Şişeyi bir nakliye paketine aktarın.
ECM'yi bir P1000 pipeti ile mekanik olarak kırın ve steril 1,5 milimetrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 4 santigrat derecede 1.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, tüm süpernatanı çıkarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Pelete yeni ECM hacminin iki ila dört katını ekleyin ve tüpün içindekileri 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin.
SBNET karışımındaki ECM'nin 5 ila 20 mikrolitresini yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın ve ECM'nin katılaşmasına izin verin. Ardından, katılaşmış ECM'yi yeni SBNET ortamı ile örtün ve plakayı inkübatöre koyun. SBNET sferoidlerini başka bir laboratuvara gönderiyorsanız, yeni ECM ile sferoidleri bir T25 şişesine aktarın ve ECM'nin katılaşmasına izin verin. Şişeyi SBNET küresel ortamla doldurun, kapağı sıkıca vidalayın ve nakliye paketini hazırlayın.