Peritoneal Düşük Yoğunluklu Nötrofil İzolasyonu: Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Peritoneal Lavaj Sıvısından Düşük Yoğunluklu Nötrofiller Elde Etme Tekniği

Düşük yoğunluklu nötrofiller veya LDN'ler, gastrointestinal kanser gibi patolojik durumlar sırasında yüksek sayılarda bulunan farklı bir nötrofil alt popülasyonudur. LDN'ler hastaların periton boşluğu yıkamalarından veya lavaj sıvısından izole edilebilir.

İlk olarak, doku kalıntılarını gidermek için lavaj sıvısını filtreleyin. LDN'ler de dahil olmak üzere kan hücreleri içeren bir pelet elde etmek için süzüntüyü santrifüjleyin. Uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Bu süspansiyonu, LDN izolasyonu için en uygun olan uygun bir yoğunluk gradyan ortamının üzerine katmanlayın.

Farklı kan bileşenlerini nispi yoğunluklarına göre ayırmak için santrifüjleyin. Daha yoğun RBC'ler alt katmanı oluştururken, en az yoğun plazma fraksiyonu en üst katmanı oluşturur. Daha az yoğun LDN'ler, diğer mononükleer hücrelerle birlikte ara tabakayı işgal eder.

Ara katmanı, bir bloke edici reaktif içeren yeni bir tüpe aktarın. Reaktif bileşenleri, hedef olmayan tüm hücrelerin yüzeylerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke eder ve sonraki etiketleme sırasında LDN için özgüllüğü arttırır.

LDN'lerde aşırı eksprese edilen spesifik bir hücre yüzeyi molekülünü hedefleyen antikor konjuge mikro boncuklar ekleyin. Antikor-boncuk komplekslerinin LDN'ler üzerindeki hedef moleküllerine bağlanması için inkübe edin.

İnkübe edilmiş süspansiyonu manyetik bir alana yerleştirilmiş bir sütundan geçirin. Manyetik etki altında, etiketlenmemiş hücreler geçerken tüm LDN-mikroboncuk kompleksleri kolon duvarına yapışır.

Sütunu kaldırın. LDN içeren fraksiyonu elüte etmek ve toplamak için içeriği uygun bir tampon kullanarak yıkayın.

Nötrofilleri elde etmek için, önce, yara kapanmadan hemen önce 1 litre normal steril salini, gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçirmiş bir hastanın karın boşluğuna doğrudan infüze edin ve karın boşluğunu en az 1 dakika boyunca yoğun bir şekilde lavaj yapın. Daha sonra, tuzlu suyu boşluk içinde karıştırın ve dört adet 50 mililitrelik şırınga ile 200 mililitre lavaj sıvısını geri kazanın.

Laboratuvarda, periton lavaj sıvısını 100 mikrometrelik bir naylon filtreden santrifüjleme için ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere aktarın. Peletleri% 0.02 EDTA ile desteklenmiş 5 mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve her hücre süspansiyonunu dikkatlice 3 mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine yerleştirin. Yoğunluk gradyanı ayrımından sonra, her tüpten 2 ila 3 mililitre ara tabaka hasat edin ve periton sıvısı örneklerini tüp başına 10 mililitre taze PBS artı EDTA ile yıkayın. Ek bir yıkama için peletleri 10 mililitre taze PBS artı EDTA'ya dökün ve hücreleri, 60 mikrometre manyetik aktif hücre sıralama veya MACS, tampon konsantrasyonu başına 1 kez 10 ila yedinci hücreye seyreltin.

4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 20 mikrolitre Fc bloğu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke edin, ardından 20 mikrolitre anti-CD66b manyetik boncuk ekleyin. 4 santigrat derecede 10 dakika sonra, hücreleri 500 mikrolitre MACS tamponunda yıkayın ve yeniden süspanse edin ve hücreleri uygun bir manyetik ayırıcının manyetik alanı içinde uygun boyutta bir manyetik sütuna ekleyin. Tüm CD66b negatif hücreleri kolondan geçtiğinde, kolon rezervuarına 15 mililitre taze MACS tamponu ekleyin ve kolonu manyetik ayırıcıdan yeni bir konik tüpe aktarın. Ardından, manyetik olarak etiketlenmiş CD66b pozitifini tüpe akıtmak için sütunu hemen daldırın.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.