JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:15 dk. • April 30th, 2023
Kanser gibi patolojik koşullar altında, aktive edilmiş nötrofiller, dolaşımdaki kanser hücrelerini yakalayan nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'leri (ilişkili enzimler ve antimikrobiyal proteinlerle birlikte bir hücre dışı DNA ağı) serbest bırakır.
NET'ler ve tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimi in vitro olarak görselleştirmek için, bir nötrofil alt tipi olan düşük yoğunluklu nötrofilleri, hücre bağlanmasını destekleyen polimer kaplı bir kültür kabında kültürleyerek başlayın. Nötrofilleri ağ benzeri NET'ler oluşturmak üzere uyarmak için birkaç saat inkübe edin.
Nötrofil kültürüne kırmızı floresein etiketli kanser hücrelerinin bir süspansiyonunu ekleyin. Kanser hücresi-NET etkileşimini kolaylaştırmak için kanser hücrelerini kısa bir süre için NET'lerle inkübe edin. NET-DNA, kanser hücrelerini çeken ve NET'lere yapışmalarını destekleyen kemotaktik bir faktör olarak işlev görür.
Harcanan ortamı çıkarın. Bağlanmamış tümör hücrelerini kültür kuyucuğundan çıkarmak için kültürü uygun bir taze ortamla nazikçe yıkayın.
Şimdi, hücre dışı NET'leri seçici olarak renklendirmek için zar geçirimsiz bir yeşil floresan nükleer leke ekleyin. Kültürü bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Nötrofil hücre dışı tuzaklar, kırmızı tümör hücrelerinin bağlandığı bir ağ oluşturan yeşil sicim benzeri yapılar olarak görünür.
İzole edilmiş düşük yoğunluklu nötrofilleri, FBS konsantrasyonu ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamının mililitresi başına 5 kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu poli-L-lizin kaplı bir plaka üzerinde oyuk başına 1 mililitre nötrofil tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 2 saat sonra, her bir oyuktaki hücreleri, üreticinin talimatlarına göre uygun bir floresan membran geçirimsiz nükleer ve kromozomal boya ile boyayın ve hemen floresan mikroskobu ile NET'lerin morfolojisini gözlemleyin.
Tümör hücresinin NET'lere yapışmasını değerlendirmek için,% 0.1 sığır serum albümin konsantrasyonu ile desteklenmiş RPMI 1640'ın mililitresi başına 1 kez 10 ila altıda 1 kez zıt bir floresan boya ile boyanmış mide tümörü hücrelerini yeniden askıya alın ve düşük yoğunluklu nötrofil kültürlerinin her bir oyuğuna 1 mililitre tümör hücresi ekleyin. 37 santigrat derecede 5 dakika sonra, süpernatanı her bir kuyucuktan çıkarın ve hücreleri, yıkama başına BSA ile desteklenmiş 2 mililitre önceden ısıtılmış RPMI 1640 ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın.
NET'e özgü bağlamayı algılamak için 5 dakikalık bir inkübasyon yeterlidir. Sıcak ortamı her bir kuyucuğun yanına yavaşça ekleyin, plakayı hafifçe döndürün ve süpernatanı bir aspiratör ile çıkarın.
NET'ler ve bağlı tümör hücreleri daha sonra floresan mikroskobu ile gözlemlenebilir.