JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:05 dk • April 30th, 2023
Kanser gibi patolojik durumlar sırasında, aktive edilmiş nötrofiller, histonlar ve proteolitik enzimlerle ilişkili hücre dışı DNA liflerinden oluşan bir ağ olan nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'leri serbest bırakır. Bu yapılar kanser hücrelerini hapseder ve kanser metastazında kilit rol oynar.
NET'lerde sıkışan kanser hücrelerinin yapışma sonrası davranışını in vitro olarak incelemek için, önce düşük yoğunluklu nötrofilleri - bir nötrofil alt popülasyonu - hücre bağlanmasını kolaylaştıran polimer kaplı bir kültür kabında kültürleyin. Ağ benzeri NET'leri serbest bırakmak için nötrofilleri aktive etmek için kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, özellikle NET'lerdeki DNA liflerini boyamak için zar geçirimsiz yeşil bir floresan nükleer boya ekleyin. Harcanan ortamı çıkarın. Nötrofil kültürüne bir kanser hücresi süspansiyonu ekleyin.
Kanser hücresi-NET etkileşimini kolaylaştırmak için kültürü kısa bir süre inkübe edin. NET'lerin DNA bileşeni, kanser hücrelerinin göçünü uyaran ve NET'lere yapışmalarına yardımcı olan kemotaktik bir faktör olarak işlev görür.
Harcanan ortamı çıkarın. Kültür kabından bağlanmamış kanser hücrelerini çıkarmak için kültürü uygun taze ortamla nazikçe durulayın. Taze serum içeren bir ortamla doldurun.
NET'ler ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimli olayları analiz etmek için hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak kültürü uzun süre görüntüleyin. Zamanla, NET'ler kanser hücrelerinin çoğalmasını kolaylaştıran uygun bir mikro ortam sağlar. Yeşil floresan NET'lerde kanser hücrelerinin çoğalmasını gözlemlemek için uygun yazılımı kullanın.
Peritoneal düşük yoğunluklu nötrofilleri gösterildiği gibi 35 milimetrelik bir tabakta, poli-L-lizin kaplı bir tabakta kültürleyin ve boyayın, ardından 2 mililitre% 0.1 BSA artı RPMI 1640'ta kısa bir yıkama yapın.
Ortamı, oda sıcaklığında 5 dakikalık bir inkübasyon için BSA ile desteklenmiş 2 mililitre RPMI içinde süspanse edilen altıncı boyanmamış mide tümörü hücresine 1 kez 10 ile değiştirin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca BSA ile takviye edilmiş 2 mililitre taze RPMI'de durulayın, ardından bağlanmamış tümör hücrelerini çıkarmak için hafifçe döndürün.
Daha sonra, süpernatanı FBS ve antibiyotiklerle desteklenmiş DMEM ile değiştirin ve NET'ler tarafından tümör hücresi sıkışmasının hızlandırılmış analizi için çanağı tam görünümlü bir hücre gözlem sistemine monte edin.